Введение
Решение ряда актуальных проблем нейроонкологии представляется возможным с использованием оптико-спектральных методов. В первую очередь речь идет об интраоперационной демаркации границ опухоли. Кроме того, немаловажно дифференцировать опухоль во время операции по типам. Методы интраоперационной диагностики, используемые в настоящее время в нейрохирургии, в основном являются качественными, а не количественными (например, видеофлуоресценция или ультразвуковой анализ), и с их помощью можно анализировать ограниченное количество опухолевых маркеров [1]. При этом известно достаточно большое количество характерных особенностей опухолевых тканей, которые могут повысить точность их обнаружения: высокий пролиферативный статус [2], гипоксия [3], высокая плотность клеток и ядер [4], деструктуризация миелина [5], повышение кровенаполнения [6], изменение содержания липидов в опухолевых тканях [7], а также другие молекулярные изменения [8]. Однако опухолевая ткань может не обладать всеми этими характеристиками одновременно, и в эффективной стратегии интраоперационного анализа следует рассматривать их в комплексе, не полагаясь на один диагностический критерий.
В нашей работе мы представляем комплексный подход, основанный на использовании спектроскопии флуоресценции, диффузного отражения и комбинационного рассеяния.
Спектроскопия флуоресценции применена нами для детекции индуцированного аминолевулиновой кислотой (5-АЛК) накопления в клетках опухоли протопорфирина IX, а также для анализа содержания в них эндогенных флуорофоров. В современной клинической практике активно используются различные методы интраоперационной навигации, одним из которых является флуоресцентная навигация [9] с протопорфирином IX (Pp IX) в качестве опухолевого маркера. Его накопление в опухоли индуцировано введением в организм 5-АЛК. Последняя, являясь метаболическим предшественником протопорфирина IX, приводит к его избирательному накоплению в опухолевых тканях по сравнению с нормальными в силу ферментативных нарушений [10] в быстро пролиферирующих клетках опухоли. Как показали исследования [11], содержание протопорфирина IX в глиальных опухолях головного мозга является высокоспецифичным критерием для демаркации границ опухоли, а также для определения степени ее озлокачествления. Протопорфирин IX обладает также фотосенсибилизирующими свойствами, приводящими к генерации реактивных форм кислорода при поглощении излучения с характерной длиной волны, что позволяет использовать его как для интраоперационной навигации, так и для фотодинамической терапии [12], в том числе в сочетании с другими фотосенсибилизаторами для достижения комплексного фотодинамического воздействия на различные опухолевые процессы [13]. Однако зачастую наблюдается незначительное накопление протопорфирина IX в опухолевых клетках [14]. Спектроскопические измерения аутофлуоресценции, проведенные in vitro [15] и ex vivo [16], выявили значительные различия между опухолевой тканью и прилегающей нормальной тканью головного мозга человека. Анализ времени жизни флуоресценции [17] также позволил дифференцировать образцы внутричерепных опухолей. Молекулярным коррелятом спектральных различий опухолевых и здоровых тканей по спектру аутофлуоресценции в видимом диапазоне являются коллаген, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH), флавинадениндинуклеотид (ФАД) и порфирины [18].
Спектроскопия диффузного отражения использована нами для анализа как рассеивающих свойств тканей, так и поглощающих, поскольку спектр диффузного отражения содержит в себе компоненты, связанные с обоими процессами. Их разделение позволяет оценивать структурную целостность тканей по компоненте, обусловленной рассеянием, и содержание гемоглобина по компоненте, обусловленной поглощением.
Режим спектроскопии комбинационного рассеяния приобретает все большее значение в нейроонкологии благодаря его способности дифференцировать опухолевые и нормальные ткани по совокупности молекулярных особенностей [19]. Как мы видим, одновременное использование спектроскопии флуоресценции, диффузного отражения и комбинационного рассеяния позволяет анализировать широкий ряд компонентов опухолей, изменение которых в процессе озлокачествления тканей может иметь высокое диагностическое значение.
Цель исследования — создание оптико-спектрального метода дифференциации типов внутричерепных опухолей.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Исследования проведены в лаборатории нейрохирургической анатомии и консервации биологических материалов на образцах опухолевых тканей, извлеченных во время нейрохирургических операций, непосредственно после удаления помещенных в физиологический раствор. После оптико-спектральных измерений образцы в формалине оправляли на патоморфологическую экспертизу. Исследованы образцы от 60 пациентов с диагнозами глиобластомы (n=28), менингиомы (n=12), астроцитомы (n=9), олигодендроглиомы (n=5), метастазов (n=6). От каждого пациента было от 1 до 4 биоптатов (всего 93 образца тканей) с последующей верификацией посредством патоморфологической экспертизы. Для всех образцов произведены измерения спектров комбинационного рассеяния, флуоресценции 5-АЛК индуцированного протопорфирина IX и спектров диффузного отражения в области 500—600 нм. Измерения аутофлуоресценции производились для 46 образцов из 93.
Оптико-спектральные измерения каждого биологического образца производились в три этапа (рис. 1):
Рис. 1. Стенд для оптико-спектральных измерений образцов внутричерепных опухолей, проводимых поэтапно для каждого образца ткани, поступающего в лабораторию нейрохирургической анатомии и консервации биологических материалов.
Описание этапов приведено тексте.
1) регистрация спектрометром ЛЭСА-01-БИОСПЕК спектров флуоресценции образца с лазером 405 нм в качестве источника возбуждения;
2) регистрация спектрометром ЛЭСА-01-БИОСПЕК спектров диффузного отражения белого света образцом во всем диапазоне регистрации спектрометра и спектров флуоресценции с лазером 632,8 нм в качестве источника возбуждения;
3) регистрация спектрометром Raman-HR-TEC-785 спектров спонтанного комбинационного рассеяния (СКР) образца с лазером 785 нм в качестве источника возбуждения.
Измерение спектров спонтанного комбинационного рассеяния
Измерение СКР осуществляли с использованием установки, включающей спектрометр Raman-HR-TEC-785 (StellarNet, США; спектральный диапазон 200—2750 см–1, разрешение 4 см–1), источник лазерного излучения Ramulaser-785 (StellarNet, США; 785 нм), волоконно-оптический конфокальный зонд для доставки лазерного излучения и сигнала комбинационного рассеяния. Ширина лазерного пика составляет 0,2 нм; мощность до 500 мВт.
Спектры СКР каждого образца регистрировали в серии из 10 измерений. Экспозиция каждого спектра составляла 30 с (серия из 10 спектров, всего 5 мин на серию) при интенсивности лазера 150 мВт. Перед каждой серией измеряли фоновый сигнал. Фоновый сигнал и спектры комбинационного рассеяния измеряли в затемненном помещении.
Измерение спектров аутофлуоресценции, флуоресценции 5-АЛК и диффузного отражения
Для регистрации спектров диффузного отражения и лазерно-индуцированной флуоресценции протопорфирина IX использована установка, состоящая из спектроанализатора ЛЭСА-01-БИОСПЕК («Биоспек», Россия), источника лазерного излучения (гелий-неоновый лазер 632,8 нм), источника широкополосного излучения (галогенная лампа), оптоволоконных средств доставки излучения к ткани и от нее, а также персонального компьютера с программным обеспечением для регистрации и анализа спектров. На входе спектроанализатора установлен полосовой запирающий фильтр (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Россия), ослабляющий рассеянное назад лазерное излучение на три порядка, что позволило регистрировать последнее в одном динамическом диапазоне с лазерно-индуцированным флуоресцентным излучением. Аналогичная установка использована для регистрации аутофлуоресцентного сигнала: спектроанализатор (ЛЭСА-01-БИОСПЕК), источник возбуждающего лазерного излучения (диодный лазер 405 нм) и оптическое волокно для доставки излучения.
При проведении измерений дистальный конец оптоволоконного жгута приводили в мягкий контакт (без давления и без воздушного зазора между торцом волокна и тканью) с исследуемой биологической тканью. В результате измерения регистрировали спектры диффузно отраженного тканью широкополосного излучения, спектры флуоресцентного сигнала протопорфирина IX и диффузно отраженного лазерного излучения 632,8 нм, спектры сигнала аутофлуоресценции и диффузно отраженного лазерного излучения 405 нм.
Алгоритмы обработки спектральных данных
Спектры комбинационного рассеяния, флуоресценции и диффузного отражения подвергались как предобработке с целью повышения дешифровочных свойств, так и различным вариантам декомпозиции с целью выделения характерных особенностей, свойственных исследуемым тканям. По спектрам флуоресценции протопорфирина IX рассчитаны значения интегральной интенсивности обратного рассеяния лазера 632,8 нм (площадь под кривой спектра в диапазоне 625—640 нм) и значение индекса флуоресценции протопорфирина IX (отношение площади под кривой спектра в диапазоне 690—730 нм к значению интегральной интенсивности лазера 632,8 нм). Спектр диффузно отраженного тканью широкополосного излучения использовали для расчета концентрации гемоглобина в образце и коэффициента светорассеяния. Для этого сначала рассчитывали спектр ослабления света в образце:
A = –log10 (I/W),
где I — значение в спектре отраженного излучения; W — значение в спектре широкополосного источника света.
Рассчитанный спектр ослабления математически раскладывался как линейная комбинация спектров поглощения оксигенированного и неоксигенированного гемоглобина [20] и спектра, определяемого как сумма рассеяния Рэлея и Ми:
A(λ) = cHb AHb+ cHbO AHbO (λ) + kμ μs (λ)
μs (λ) = fs λ–b + (1–fs) λ–4.
Концентрацию гемоглобина рассчитывали по формуле:
cHb+ cHbO.
Значение kμ принимали как коэффициент светорассеяния.
Из спектра аутофлуоресценции рассчитаны значения интегральной интенсивности обратного рассеяния лазера 405 нм (площадь под кривой спектра в диапазоне 390—420 нм), индекса аутофлуоресценции флавинов (отношение площади под кривой спектра в диапазоне 460—560 нм к значению интегральной интенсивности лазера 405 нм) и индекса аутофлуоресценции порфиринов, в том числе протопорфирина IX (отношение площади под кривой спектра в диапазоне 600—730 нм к значению интегральной интенсивности лазера 405 нм).
Из усредненного спектра комбинационного рассеяния образца вычитали заранее измеренный темновой спектр. Для исключения возможного шумового сигнала следующим шагом производилось сглаживание спектра алгоритмом Савицкого—Голея (полином 3-го порядка, ширина окна фильтра 15 пикселей). Далее производилось вычитание из спектра комбинационного рассеяния гладкого флуоресцентного сигнала, рассчитанного по методу [21]. Полученный спектр нормировали на площадь в диапазоне 800—1700 см–1. Значения индексов присутствия биохимических компонент рассчитаны как усредненные значения для диапазонов сдвигов, соответствующих характерным пикам комбинационного рассеяния. Проанализированы по результатам оптико-спектральных измерений такие характеристики образцов опухолевых тканей, поступающих в биобанк, как индекс флуоресценции, интенсивность диффузного отражения лазерного излучения на 632,8 нм, концентрация гемоглобина, коэффициент светорассеяния, индекс аутофлуоресценции флавинов, интенсивность диффузного отражения лазерного излучения на 405 нм, индекс присутствия холестерина, индекс присутствия фосфолипидов, индекс присутствия липидов, индекс присутствия каротиноидов, индекс присутствия гема, индекс присутствия оксигенированного гемоглобина, индекс присутствия протеинов, индекс присутствия фенилаланина.
Результаты и обсуждение
Поиск статистически значимых различий между группами проводили с использованием дисперсионного анализа. С уровнем значимости 5% обнаружены различия между группами в содержании каротиноидов, белков и фенилаланина на основе анализа спектров комбинационного рассеяния, а также в уровнях флуоресценции флавинов и обратного рассеяния лазерного излучения на 405 нм и 632,8 нм. Холестерин, фосфолипиды и гем показали различия с худшим уровнем значимости, однако можно надеяться на выявление более явных различий с дальнейшим набором экспериментальной выборки.
Результаты анализа данных о диффузном отражении лазерного излучения (рис. 2) в окне биологической прозрачности (см. рис. 2а) показывают существенное снижение показателя для всех опухолей по сравнению с нормальной тканью за счет обеднения состава рассеивателей в тканях при развитии в них опухолевого процесса [22], при этом олигодендроглиомы значительно отличаются от остальных опухолей в силу особенностей своего строения. Как мы видим, данный параметр позволяет отличить опухоль от нормы, однако не позволяет дифференцировать большинство опухолей между собой. Светорассеяние, вычисляемое по спектрам диффузного отражения широкополосного излучения (см. рис. 2в), показывает более сложную закономерность, что может объясняться вкладом поглощения в спектр ослабления в видимом диапазоне спектра. Как известно, рассеяние света биологическими тканями необходимо рассматривать в различных масштабах [23]. Мы видим наименьший показатель светорассеяния для астроцитом, что объясняется смещением и деструкцией миелинизированных нервных волокнон в опухоли, которые являются важными рассеивателями на тканевом уровне. На субклеточном уровне снижению светорассеяния способствует деградация митохондрий в опухолевых клетках. При этом глиобластома в центре опухоли характеризуется значимым увеличением размеров ядер опухолевых клеток и плотноклеточностью — типичными гистологическими особенностями этого типа опухоли, что приводит к конкурирующему эффекту роста светорассеяния в этой области опухоли. Олигодендроглиома также демонстрирует высокие значения этого параметра в силу олигокомпонента, приводящего к повышению рассеивающих свойств. В работе [24] мы видим похожие зависимости. Сигнал диффузного отражения на 405 нм (см. рис. 2г) обусловлен ослаблением света как за счет светорассеяния, так и за счет высокого поглощения света тканями в фиолетовой области спектра, поэтому наблюдаемые для этого параметра зависимости объясняются не только структурной целостностью тканей, но и ее кровенаполненностью, поскольку гемоглобин является наиболее важным хромофором в биотканях в видимой области спектра. Поэтому для объяснения различий в диффузном отражении на 405 нм и 632,8 нм имеет смысл обратиться к такому параметру, как концентрация гемоглобина (см. рис. 2б). Мы видим, что он существенно выше для менингиом, олигоденроглиом и глиобластом по сравнению с остальными опухолями, что и обусловливает снижение диффузного отражения света от этих опухолей на длине волны 405 нм, на которой свет хорошо поглощается кровью. Он позволяет различать глиобластому и менее злокачественные варианты глиальных опухолей, но мы не можем отличить по концентрации гемоглобина глиобластому, менингиому и олигодендроглиому. Однако диффузное отражение на 632,8 нм позволяет нам достоверно различить менингиому и олигодендроглиому. Уровень аутофлуоресценции при возбуждении излучением на 405 нм позволяет также дифференцировать и глиобластому (см. рис. 2д). Мы видим, что аутофлуоресценция глиобластомы в диапазоне ФАД минимальна по сравнению с теми двумя опухолями, с которыми ее невозможно дифференцировать по уровню гемоглобина.
Рис. 2. Интенсивность диффузно отраженного лазерного излучения (а, г), рассчитанные концентрации гемоглобина (б), коэффициент рассеяния света (в) и индекс флуоресценции флавинов (д) в различных типах опухолей головного мозга.
Полученные нами результаты хорошо согласуются с данными литературы. Дальнейшее расширение диагностических возможностей оптико-спектрального подхода реализовано нами с использованием спектроскопии спонтанного комбинационного рассеяния (рис. 3). По молекулярному составу мы видим, что метастатические опухоли отличаются от других по наибольшему числу параметров: по уровню холестерина (см. рис. 3а) между менингиомой и остальными типами опухолей (за исключением метастазов), по уровню фосфолипидов (см. рис. 3б) разброс данных слишком велик, требуется дальнейший набор образцов для повышения статистической значимости, по уровню липидов (см. рис. 3в) мы видим существенные отличия у метастатических опухолей, по уровню каротиноидов (см. рис. 3г) максимальные значения мы наблюдаем у менингиомы, минимальные у глиальных опухолей, по уровню оксигемоглобина (см. рис. 3д, 3е) мы также видим отличие глиальных опухолей, в которых он ниже, по содержанию белков (см. рис. 3ж) и фенилаланина (см. рис. 3з) отличаются от других опухолей олигодендроглиомы, в которых эти параметры минимальны, максимально содержание фенилаланина в глиобластоме и менингиоме. В работе [25] рассмотрены биохимические и хемометрические признаки внутричерепных опухолей и показано, что относительное количество липидов по сравнению с белками значительно выше в нормальной ткани головного мозга, что также подтверждается и другими работами [26]. Каротиноиды играют важную роль в системе антиоксидантной защиты здорового мозга. Предыдущие исследования показали, что концентрация каротиноидов в плазме обратно пропорциональна риску рака в эпидемиологических и экспериментальных исследованиях. Каротиноиды специфически распределены в различных подтипах лимфоцитов. Авторы [27] наблюдали отчетливое снижение интенсивности пиков 1157 см–1 и 1521 см–1 с увеличением степени злокачественности глиом, что также подтверждает наши результаты.
Рис. 3. Индексы присутствия биохимических компонент в различных типах новообразований (а—з).
Заключение
В настоящей работе рассмотрены оптико-спектральные характеристики нескольких типов внутричерепных опухолей и показано, что для дифференциации этих опухолей недостаточно каждой из рассмотренных спектральных модальностей, взятой в отдельности, только в совокупности они позволяют обнаружить достоверные различия между опухолями. Текущее исследование показывает, что комбинация спектроскопии диффузного отражения, флуоресценции и комбинационного рассеяния может обеспечить срочную диагностику опухолей головного мозга.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2021-1343 от 4 октября 2021 г.).
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Романишкин И.Д., Савельева Т.А., Лощенов В.Б., Пронин И.Н., Павлова Г.В., Горяйнов С.А.
Сбор и обработка материала — Романишкин И.Д., Оспанов А., Савельева Т.А., Шугай С.В.
Статистический анализ данных — Романишкин И.Д.
Написание текста — Савельева Т.А., Романишкин И.Д.
Редактирование — Романишкин И.Д., Савельева Т.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.