Введение
Несмотря на появление новых методов лечения глиобластомы, повышение эффективности противоопухолевой лекарственной терапии этой высокозлокачественной опухоли остается актуальной проблемой. Вероятно, в силу ограниченного проникновения большинства цитостатиков через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) список противоопухолевых препаратов, рекомендованных при лечении глиобластомы, невелик: в него входят прежде всего темозоломид и ломустин в виде монотерапии или в комбинации с винкристином и прокарбазином, а также (при рецидивах) другие производные нитрозомочевины (нимустин, фотемустин), производные платины (карбоплатин, цисплатин), бевацизумаб и/или иринотекан [1]. Наряду с исследованиями, направленными на выявление новых молекулярных мишеней и синтез новых активных молекул, перспективным представляется также поиск путей повышения эффективности «классических» цитостатиков в отношении глиобластом. Так, не ослабевает интерес к доксорубицину (в том числе к его липосомальной форме), о чем свидетельствует ряд проводимых и недавно завершенных клинических исследований этого препарата у пациентов с глиобластомой. Доксорубицин — противоопухолевый препарат широкого спектра действия, потенциально активный в отношении глиобластомы [2]. Однако доксорубицин является субстратом Р-гликопротеина (P-gp) — одного из наиболее важных эффлюксных механизмов ГЭБ, его концентрации в интракраниальных опухолях при внутривенном введении (в/в) не достигают терапевтического уровня [3]. Соответственно, большинство исследований направлено на создание систем доставки (в том числе липосом и наночастиц), которые могли бы преодолевать ГЭБ и доставлять доксорубицин в мозг [4, 5].
Альтернативным направлением может быть использование фармакологических подходов, таких как, например, использование доноров оксида азота (NO). NO — сигнальная молекула, участвующая во многих биологических процессах, протекающих как в здоровых тканях (сосудистые и иммунные реакции), так и в злокачественных опухолях; в частности, NO оказывает дозозависимое действие на пролиферацию, апоптоз, а также на инвазивность опухолевых клеток [6]. Известно также, что благодаря способности ингибировать действие P-gp доноры NO, с одной стороны, повышают эффективность цитостатиков-субстратов P-gp в отношении опухолей с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), обусловленной гиперэкспрессией этого транспортера [7], а с другой стороны, могут способствовать их транспорту через ГЭБ. Помимо ингибирования P-gp в повышении проницаемости ГЭБ под воздействием доноров NO участвуют также и другие механизмы, в том числе активация циклического гуанозинмонофосфата (cGMP), от которой зависит проницаемость церебрального эндотелия [8].
Проведенные нами ранее эксперименты показали, что донор NO нитроглицерин потенцирует противоопухолевый эффект доксорубицина при терапии экспериментальной глиобластомы крысы 101/8 [9], схожей по своим гистологическим характеристикам с глиобластомой человека [10].
Цель исследования — оценить влияние широко применяемого в клинике донора NO изосорбида динитрата (ИД) на эффективность доксорубицина в отношении экспериментальной глиобластомы крысы 101/8 (тканевый штамм), схожей по своим гистологическим характеристикам с глиобластомой человека.
Материал и методы
Исследование проводили в соответствии с Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.10 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»), Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2013) [11].
В опытах использовали самцов крыс Вистар (86 голов, 150—250 г) разведения питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства».
Соблюдение этических норм. Все процедуры, выполненные в исследованиях с использованием животных, соответствовали этическим стандартам учреждений, в которых проводились исследования, и утвержденным правовым актам РФ и международных организаций.
Интракраниальная имплантация глиомы 101/8. Имплантацию глиомы 101/8 в мозг крысы проводили криоконсервированной измельченной опухолевой тканью (ориентировочно 106 клеток, коллекция ФГБНУ «НИИМЧ им. акад. А.П. Авцына») под золетиловым наркозом [10]. Для этого зубоврачебным бором диаметром 2 мм в правой теменной кости черепа крысы на расстоянии 2 мм от сагиттального шва и 2 мм каудально от венечного шва делали отверстие диаметром 2 мм. С помощью троакара диаметром 1,8 мм ткань опухоли вводили на глубину 4 мм от поверхности кости в область хвостатого тела. При проявлении клинических признаков опухолевого процесса (через 12—14 дней) крысу погружали в наркоз и немедленно извлекали мозг. Выделенную из мозга опухоль измельчали скальпелем и вводили в мозг экспериментальных животных по вышеописанной методике.
Химиотерапия. Экспериментальные животные с имплантированной опухолью случайным образом распределены на группы и получали следующие препараты: 1) контрольная группа (n=23) — животные с имплантированной опухолью, не получавшие лечения; 2) доксорубицин субстанция (n=21, группа Докс, животные, получавшие доксорубицин, «Yick-Vick Chemicals and Pharmaceuticals», Гонконг, Китай); 3) ИД (n=15, группа ИД (п/о), животные, получавшие препарат с действующим веществом изосорбида динитрат «Изокет» («Jenahexal Pharma», Германия); 4) доксорубицин в комбинации с ИД (n=18, животные, получавшие Докс + ИД (п/о), перорально — п/о); 5) доксорубицин в комбинации с ИД (n=9, животные, получавшие Докс + ИД (в/в), внутривенно — в/в). Доксорубицин вводили в/в в дозе 1,5 мг на 1 кг массы тела на 2-е, 5-е и 8-е сутки после трансплантации опухоли. Водный раствор ИД вводили п/о с помощью внутрижелудочного зонда или в/в в дозе 0,5 мг на 1 кг массы тела непосредственно перед введением доксорубицина. В каждой группе животные поделены случайным образом на 2 подгруппы: одну из них использовали для определения продолжительности жизни (срок наблюдения 100 дней), другую — для морфометрии размеров опухоли на 14-е сутки после имплантации. Животных, погибших от сторонних причин, исключали из эксперимента.
Эффективность лечения оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %) по отношению к нелеченым животным группы контроля и объему интрацеребральной опухоли на 14-е сутки после имплантации опухоли.
Гистологическое исследование. Объем опухоли на 14-е сутки после имплантации оценивали методом 3D-реконструкции опухоли по гистологическим срезам [12]. Животных подвергали эвтаназии (передозировкой золетилового наркоза), головной мозг извлекали, фиксировали в забуференном формалине не менее 48 ч, готовили парафиновые срезы толщиной 7 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином (ГЭ). Объем интрацеребральной опухоли определяли, используя морфометрическую программу Image-Pro Premiere, «Media Cybernetics», США. Для формирования 3D-изображения опухоли вначале определяли площадь опухоли на серийных ступенчатых фронтальных срезах мозга (шаг 105 мкм) [12]. На основании усредненных данных объема опухолей рассчитывали индекс торможения роста опухоли (ТРО) следующим образом:
TPO%=100×(Vконтроля–Vопыта)/Vконтроля.
Оценка уровня экспрессии гена ABCB1b. Для оценки уровня экспрессии гена ABCB1b в глиобластоме 101/8 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) опухоли нелеченых животных (n=6) выделяли на 14-е сутки после имплантации. Навеску ткани (50 мг) гомогенизировали и выделяли тотальную РНК при помощи TRI-Reagent («MRC», США). В качестве контроля использовали здоровую ткань corpus striatum (полосатое тело) интактных животных (n=6). Выделение мРНК проводили при помощи TRI-Reagent («MRC», США). Синтез кДНК проводили, используя набор MMLV RT Kit (ЗАО «Евроген», Россия). Оценку уровня экспрессии гена ABCB1b проводили методом ПЦР-РВ на приборе CFX96 («Bio-Rad Laboratories», США), используя набор реагентов «ПЦР-комлект» R-402 (ООО «НПФ Синтол», Россия) и праймеры F:TCCACCATCCAGAACGCAG, R:GCACCTCAAATACTCCCAGCTC (ЗАО «Евроген», Россия). Все процедуры выполняли согласно протоколам, прилагаемым к наборам реагентов. Результаты представлены как соотношение экспрессии гена ABCB1b в опухоли к экспрессии гена в нормальной ткани с использованием «генов домашнего хозяйства» GAPDH, GUSB, HPRT для выравнивания.
Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Sigma-stat. Статистическую значимость различий между группами определяли, используя непараметрический критерий Манна—Уитни.
Результаты
Интрацеребральная опухоль обнаружена при вскрытии у всех животных контрольной и экспериментальных групп. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) крыс контрольной группы составляла 13 сут (табл. 1). Внутривенное введение доксорубицина приводило к УПЖ животных по сравнению с контролем на 57%; СПЖ в этой группе составляла 21 сут. Введение ИД п/о также приводило к увеличению продолжительности жизни; при этом как СПЖ (19 сут), так и УПЖ (41%) у животных, получавших ИД, незначительно отличались от показателей у животных, получавших доксорубицин. Показатели в обеих группах статистически значимо отличались от показателей в контрольной группе.
Таблица 1. Продолжительность жизни крыс с глиобластомой 101/8 после лечения доксорубицином в качестве монотерапии или в комбинации с изосорбида динитратом
| Группа | n | Продолжительность жизни животных с опухолью (сут) | Статистическая значимость различий (по отношению к контролю), р | |||
| Min/Max | М±SD | Me | УПЖ, %* | |||
| Контрольная | 13 | 9/21 | 13±3 | 13 | — | — |
| Докс | 10 | 13/38 | 21±7 | 18 | 57 | <0,001 |
| ИД (п/о) | 9 | 13/30 | 19±6 | 18 | 41 | 0,007 |
| Докс + ИД (п/о) | 9 | 23/50 | 34±11 | 30 | 155 | <0,001 |
| Докс + ИД (в/в) | 9 | 18/46 | 28±9 | 25 | 112 | <0,001 |
Примечание. * — по отношению к контролю; УПЖ — увеличение продолжительности жизни; ИД —изосорбида динитрат.
Одновременное применение доксорубицина и ИД, введенного п/о, значительно повышало эффективность терапии: УПЖ животных в этой группе составило 155% по сравнению с показателем у животных контрольной группы, а СПЖ — 34 сут. Комбинация доксорубицина с ИД, введенным в/в, оказалась несколько менее эффективна (СПЖ = 28 сут; УПЖ = 112%), однако и в этом случае показатели продолжительности жизни были значительно выше, чем у животных, получавших монотерапию. Различия между группами Докс + ИД (п/о) и Докс + ИД (в/в) статистически незначимые.
При сравнении выживаемости по кривым Каплана—Мейера (рис. 1) также выявлено преимущество комбинации Докс + ИД (п/о) по сравнению с монотерапией этими препаратами.
Рис. 1. Выживаемость крыс с глиобластомой 101/8 (кривая Каплана—Мейера) в отсутствие лечения (1), после применения доксорубицина (2), изосорбида динитрата (3), комбинации доксорубицина с изосорбида динитратом при пероральном (4) и внутривенном (5) введении изосорбида динитрата.
Анализ результатов гистологического исследования, проведенного на 14-е сутки после имплантации, показал, что, несмотря на значительные вариации размеров опухолей внутри групп, средний объем опухолей при комбинированном действии доксорубицина и ИД был приблизительно в 2,5 раза меньше, чем при применении доксорубицина в качестве монотерапии, различия между группами статистически значимые (табл. 2). Размеры опухолей при применении только ИД (группа ИД) не отличались от контроля.
Таблица 2. Cредний объем опухоли (мм3) через 6 сут после окончания лечения (на 14-е сутки после имплантации опухоли)
| Группа | n | Объем опухоли, мм3 | Статистическая значимость различий, р* | ТРО, %* | ||
| M±SD | Me | Min/Max | ||||
| Контроль | 10 | 68±54 | 96 | <1/115 | — | — |
| Докс | 11 | 16±12 | 13 | <1/35 | <0,05 | 77 |
| ИД (п/о) | 6 | 69±48 | 80 | 0/140 | 0,97 | ≈0 |
| Докс + ИД (п/о) | 9 | 8±6 | 5 | 0/16 | 0,044 | 88 |
Примечание. * — по отношению к контролю; ТРО — торможение роста опухоли; ИД —изосорбида динитрат.
Аналогичные различия между группами выявлены и при оценке распределения опухолей по размерам (рис. 2). У животных контрольной группы и группы ИД преобладали опухоли объемом более 20 мм3; при этом объем некоторых опухолей достигал 100 мм3 и более. У животных группы Докс доля крупных опухолей была ниже; соответственно, возросла доля опухолей объемом 10—20 мм3. У животных группы Докс + ИД (п/о) опухоли объемом более 20 мм3 отсутствовали и более 50% опухолей имели размер менее 5 мм3. В этой группе отмечены также микроопухоли (менее 1 мм3), точный объем которых данным методом определить невозможно. У единичных животных опухоль отсутствовала.
Распределение образцов по группам и рисункам
| Группа | Распределение образцов по группам и рисункам, рис. | |||||
| Контрольная | 2, а | 2, б | 2, в | 2, г | 2, д | 2, е |
| Докс | 2, ж | 2, з | 2, и | 2, к | 2, л | 2, м |
| ИД | 2, н | 2, о | 2, п | 2, р | 2, с | 2, т |
| Докс + ИД (п/о) | 2, у | 2, ф | 2, х | 2, ц | 2, ч | 2, ш |
Рис. 2. Фронтальные срезы мозга крыс с глиобластомой 101/8 после химиотерапии на 14-е сутки после имплантации.
Окраска гематоксилином и эозином; срезы отобраны по максимальной площади опухоли на срезе.
Для косвенной оценки экспрессии P-gp в глиобластоме 101/8 оценивали экспрессию гена P-gp ABCB1b [13]. Как показали результаты полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, уровни экспрессии гена ABCB1b в ткани опухоли на 14-е сутки после имплантации и в интактном мозге практически не различались: значения уровня экспрессии составляли 1,40±0,75 и 1,45±0,25 соответственно.
Обсуждение
Как показали результаты исследования, противоопухолевый эффект доксорубицина в отношении глиобластомы 101/8 существенно увеличивается при его сочетании с ИД, введенным п/о: в группе Докс + ИД (п/о) по сравнению с группой Докс вырос показатель УПЖ (155% и 57% соответственно) и отмечено некоторое уменьшение размеров опухолей (показатель ТРО составил 88% и 77% соответственно). Аналогичные результаты получены нами при проведении комбинированной терапии глиобластомы 101/8 доксорубицином и нитроглицерином, который применяли в виде масляного раствора (Nitrolingual forte, «Pohl Boscamp», Германия), нанесенного на кожу животных (СПЖ 36 сут, УПЖ 176%) [9]. Противоопухолевый эффект комбинации доксорубицина с ИД, введенным в/в, оказался несколько ниже (СПЖ 28 сут, УПЖ 113%).
Известно, что доноры оксида азота обладают собственной противоопухолевой активностью, в том числе усиливают апоптоз опухолевых клеток, оказывают антиангиогенный эффект и проч. [14]. Однако в нашем исследовании монотерапия ИД хотя и приводила к увеличению продолжительности жизни (у животных, получавших ИД и доксорубицин, значения УПЖ — 41% и 57% соответственно — статистически значимо не различались), но в отличие от доксорубицина, по-видимому, не оказывала прямого противоопухолевого действия (ТРО составляло 77% и 0% соответственно). Аналогичная тенденция наблюдалась ранее и в случае применения нитроглицерина (группа НГ): по показателю УПЖ нитроглицерин даже превосходил доксорубицин (130% и 46% соответственно), тогда как по показателю ТРО наблюдалась обратная картина: у животных группы Докс ТРО составляло 75%, а группы НГ — всего 16% [9]. Можно предположить, что увеличение продолжительности жизни у животных, получавших нитраты, вызвано улучшением церебральной гемодинамики, которая нарушается в условиях роста опухоли. Действительно, хотя влияние доноров оксида азота на мозговое кровообращение неоднозначно, имеются данные об их положительном влиянии на церебральный эндотелий в условиях гипоксии и ишемии [15]. Противоопухолевый эффект монотерапии доксорубицином в отношении глиобластомы 101/8, наблюдавшийся в данном эксперименте и в предыдущих исследованиях [16, 17], по-видимому, объясняется частичным нарушением ГЭБ в центральной части опухоли, в результате чего препарат получает доступ к опухолевым клеткам.
Потенцирующее действие донора NO на цитотоксический эффект доксорубицина наблюдали также и другие авторы [18, 19]. Механизм этого феномена до конца не изучен. Полагают, что повышение активности доксорубицина на фоне доноров NO может быть обусловлено усилением как нитрозативного, так и окислительного стресса в результате образования пероксинитрита — продукта взаимодействия супероксида, образующегося в митохондриях под действием доксорубицина и NO.
Как известно, доноры NO могут ингибировать действие P-gp, что, в свою очередь, может усилить интернализацию доксорубицина в клетки, экспрессирующие P-gp, то есть в клетки опухолей с множественной лекарственной устойчивостью или в клетки церебрального эндотелия, формирующего ГЭБ. Как показали приведенные выше результаты, гиперэкспрессия P-gp в клетках глиобластомы 101/8 не обнаружена. В то же время весьма вероятно, что, повышая проницаемость ГЭБ, ИД облегчает доступ доксорубицина в зону инфильтративного роста глиобластомы, где ГЭБ еще сохраняет свои функции.
Выводы
Донор оксида азота изосорбида динитрат потенцирует противоопухолевый эффект доксорубицина в отношении интракраниально имплантированной глиобластомы 101/8 у крыс, что может объясняться как повышением цитотоксичности доксорубицина, так и повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера в результате действия экзогенного оксида азота. Монотерапия изосорбида динитратом не приводит к торможению роста опухоли, однако повышает продолжительность жизни животных.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Гельперина С.Э., Павлова Г.В., Халанский А.С.
Сбор и обработка материала — Алексеева А.И., Федосеева В.В., Дрозд С.Ф., Куделькина В.В.
Статистический анализ данных — Алексеева А.И.
Написание текста — Алексеева А.И., Халанский А.С., Косырева А.М.
Редактирование — Гельперина С.Э.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №19-515-06008).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Комментарий
Работа посвящена актуальной на сегодняшний момент теме доклинических исследований и рассказывает о потенцирующем противоопухолевом действии доксорубицина и изосорбида динитрата на экспериментальных моделях глиобластомы. Подобные экспериментальные работы с биологической направленностью способствуют информированию нейрохирургов и смежных специалистов об эффективности применения лекарственных средств и их комбинаций, что, несомненно, повышает интерес к доклиническим исследованиям, приближающим внедрение новых методов лечения опухолей в рутинную практику.
М.В. Рыжова (Москва)