Список сокращений

MGMT — O[6]-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза

ЦНС — центральная нервная система

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР — полимеразная цепная реакция

CpG — цитозин-фосфат-гуанин

Введение

Метилирование ДНК — естественный эпигенетический механизм, действующий в организме человека на протяжении всей жизни, отвечающий за поддержание стабильности генома, регуляцию экспрессии генов и нормальную дифференцировку различных типов клеток [1]. Нарушение правильной структуры метилирования ДНК ассоциируется со многими заболеваниями, в том числе онкологическими, т.к. приводит к активации онкогенов или подавлению онкосупрессоров [2]. Применительно к патологии нервной системы аберрантное метилирование области промотора гена MGMT характерно для глиальных опухолей [3, 4], а также некоторых неопухолевых дегенеративных заболеваний [5, 6].

Ген MGMT расположен в хромосоме 10q26 и кодирует фермент ДНК-репарации O[6]-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазу, которая восстанавливает структуру ДНК при повреждении ее алкильными соединениями. Снижение экспрессии или полное угнетение функции гена MGMT за счет эпигенетической модификации цитозин-фосфат-гуаниновых (CpG) динуклеотидов в области промотора этого гена тормозит репарацию ДНК опухолевых клеток и делает ее чувствительной к воздействию алкилирующих агентов. Благодаря этому, по данным многочисленных исследований, при метилированном промоторе гена MGMT у пациентов со злокачественными глиомами наблюдается положительный эффект химиотерапии темозоломидом — увеличение общей и безрецидивной продолжительности жизни [7—11].

Несмотря на убедительные данные, подтверждающие большую прогностическую ценность статуса метилирования промотора гена MGMT у пациентов с глиальными опухолями перед началом лечения, его внедрение в качестве биомаркера в рутинную практику сопряжено с определенными трудностями. Золотого стандарта для определения статуса метилирования промотора гена MGMT не существует, а различия в методиках и доступности технологий, используемых в разных лабораториях по всему миру, препятствуют достижению консенсуса и созданию единых рекомендаций.

Чаще всего для оценки статуса гена MGMT применяют качественную или количественную метилспецифическую полимеразную цепную реакцию (ПЦР, англ. qMSP PCR) как экономически выгодный и положительно зарекомендовавший себя во многих работах метод [12]. Метод качественной метилспецифической ПЦР в режиме реального времени является основным в научных исследованиях, которые выполняются в патологоанатомическом отделении ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России (НМИЦН) [13]. Кроме ПЦР для определения статуса метилирования промотора гена MGMT возможно применение высокопроизводительных методов, таких как пиросеквенирование и анализ общего профиля метилирования ДНК с использованием микрочипов Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip Array (27K, 450K, 850K/EPIC) [14, 15]. Несмотря на то что стоимость и длительность последних превышают таковые для ПЦР, данные методы исследования более перспективны, так как позволяют проводить параллельную оценку статуса метилирования множества участков генома, а не только гена MGMT.

Учитывая необходимость проведения молекулярно-генетических исследований для постановки точного диагноза и подбора адекватного метода лечения пациентов с опухолями центральной нервной системы (ЦНС) в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, в патологоанатомическом отделении НМИЦН с 2021 г. применяется метод анализа общего профиля метилирования ДНК опухолей с использованием микрочипов Infinium Methylation EPIC BeadChip Array с целью определения их молекулярного класса. Полученные таким методом данные, помимо характерного эпигенетического профиля для молекулярного класса, содержат дополнительную информацию, позволяющую судить о наличии делеций и амплификаций участков хромосом, гипо-/гиперметилировании отдельных участков генома, что может быть легко адаптировано для оценки статуса промоторной области гена MGMT.

Цель исследования — провести прицельный анализ интенсивности сигнала метилирования ДНК в области гена MGMT в образцах злокачественных глиом и выявить наиболее значимые геномные позиции для вычисления статуса промотора гена MGMT для дальнейшего совершенствования диагностики и прогнозирования терапевтических возможностей пациентов со злокачественными глиомами.

Материал и методы

В настоящей работе были использованы данные об общем профиле метилирования ДНК в 43 образцах злокачественных глиом (замороженной ткани или парафиновых блоков) пациентов, находившихся на лечении в НМИЦН. По данным гистологической оценки материала, образцы представляли собой IDH-мутантные глиомы (астроцитомы, олигодендроглиомы) либо глиобластомы с IDH-дикого типа. Подготовка образцов ДНК опухолей проводилась с помощью набора Infinium MethylationEPIC BeadChip Kit, с последующим сканированием на платформе Illumina Next-Seq 550 Sequencing System.

Данные об интенсивности сигнала, сгенерированные на приборе Illumina (исходные IDAT-файлы), были обработаны с использованием библиотеки Bioconductor minfi (v.1.42.0) [16] в соответствии с рекомендациями производителя микрочипов. Были выполнены фоновая коррекция, нормализация данных и подсчет M- и Beta-значений уровней интенсивности сигнала на метилированных и неметилированных CpG-участках. Для дальнейшего вычисления статуса метилирования промотора гена MGMT был использован специальный алгоритм анализа данных MGMT-STP27 [17], основанный на модели логистической регрессии, которая была обучена на результатах метилспецифической ПЦР 63 образцов глиобластомы и 5 образцов нормальной ткани головного мозга и валидирована на дополнительном наборе данных метилирования ДНК 50 образцов глиобластомы.

С целью выявления статистически значимых для оценки статуса гена MGMT CpG-островков был проведен сравнительный анализ интенсивности сигнала метилирования в разных точках (differentially methylated probes, функция minfi: dmpFinder, множественное сравнение с поправкой Бонферрони) на отрезке генома chr10:131260505-131571247 (версия сборки генома hg19/GRCh37), включающем собственно ген MGMT и область промотора ~3 Kbp выше него. Полученные результаты отфильтрованы и отсортированы по наибольшей статистической значимости (adjusted p-value), после чего сопоставлены с данными литературы.

Результаты и обсуждение

В ходе работы были получены общие профили метилирования ДНК и на их основе вычислен вероятный статус метилирования промоторной области гена MGMT для всех образцов глиобластом (рис. 1, а). В результате первого этапа анализа образцы были разделены на две группы в соответствии со статусом промотора гена MGMT (метилирован/неметилирован); в 24 образцах (55%) промотор гена MGMT был метилирован.

Рис. 1. Оценка статуса промотора гена MGMT.

a — оценка статуса промотора гена MGMT при помощи модели MGMT-STP27 на примере двух образцов. На диаграмме справа показано расположение конкретного образца (точка) относительно порогового значения сигнала метилирования (красная линия) для присвоения статуса метилирован/неметилирован; ДИ — доверительный интервал; б — различие значений интенсивности сигнала метилирования в области 20 CpG-зондов, относящихся к промотору гена MGMT. Строки (ось ординат) — CpG-зонды на микрочипе. Столбцы (ось абсцисс) — образцы опухолей, сгруппированы по предполагаемому статусу промотора гена MGMT (метилирован/неметилирован); в — сравнение интенсивности сигнала метилирования в области CpG-зондов cg12434587, cg12981137 и cg14194875. По оси ординат — бета-значение сигнала метилирования, по оси абсцисс — группы образцов опухолей по статусу промотора гена MGMT (M-метилирован, U-неметилирован). Значения р-value приведены на основании t-теста с поправкой на множественное сравнение.

Из 209 точек (CpG-зондов), согласно аннотации располагающихся на микрочипе Human Methylation EPIC в области гена MGMT, только 20 соответствовали CpG-островку, расположенному в промоторной области гена MGMT и охватывающему участок начала транскрипции гена. Было показано, что именно этот CpG-островок является определяющим для регуляции экспрессии гена [18]. Остальные CpG располагались ниже участка начала транскрипции гена. При сравнительном анализе интенсивности сигнала метилирования генома в регионе chr10:131260505-131571247 был обнаружен ряд точек (CpG-зондов), сигнал метилирования в области которых статистически значимо отличался между образцами с метилированным и неметилированным геном MGMT (рис. 1, б). Наиболее значимым было различие интенсивности сигнала метилирования в точках cg12434587, cg12981137 и cg14194875 (рис. 1, в). Все три точки находились в пределах области промотора гена MGMT (chr10:131264202-131266799 согласно аннотации Ensembl), причем cg12434587 и cg14194875 — выше, а cg12981137 — ниже участка начала транскрипции гена MGMT. Точки cg12434587, cg12981137 ранее были использованы для обучения предсказательной модели статуса промотора гена MGMT в вышеуказанном методе MGMT-STP27 [17], в то время как сигнал с cg14194875 для данной цели не применялся. Вероятно, это могло быть связано с тем, что степень распознавания сигнала на предыдущих версиях микрочипов Human Methylation 27K/450K была ниже по сравнению с более поздней версией Human Methylation EPIC, используемой в нашем случае.

При анализе литературы и доступных эпигеномных данных мы установили, что расположение обнаруженных нами наиболее значимых точек метилирования ДНК соответствует координатам регуляторной области открытого хроматина (энхансер H3K27ac), которая подвержена гиперметилированию в образцах глиобластом по данным хроматин-иммунопреципитационного секвенирования (CHIP-seq), что также играет важную роль в регуляции экспрессии гена MGMT [19] (рис. 2).

Рис. 2. Визуализация области хроматина H3K27AC в образцах глиобластом по данным CHIP-seq (вид экрана программы IGV: Integrative Genomics Viewer).

Приближение на отрезок генома в области промотора гена MGMT на хромосоме 10q26. Черным пунктиром отмечены локации CpG-зондов cg12434587, cg12981137 и cg14194875. Видно, что в образцах глиобластом со статусом U (unmethylated, MGMT неметилирован) локации cg12434587, cg12981137, cg14194875 соответствуют участкам повышенного сигнала CHIP-seq (активного хроматина H3K27AC), в отличие от глиобластом со статусом M (methylated, MGMT метилирован).

Заключение

Метилирование промотора гена MGMT — важный патогенетический механизм и прогностический биомаркер глиобластомы IDH-дикого типа. Золотого стандарта лабораторной диагностики статуса метилирования гена MGMT не существует, однако наравне с ПЦР появляются новые высокопроизводительные методы, подходящие для этой задачи.

Нами показана возможность оценки статуса метилирования области промотора гена MGMT на основании данных общего профиля метилирования ДНК опухоли, что может служить альтернативой метилспецифической ПЦР. Следует отметить, что исследование общего профиля метилирования ДНК опухоли, кроме статуса MGMT, позволяет одномоментно определить ее молекулярный класс и обнаружить значимые хромосомные перестройки, а также выявить амплификации и делеции генов, что особенно важно при исследовании злокачественных глиом и дает возможность врачу-патоморфологу предоставлять клиницистам более полную диагностически и терапевтически значимую информацию [20].

При сравнительном анализе интенсивности сигнала в области разных точек на микрочипе мы показываем наиболее статистически значимые участки генома, соответствующие области открытого хроматина в окружении участка начала транскрипции гена MGMT. Единственная на данный момент вычислительная модель MGMT-STP27, разработанная в 2012 г. на базе микрочипов Illumina Human Methylation 27K и 450K, задействовала лишь 2 из вышеуказанных точек. Мы полагаем, что данная модель может быть усовершенствована для обновленного микрочипа Illumina Human Methylation EPIC с учетом дополнительных CpG-зондов, а также верифицирована для большего спектра опухолей ЦНС (в частности эмбриональных) и применена к оценке статуса метилирования других генов.

Наши наблюдения согласуются с результатами других исследователей в сфере нейроонкологии, демонстрирующими, что новые вычислительные методы, подобные MGMT-STP27, достаточно эффективны, не уступают метилспецифической ПЦР и после некоторой адаптации могут применяться в клинической практике в качестве рутинного инструмента морфологической и молекулярной диагностики для совершенствования дальнейших этапов подбора терапии и распределения пациентов на группы в ходе клинических испытаний [21, 22].

Работа выполнена при поддержке гранта Министерства образования и науки №075-15-2021-1343 «Развитие биоресурсной коллекции опухолей нервной системы человека с молекулярно-генетической паспортизацией для персонифицированного лечения пациентов с нейроонкологическими заболеваниями».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Петрова Е.И., Рыжова М.В.

Сбор и обработка материала — Галстян С.А., Телышева Е.Н.

Статистический анализ данных — Галстян С.А., Петрова Е.И.

Написание текста — Петрова Е.И.

Редактирование — Галстян С.А., Телышева Е.Н., Рыжова М.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Представленная работа посвящена одному из важнейших прогностических и терапевтических факторов диффузных глиом — статусу метилирования промотора гена MGMT. В настоящий момент нет золотого стандарта определения статуса метилирования промотора гена MGMT, однако в большинстве лабораторий используется метилспецифическая полимеразная цепная реакция как наиболее доступный и простой в применении метод.

Авторы демонстрируют альтернативный способ определения статуса метилирования промотора гена MGMT с использованием набора Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit, безусловно, более дорогостоящей и сложной методики, позволяющей, однако, получить дополнительные клинически значимые данные. В исследовании авторы показывают возможность улучшения вычислительной модели определения статуса метилирования промотора гена MGMT, обнаружив дополнительный участок генома, участвующий в регулировании активности гена MGMT.

Данная работа вносит ценный вклад в нейроонкологию, отражает перспективы изучения общего профиля метилирования ДНК и возможности для дальнейших исследований, в том числе клинических.

А.Х. Бекяшев (Москва)