Понятия «клеточная культура» и «клеточная линия»

Первичная клеточная культура (КК) получается из опухолевой ткани путем нарушения межклеточных связей и высевания клеток на пластиковую поверхность, заполненную культуральной средой. Первичная КК наиболее близка по гетерогенности к исходной опухоли, однако представлена малым количеством клеток, пассирование которых позволяет нарастить монослой опухолевых клеток. При этом падает гетерогенность КК, так как выживают исключительно клоны, способные к делению. Переживающие криоконсервирование и пассирование опухолевые КК получили название «перевиваемые клеточные культуры». Получение клеточных линий (КЛ) достигается путем культивирования и пролиферации единичных клеток, что позволяет достигнуть большего единообразия в их совокупности. Часто используют иммортализованные КЛ, где активирована экспрессия генов, связанных с функционированием теломеразы [1]. КЛ более агрессивны и активны в делении, но моногенность их клеточной представленности сильно отличается от исходной опухоли.

Клеточные культуры как модель опухоли in vitro

Одна из первых попыток систематического сравнения опухолей и КЛ и КК выявила глобальное сходство в паттернах экспрессии генов с исходной опухолью. При этом КК показывали большее сходство в гетерогенном составе, нежели линии. Что касается линейных клеток нейроопухолей, то подобное сходство было незначительно, что привело к пониманию необходимости использования именно КК, полученных из опухолей пациентов. В ряде работ по исследованию первичных опухолей ЦНС было показано сходство нарушений экспрессии генов, участвующих в значимых каскадах опухолевых тканей, и КК, полученных из них. Так, было продемонстрировано, что изменения в пути TP53—ARF—MDM2 определяются в 84% глиобластом и в 94% соответствующих КК [2, 3]. E. Kim и соавт. сравнили профили экспрессии генов атипичных менингиом и полученных из них КК, проведя полноэкзомное секвенирование образцов опухоли пациентов и первичных КК, созданных из опухоли менингиомы [4]. Полученные данные согласовались с результатами более ранних исследований, в которых сообщалось о мутациях в генах NF2, SMO и AKT1 в атипичных менингиомах. Геномная сигнатура хорошо согласовывалась между КК и образцами опухоли и крови пациента.

На данный момент исследования характеристик опухолей пациентов проводятся в рамках таких проектов, как The Cancer Genome Atlas и International Cancer Genome Consortium [5, 6]. Другим важным результатом изучения генетических особенностей опухолей является проект Cancer Cell Line Encyclopedia, который содержит данные более чем 1 тыс. КЛ из 36 типов опухолей [6, 7]. Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatment содержит молекулярно-генетические и клинические данные по большому количеству опухолей, преимущественно пациентов детского возраста [6]. Отдельно следует упомянуть объединенные усилия 19 центров по созданию панели КК и КЛ метастазов в головной мозг (BrMPanel), так как они обладают собственной биологической идентичностью [8]. Важным моментом исследований является эпигеномные работы, которые фиксируют негенетические модификации. Так, метилирование ДНК является одной из самых изучаемых модификаций при опухолевых патологиях. В одном из первых исследований M. Paz и соавт. показали, что гиперметилирование промоторной области 15 генов-супрессоров опухолей в 12 типах злокачественных опухолей и КК, полученных из опухолевых тканей, схожи между собой [9]. Показано, что паттерны метилирования ДНК различаются в нормальных клетках и клетках глиомы. При этом для глиомы характерно присутствие различных степеней гиперметилирования и гипометилирования CpG-островков. Статус метилирования ДНК различных маркерных генов в клетках глиомы является стандартным диагностическим биомаркером. Так, было отмечено, что около 40% тканей глиомы обладают гиперметилированием промотора MGMT, и это гиперметилирование сохраняется в КК[10].

Анализ гетерогенности опухоли

Молекулярные различия между клетками внутри отдельной опухоли являются причиной возникновения лекарственной устойчивости [11, 12]. В разработке химиотерапевтических препаратов часто используют линейные клетки соответствующего гистогенеза, отрабатывая при этом условия снижения эффекта лекарственной устойчивости [13]. Было доказано, что модели гетерогенных КК могут служить важным инструментом для количественной оценки молекулярных характеристик опухоли и эффективности воздействия терапевтических препаратов на гетерогенную популяцию ее клеток. Кроме того, исследования КК опухолей выявили наличие опухолевых стволовых клеток (ОСК). Эти клетки способны к пролиферации и образованию новой опухоли. Субпопуляции ОСК также были выявлены во многих культурах опухолевых клеток, включая глиому, менингиому и метастазы в головной мозг [14, 15].

ОСК глиомы устойчивы к облучению, их высокий процент в опухоли коррелирует с плохим ответом на лечение [16]. ОСК глиомы можно охарактеризовать по экспрессии группы маркеров, таких как SOX2, OCT4, NANOG, OLIG2, NESTIN, ID1, CD133, CD15, и A2B5 [17—21]. В CD133+ ОСК глиомы активируются белки Chk1 и Chk2 после облучения, стимулируя репарацию повреждений ДНК [22]. Кроме того, ОСК глиобластомы вносят вклад в радиорезистентность опухоли за счет повышенной активации путей PI3K/AKT и PTEN [23]. Использование клеточных культур позволяет изучать особенности ОСК глиомы.

Другое важное направление, которое стало возможно исследовать благодаря КК, — изучение роли микроРНК в регуляции опухолевых процессов. Около 235 микроРНК гиперэкспрессируются и 95 подавляются в глиобластоме по сравнению с нормальной тканью мозга [24]. Благодаря исследованиям на КК глиобластом человека обнаружено, что, например, miR-124 увеличивает радиочувствительность клеток глиомы путем ингибирования CDK4 [25], а избыточная экспрессия miR-1 и miR-221/222 обусловливают радиорезистентность клеток глиобластомы, регулируя путь Akt, независимо от статуса PTEN [26].

2D и 3D клеточные культуры нейроопухолей

В настоящее время используются различные методы культивирования опухолевых клеток, каждый из которых имеет свои плюсы и минусы. Для изучения молекулярных основ злокачественных образований существует несколько экспериментальных модельных систем.

Один из первых подходов к подбору индивидуальной терапии был основан на результатах лечения лабораторных животных с ксенотрансплантатами, полученными от пациента [27]. Успешными моделями опухоли in vitro для исследования является культивирование монослоя (2D), а также различные методы 3D-культивирования, в том числе, с моделированием условий опухолевого микроокружения [28].

Для получения 2D монослоя клеток опухоль диссоциируют с помощью специфических протеолитических ферментов, таких как коллагеназа, диспаза и/или трипсин. Возможно сочетание с механической диссоциацией для лучшего рассеивания опухолевой массы.

Использование КЛ опухолей (более простых в культивации) для разработки терапевтических подходов потерпело неудачу в связи с тем, что однообразие линейных клеток не соответствует гетерогенности исходной опухоли. К сожалению, большая часть результатов, собранных в крупных базах данных по фармакогеномике, была получена в исследованиях с использованием именно КЛ. На данный момент приходит понимание, что возможно использование только КК, полученных непосредственно из опухоли пациента. Однако и подобный вариант имеет ряд недостатков. Например, не учитывается роль микроокружения. Во многих исследованиях по разработке 3D-систем культивирования при моделировании микроокружения были продемонстрированы значимые отличия от привычной 2D культуры [29].

M. Witusik-Perkowska и соавт. сопоставили экспрессию микроРНК в клетках исходной глиобластомы и в клетках, полученных при культивировании тремя разными способами [30]. Оказалось, что экспрессия некоторых вариантов микроРНК (miR-130a, miR-221, miR-31, miR-21, miR-222, miR-210) существенно различается при сопоставлении опухоли с культурами, а также при сопоставлении культур между собой. При последующем анализе оказалось, что указанные изменения могут влиять на чувствительность к химиопрепаратам, в частности, к темозоломиду.

В исследовании N. Gomez-Roman и соавт. было показано, что свойства 2D- и 3D-культур клеток глиобластомы отличаются по некоторым параметрам, в частности, по чувствительности к ряду противоопухолевых агентов (бевацизумаб, эрлотиниб), а также к гипоксии [29]. 3D-культура оказалась более резистентной к лучевому воздействию, предположительно, за счет гипоксических условий в толще культуры. Кроме того, авторы выявили различия в экспрессии отдельных генов между двумя типами культур.

Микроокружение, которое состоит из фибробластов, перицитов, иммунных клеток и стромальных клеток, является важным фактором in vivo, поскольку перекрестные связи между опухолью и другими неопухолевыми клетками влияют на ряд процессов [31].

Культивирование опухолевых клеток со стромальными клетками, подобными тем, которые присутствуют в естественных условиях, может влиять на экспрессию генов. Кроме того, элементы микроокружения могут усиливать геномную нестабильность, важную для иммунотерапии [32]. Для изучения влияния микроокружения in vitro D. McMillin и соавт. культивировали стромальные клетки с опухолевыми клетками и показали, что микроокружение может как повышать чувствительность, так и повышать резистентность в зависимости от состава клеток, препарата и микроокружения [33].

A. Pandita и соавт. исследовали биопсии опухоли глиобластомы и выявили, что амплификация EGFR сохраняется in vivo, но теряется in vitro [34]. Более поздние исследования глиобластомы подтвердили, что изменения EGFR, PDGFRA, p53, PTEN и CDKN2A в опухолях пациентов сохраняются в подкожных и внутричерепных ксенотрансплантатах[35].

За последние годы было предложено несколько 3D-моделей глиобластомы — выращивание в матригеле, 3D-матриксе, нейросферах, органотипичных сфероидах, опухолевых органоидов, в мозге мыши и т. п. [29, 36].

Однако именно 2D-КК наиболее просты для подбора терапевтического протокола. Выбор экспериментальной модели должен быть продиктован поставленным вопросом. КК не являются идеальными моделями, но имеют сильные стороны, такие как простота использования, низкая стоимость и возможность применения в различных экспериментальных исследованиях. 3D-модели сложны в поддержании и отработке терапии, но они точнее моделируют биологию опухоли [37].

Однако и эти модели не могут отразить всю сложность и разнообразие микросреды, с которой сталкиваются опухолевые клетки в организме. В целом, ограничения и различия, связанные с любой модельной системой, следует учитывать при оценке вероятности того, что наблюдения, сделанные на ее основе, будут предсказывать клинические эффекты.

Использование клеточных линий в трансляционной медицине

Последние исследования начали включать геномные данные для интерпретации показателей лекарственной чувствительности опухолей, в том числе и ЦНС. Большую роль в этих исследованиях играют коллекции КК злокачественных опухолей. Первой из таких баз данных была NCI-60, включающая 60 КК, относящихся к 9 типам нейроопухолей [38]. На этой панели КК были оценены десятки тысяч химических соединений и лекарств. Одним из ранних алгоритмов, разработанных для обработки этих данных, был COMPARE, который обобщал многочисленные фармакологические параметры [39]. Авторы обнаружили, что агенты со схожими механизмами действия вызывают схожие реакции. COMPARE послужил толчком к дальнейшему совершенствованию алгоритмов, в результате чего NCI-60 превратился из инструмента для скрининга лекарств в метод выявления молекулярных особенностей, предсказывающих ответ на препарат. U. Scherf и соавт. первыми связали экспрессию генов в NCI-60 с фармакологическими профилями [40].

Другие типы баз данных фармакогеномики in vitro уникальны тем, что они оценивают изменения после воздействия на клетки различных агентов. The Connectivity Map (CMAP) — это попытка определить изменения экспрессии генов в ответ на более чем 6 тыс. лекарственных веществ [41]. Программа NIH Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) Program 5 активно проводит аналогичные работы и оценивает молекулярные и клеточные изменения в ответ на различные воздействия. В совокупности базы данных фармакогеномики КК были использованы в различных исследованиях и позволили предложить новые лекарства [42].

Большое количество данных генетических особенностей и чувствительности к препаратам, полученных в исследованиях, позволяет создавать модели прогнозирования чувствительности in silico, в частности, S. Pingle и соавт. разработали модель предсказания ответа глиобластом, результаты которой совпадали с клеточными моделями в исследованиях in vitro на 75% [43].

Популярность коллекций первичных КК опухолей ЦНС дает возможность разрабатывать новые подходы. Так, например, проведено исследование индивидуальной оценки чувствительности к препаратам у пациентов с глиобластомой [44]. Клетки, полученные от 40 пациентов с диагнозом глиобластомы, были протестированы панелью из 30 противоопухолевых соединений с использованием проточной цитометрии на выявление апоптоза. На основании этих данных в добавление к лучевой терапии предписывалась индивидуальная лекарственная терапия. Медиана выживаемости составила 20,5 мес. Был сделан вывод, что назначение химиотерапии пациентам с глиобластомой на основании результатов тестирования чувствительности in vitro является обоснованным.

F. Jacob и соавт. создали биобанк органоидов глиобластомы (n=70), которые повторяли гистологические характеристики, клеточное разнообразие, экспрессию генов и мутационные профили исходных опухолей [45]. При трансплантации в мозг взрослых грызунов органоиды быстро образовывали агрессивные инфильтрированные опухоли, влияние на которую авторы оценивали на полученной модели. Чтобы имитировать послеоперационное стандартное лечение, они подвергли опухолевые клетки от 7 пациентов облучению в 10Gy с одновременным воздействием темозоломида в течение недели. У 3 органоидов из 7 in vitro наблюдалось снижение процентного содержания Ki-67 положительных клеток. Параллельный анализ пациентов показал, что у двух из них, в образцах которых определялось снижение Ki-67 позитивных клеток in vitro, отмечалось уменьшение и стабилизация опухоли после проведенного лечения по данным магнитно-резонансной томографии. Между тем, у 3 пациентов без значительных изменений в количестве Ki-67 позитивных клеток in vitro выживаемость после лечения была ниже медианы (1, 3 и 8 мес соответственно). Данные говорят о совпадении результатов у пациента и в КК, выведенной из опухоли больного. Также разрабатывается технология иммунотерапии при злокачественных менингиомах с использованием ее оценки на КК [46].

Заключение

Создание биоресурсных коллекций КЛ, полученных из нейроопухолей пациентов, позволяет расширить наше понимание о процессах, происходящих в подобных образованиях. Эти разработки дали возможность обнаружить ОСК и понять, что необходимо разрабатывать терапию, направленную на остановку деления именно таких клеток. Использование КК нейроопухолей дает потенциал для наращивания опухолевых клеток для всестороннего исследования с использованием омиксных технологий. Кроме того, применение персональных опухолевых КК позволяет отрабатывать терапевтический подход к каждому пациенту, а гетерогенность опухолевых КК создает предпосылки для изготовления новых препаратов, универсально действующих на разные типы опухолевых клеток. Важность этого направления очевидна. Возможно, подобный подход поможет найти терапию, улучшающую течение болезни и, в идеале, приводящую к полному излечению пациентов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2021-1343).

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — Карандашов И.В., Гольбин Д.А., Кубышкина В.Е., Павлова Г.В.

Сбор и обработка материала — Карандашов И.В., Кубышкина В.Е., Павлова Г.В.

Написание текста — Карандашов И.В., Кубышкина В.Е., Павлова Г.В.

Редактирование — Карандашов И.В., Галкин М.В., Пронин И.Н., Павлова Г.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Развитие методов получения культур клеток из ткани различных опухолей позволило совершить колоссальный прорыв в понимании молекулярно-биологических особенностей опухолевого процесса. В настоящее время культуры опухолевых клеток широко используются для изучения процессов канцерогенеза и выявления ключевых белков, которые играют роль в озлокачествлении клеток. Именно на культурах клеток проводится первичный скрининг химических веществ с целью поиска потенциальных противоопухолевых препаратов. Исследования на первичных культурах из опухоли пациента дают возможность разрабатывать подходы для персонализированной терапии.

В статье Г.В. Павловой и соавт. представлен обзор современных работ, которые проведены на клеточных культурах из опухолей ЦНС. В этих работах оценивались: молекулярная идентичность клеток в культуре и опухолях, особенности экспрессии генов в опухолевых стволовых клетках, роль микроРНК. В обзоре обсуждается использование 2D- и 3D-культур для разработки биотехнологических подходов к внедрению новых терапевтических и диагностических средств. Статья представляет большой интерес для исследователей, работающих с культурами клеток.

Е.Ю. Рыбалкина (Москва)