Введение

В течение многих лет классификация и стандарты терапии внутримозговых опухолей базировались в основном на гистологическом диагнозе. При этом нередко наблюдались случаи различного биологического поведения опухолей одной гистологической группы. В предложенную Всемирной организацией здравоохранения морфологическую классификацию опухолей центральной нервной системы в 2016 г. впервые внесены генетические параметры, для глиом это прежде всего мутации IDH1,2; 1p/19q ко-делеция и, как дополнительные параметры, — мутации TERT и ATRX. Одним из наиболее существенных изменений в пересмотре 2016 г. стало разделение диффузных анапластических астроцитом (АА) и глиобластом (ГБ) на IDH-позитивные и IDH-негативные. Непосредственно после принятия этой классификации в нейроонкологическом сообществе широко обсуждалось прогностическое значение этой мутации: высказывалось мнение о том, что IDH-негативные АА и даже диффузные глиомы имеют схожий прогноз с ГБ. С накоплением клинического опыта выяснилось, что это не вполне так. И хотя у некоторых пациентов с АА течение заболевания и показатели выживаемости были схожими с таковыми у пациентов с ГБ без мутации IDH (IDH wt), у других пациентов прогноз оказался существенно лучшим. В классификации WHO CNS Tumours пятого пересмотра (2021) диффузные глиомы разделены на три группы: диффузные глиомы взрослых, диффузные доброкачественные глиомы детского возраста и диффузные злокачественные глиомы детского возраста [1]. В качестве факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность существующих методов лечения, предложены дополнительные мутации и аберрации, например амплификация EGFR, комбинация делеции хромосомы 10 и добавочной хромосомы 7 (7+/10–), а также мутация промотора гена TERT как наиболее часто наблюдаемые в ГБ.

Цель исследования — изучить влияние TERT-мутации у пациентов с IDH-негативными диффузными астроцитомами grade III (анапластическими глиомами) на прогноз лечения (показатели общей и безрецидивной выживаемости).

Материал и методы

В исследование включены 45 пациентов, отобранных из базы Центра нейрохирургии на основании результатов морфогенетического анализа: во всех опухолях выявлены гистологические признаки АА grade III и при молекулярно-генетическом исследовании не обнаружена IDH-мутация (случайная выборка: первоначально отобраны все пациенты с диагнозом IDH-негативной АА, а затем из них случайным образом 45 больных). Среди пациентов: женщин — 23, мужчин — 22. Средний возраст составил 45,5 года (от 28 до 69 лет). Все пациенты, за исключением троих, прооперированы в Центре нейрохирургии. В 3 случаях выполнена верификация гистологического диагноза путем стереотаксической биопсии опухоли, в 42 случаях проведено ее микрохирургическое удаление.

ДНК для анализа мутационного статуса промотора гена TERT выделяли из опухолевого материала, хранящегося в фиксированных в формалине парафиновых блоках (FFPE), с помощью набора реагентов QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, США) на колонках по стандартному протоколу, рекомендуемому фирмой-производителем. Праймеры на целевые фрагменты ДНК подбирали с помощью программ Primer3Plus и PrimerSelect. Анализ мутаций в промоторе гена TERT проводили методом прямого секвенирования по Сэнгеру на генетическом анализаторе 3500 (Applied Biosystems, Inc., США). На первом этапе проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с выделенной ДНК с применением наборов GenPak PCR Core (ООО «Лаборатория ИЗОГЕН», Россия) в амплификаторе ProFlex (Applied Biosystems, Inc., США). Очистку продукта, полученного в результате ПЦР, осуществляли с использованием набора Cleanup Standard (ЗАО «Евроген», Россия) по стандартному протоколу фирмы-производителя. Далее ставили секвенсовые реакции с очищенным продуктом ПЦР с использованием набора BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems, Inc., США). После окончания реакции проводили очистку смеси. Для этого использовали набор BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, Inc., США). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения Sequencing Analisys 6 (Applied Biosystems, Inc., США) и MegAlign (пакет программ DNASTAR, США). Мутация в гене TERT выявлена у 21 (46,7%) из 45 пациентов (рис. 1).

Рис. 1. Мутации в промоторе гена TERT. Желтым обозначены праймерные регионы.

Мутации, вызывающие повышение активности теломеразы, располагаются в промоторной зоне и представляют собой две точечные мутации: –124С>T (C228T) и –146C>T(C250T), которые формируют новые точки связывания для транскрипционных факторов, что проявляется повышенной экспрессией теломераз.

Методы статистических исследований: вычисление показателей общей и безрецидивной выживаемости проведено путем построения кривых Каплана—Мейера, а также с использованием модели пропорциональных рисков (Cox regression analysis).

Результаты

Катамнез прослежен у 44 из 45 пациентов (1 пациент — гражданин другого государства). В послеоперационном периоде всем пациентам рекомендовано проведение лучевой и химиотерапии (согласно заключению онкологического консилиума). Медиана катамнеза составила 38,6 мес, глубина катамнеза — 82,8 мес. Лучевая терапия проведена 35 пациентам, не проведена в 7 случаях, для 3 пациентов нет достоверной информации об этом виде адъювантного лечения. Химиотерапия проведена 34 пациентам (в основном применяли темозоломид, реже другие препараты — бевацизумаб, иринотекан и т.д.), не проводилась в 7 случаях, для 4 больных нет информации о ее проведении.

Убедительные данные о наличии или отсутствии рецидива опухоли доступны для 41 пациента, из них рецидив зафиксирован у 23 больных, а у 18 пациентов на момент окончания исследования рецидив не отмечен. Следует отметить, что лишь в 6 случаях из этих 18 при молекулярно-генетическом исследовании опухоли выявлена TERT-мутация.

Средняя продолжительность безрецидивного периода в общей группе из 41 пациента с уточненным катамнезом составила 24,9 мес (варьировала от 0,2 до 79,9 мес). Наличие TERT-мутации в АА grade III характеризовалось более агрессивным течением болезни: снижалось время до прогрессирования (на уровне тенденции). Значение медианы безрецидивной выживаемости у пациентов с TERT-позитивными АА составило 13,3 мес, у пациентов с TERT-негативными глиомами — 57,7 мес. Безрецидивная выживаемость оказалась выше у больных группы с АА без TERT-мутации во всех интервалах, но особенно на ранних стадиях — 12 мес и 24 мес (рис. 2).

Рис. 2. Кривые выживаемости Каплана—Мейера для безрецидивной выживаемости в зависимости от наличия мутации в гене TERT.

Данные об общей выживаемости доступны для 44 из 45 пациентов. На момент окончания исследования 22 пациента оказались живы и 22 скончались. Средний показатель общей выживаемости составил 36,7 мес (варьировал от 1,2 до 82,8 мес). Общая выживаемость у пациентов двух групп была различной: у больных с TERT-мутацией медиана выживаемости составила 15,3 мес, у пациентов с TERT-негативными опухолями — 65,1 мес. При этом полученные различия не достигли статистической значимости (очевидно, ввиду малого объема выборки) (рис. 3). При проведении мультифакторного анализа стало очевидным, что на общую и безрецидивную выживаемость (ожидаемо) оказывали влияние возраст пациента и проведение лучевой и химиотерапии, причем влияние химиотерапии было более выраженным, чем лучевой.

Рис. 3. Кривые выживаемости Каплана—Мейера для общей выживаемости в зависимости от наличия мутации в гене TERT.

Учитывая относительно небольшой объем выборки и короткий катамнез, мы использовали Cox model with a parametric assumption (a proportional hazards assumption), «продолжив» распределение данных во времени в соответствии с полученными закономерностями. В этом случае различия в группах TERT+ и TERT– оказались статистически значимыми как для общей выживаемости (p=0,01), так и для безрецидивной выживаемости (p=0,001).

Обсуждение

TERT — обратная транскриптаза теломеразы — каталитическая субъединица фермента теломеразы. Мутация промотора в гене TERT впервые открыта в клетках меланомы. Данный фермент катализирует РНК-зависимое удлинение 3’-концов хромосом с помощью 6-нуклеотидного теломерного повтора. Мутация промотора в гене TERT приводит к значительному усилению активности процессов удлинения теломерных фрагментов хромосом, что сопровождается ростом их пролиферативного потенциала [2]. Наличие TERT-мутации обычно связано с более агрессивным поведением опухоли и худшим прогнозом лечения. В глиальных опухолях эта мутация описана в 2013 г. [3]. Она относительно часто встречается в медуллобластомах, эпендимомах и менингиомах, а также в глиобластомах и олигодендроглиомах у взрослых пациентов [4, 5].

По результатам ряда работ стало очевидным, что TERT-мутация стабильна в процессе глиомагенеза, т.е. она сохраняется (или не возникает вновь) в процессе малигнизации опухоли. В совокупности это наталкивает исследователей на вывод о том, что мутация в гене TERT играет ключевую роль в процессе глиомагенеза на самых ранних стадиях, если не является основной мутацией для возникновения ГБ [6].

Прогностическая значимость наличия TERT-мутации в глиомах неоднозначна: для ГБ IDH-дикого типа ряд исследований показали негативное влияние мутации TERT на выживаемость [7, 8], однако другие исследователи не получили таких результатов [9, 10]. Наличие TERT-мутации в IDH-мутантных ГБ оказывало негативное влияние на прогноз лечения [11, 12]. Однако, по мнению H. Arita и K. Ichimura [13], прогностическая значимость TERT-мутации для ГБ значительно ниже, чем IDH-мутации или метилирования промотора MGMT.

В группе глиом grade II—III, в которых обнаружены и IDH-мутация, и TERT-мутация, прогноз лечения более благоприятный [11, 13, 14], чем для опухолей той же группы с изолированной IDH-мутацией.

Несколько сложнее обстоит дело в группе IDH-негативных глиом grade II—III, относящихся, согласно классификации 2021 г., к «диффузным астроцитарным глиомам без мутации IDH с молекулярными признаками глиобластомы, WHO grade IV». Некоторые авторы называют этот вид опухоли «молекулярной глиобластомой» (мГБ) в том случае, если выявлен хотя бы один из трех генетических маркеров — мутация промотора TERT, амплификация гена EGFR или добавочная хромосома 7 / потеря хромосомы 10. По результатам работы K. Fujimoto и соавт. [15], только наличие TERT-мутации из трех названных генетических маркеров оказывало негативное влияние на выживаемость пациентов данной группы. Это и самая частая из трех мутаций: согласно результатам работы C.M.S. Tesileanu и соавт. [16], частота выявления TERT-мутации в группе «молекулярных глиобластом» составила 94%.

Следует отметить, что влияние TERT-мутации на выживаемость и прогноз лечения достаточно хорошо изучены для ГБ (как IDH-позитивных, так и IDH-негативных), а также для смешанной группы IDH-негативных grade II—III астроцитарных глиом («молекулярных глиобластом»). При этом нам не удалось обнаружить описаний в литературе полноценных попыток проведения анализа влияния TERT-мутации отдельно для групп grade II и grade III IDH-негативных глиом.

Согласно результатам настоящего исследования, у пациентов с IDH-негативной АА и наличием TERT-мутации отмечены более короткие периоды общей и безрецидивной выживаемости, чем у больных той же группы без TERT-мутации. При этом факторы возраста, а также проведения адъювантной терапии (в большей степени химиотерапии) оставались значимыми.

Медиана выживаемости для пациентов, опухоль которых имела TERT-мутацию (так называемая «молекулярная глиобластома»), в нашем исследовании составила 15,3 мес (варьировала от 2,3 до 58,9 мес). Этот показатель сравним с результатами других работ: в исследовании A. Aibaidula и соавт. [17] он составил 14,8 мес, в работе S. Ma и соавт. [18] — 16,6 мес, в исследовании D.E. Reuss и соавт. [19] — 19,4 мес, в работе A. Ramos-Fresnedo и соавт. [20] — 26 мес. С высокой долей вероятности можно предположить, что на показатель общей выживаемости повлиял метод выбора хирургического лечения: например, в работе S. Ma и соавт. [18] указано, что в 59% случаев проведена стереотаксическая биопсия опухоли.

Следует учесть, что в цитируемых исследованиях группу «молекулярных глиобластом» составили IDH-негативные астроцитомы grade II и grade III. Наша работа основывается только на обследовании пациентов с АА grade III, это в совокупности с данными о выживаемости в исследуемых группах в очередной раз подтверждает преимущество современной молекулярной классификации глиом перед широко используемой ранее классификацией WHO grade.

Следует отметить, что в названных исследованиях общая продолжительность жизни пациентов с «молекулярной глиобластомой» хотя и не статистически значимо, но выше, чем пациентов с «гистологической глиобластомой», причем в работе S. Ma и соавт. [18] эти различия сохранялись и при проведении мультифакторного анализа с учетом наличия/отсутствия таких факторов, как делеция CDKN2A/B и статус амплификации EGFR. Возможно, менее благоприятный прогноз заболевания у пациентов с «гистологической глиобластомой» обусловлен более поздней стадией развития заболевания, на которой оно клинически проявляется и с которой начинается отсчет времени общей и безрецидивной выживаемости, с формированием соответствующих морфологических изменений, наблюдаемых патологами.

В целом результаты нашей работы согласуются с проведенными ранее исследованиями: наличие TERT-мутации в группе IDH-негативных глиом ухудшает прогноз лечения (показатели общей и безрецидивной выживаемости). Эти различия сохранялись и при проведении мультифакторного анализа.

К недостаткам работы можно отнести ее ретроспективный характер, что не позволило оценить степень радикальности удаления опухоли по данным магнитно-резонансной томографии в раннем послеоперационном периоде и включить этот фактор в анализ общей и безрецидивной выживаемости.

Заключение

Различия в прогнозе лечения пациентов группы IDH-негативных глиом зависят от наличия или отсутствия TERT-мутации, поэтому включение мутации в гене TERT в обязательную панель исследования глиом вообще и глиом grade II и III без мутации гена IDH в частности с накоплением статистически значимых величин может привести в ближайшем будущем к субклассификации этих групп опухолей. Исследование мутации в гене TERT должно быть, по нашему мнению, рутинным для когорты этих больных с целью корректного медицинского консультирования пациентов в вопросах прогноза, а главное, для формулирования адекватной тактики адъювантного лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Беляев А.Ю., Кобяков Г.Л.

Сбор и обработка материала — Беляев А.Ю., Шмаков П.Н., Телышева Е.Н., Струнина Ю.В.

Написание текста — Беляев А.Ю.

Редактирование — Усачев Д.Ю., Кобяков Г.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Статья посвящена важной проблеме молекулярного профилирования диффузных IDH-негативных глиом в аспекте мутационных модификаций промотора гена TERT. Авторы сосредоточились на популяции диффузных глиом астроцитарного гистогенеза, классифицированных как grade III по патогистологическим критериям. На сегодня проблема молекулярного профилирования новообразований головного мозга является достаточно острой. Накопленные данные демонстрируют неоднозначные результаты, большая часть работ показывает негативную роль мутаций в промотере гена TERT, но в некоторых исследованиях выявлен противоположный результат. Для возникновения подобной контрадикции существуют важные фундаментальные предпосылки. С одной стороны, мутации промотора гена TERT могут приводить к значительному углублению пролиферативного потенциала клеток, снимая теломерное лимитирование, что, несомненно, ведет к повышению злокачественного потенциала. С другой стороны, подобное резкое повышение пролиферативной активности клеток влечет за собой дестабилизацию их генома и ключевых компонентов метаболических систем, что может снижать жизнеспособность новообразований. В связи с подобной неопределенностью накопление дополнительных данных, полученных по всем современным стандартам доказательной медицины и моделирования клинических и трансляционных исследований, полезно для внедрения новых диагностических подходов. Результаты работы не только подтверждают негативную прогностическую роль мутаций гена TERT, но также дополнительно привлекают внимание к необходимости включения данного молекулярного параметра в диагностическую молекулярную панель для диффузных глиом.

П.В. Никитин (Москва)