Список сокращений

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

сцДНК — свободноциркулирующая дезоксирибонуклеиновая кислота

СМЖ — спинномозговая жидкость

ПЦР — полимеразная цепная реакция

цкПЦР — цифровая капельная аллель-специфическая полимеразная цепная реакция

СТБ — стереотаксическая биопсия

РНК — рибонуклеиновая кислота

ЦНС — центральная нервная система

Введение

Несмотря на развитие нейроонкологии и расширение наших представлений о диффузных опухолях ствола головного мозга не только на клеточном, но и на молекулярно-генетическом уровне, диагностика и лечение этих новообразований до сих пор основывается лишь на данных магнитно-резонансной томографии (МРТ). Проведение инвазивной диагностики затруднено из-за локализации опухоли в критически важной структуре и сопряжено с риском нарастания неврологической симптоматики [1]. Лучевая терапия остается стандартным методом лечения, т. к. нет доказанных и эффективных схем применения химиотерапии и таргетных препаратов.

Жидкостная биопсия открывает новые возможности для безопасной диагностики диффузных опухолей ствола мозга. Это высокотехнологичный, малоинвазивный метод, выявляющий генетические аберрации в опухолевой дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК), получаемой из биологических жидкостей, таких как ликвор и кровь. Сегодня эта технология уже широко используется в общей онкологии, но в диагностике диффузных опухолей ствола применяется редко ввиду малой изученности ее информативности и достоверности [2—4]. В опубликованных исследованиях не указаны точные критерии для сбора биологического материала (ликвора) для последующего анализа, что затрудняет правильную интерпретацию результатов. Информация о совпадении мутаций в свободноциркулирующей ДНК (сцДНК) и ткани опухоли у детей противоречива; у взрослых пациентов подобные исследования пока не проводились, что не позволяет сделать вывод о взаимозаменяемости методов [5—7].

Материал и методы

Исследование выполнено на базе двух центров: ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России и ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. В исследование включены 16 пациентов с диффузными опухолями ствола мозга, проходивших обследование и лечение в ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России в период с апреля по август 2023 г. Это были как пациенты детского возраста (до 18 лет, n=5; медиана возраста — 12 лет), так и взрослые (n=11; медиана возраста — 34 года).

Все пациенты клинически и рентгенологически обследованы. Протокол МРТ включал получение томограмм в аксиальной, фронтальной и сагиттальной проекциях в режимах Т1, Т2, Т2-FLAIR и DWI. После контрастного усиления в данной серии наблюдений выполнялись только Т1-взвешенные томограммы.

У 14 пациентов выполнено хирургическое вмешательство, целью которого было либо удаление новообразования ствола мозга, либо получение биопсийного материала. В 2 случаях от биопсии решено воздержаться из-за локализации бессимптомного процесса в области продолговатого мозга и высокого риска появления неврологической симптоматики после операции.

В качестве источника сцДНК использовалась спинномозговая жидкость (СМЖ), полученная при люмбальной пункции.

Забор СМЖ для последующего выделения циркулирующей опухолевой ДНК производили перед началом операции. В 2 случаях, при которых последующей морфологической верификации не проводили, люмбальная пункция выполнена в амбулаторных условиях; эти пациенты находились под наблюдением в течение 2 ч после манипуляции. У детей осуществляли забор 5 мл ликвора, у взрослых — 10 мл. Объемы ликвора выбраны эмпирически.

Хранение ликвора проводилось с использованием вакуум-систем со стабилизатором внеклеточной ДНК (Градбиомед, Россия).

Молекулярно-генетическое исследование выполняли в лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Фракцию сцДНК выделяли из 4 мл СМЖ набором QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAgen, Германия). Измерение концентрации выделенной сцДНК, реакцию преамплификации целевых фрагментов генов H3F3A и BRAF и цифровую капельную аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию (цкПЦР) для выявления онкогенных миссенс-вариантов H3F3A K28M и BRAF V600E осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [8].

Исследование опухолевой ткани, полученной при биопсии или резекции новообразования, выполняли как на базе ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, так и на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Оно включало гистологическое и иммуногистохимическое исследование с целью верификации диагноза, а также анализ вышеперечисленных мутаций в генах H3F3A и BRAF с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Для выявления мутаций в 600 кодоне гена BRAF применяли набор BRAF Codon 600 Mutation Analysis Kit II, Cat. # BRAFX-RT64 (EntroGen, США), определение миссенс-мутации H3F3A K28M осуществляли с использованием тех же олигонуклеотидных праймеров и зондов, что и для цкПЦР.

Результаты

По данным МРТ-исследования головного мозга с контрастом «классическая» диффузная опухоль ствола выявлена у 7 пациентов (рис. 1 а). В 5 случаях опухоль располагалась исключительно в области моста, а в 2 — распространялась на продолговатый мозг. Варианты накопления контраста варьировали от полного отсутствия (n=4) до точечного (n=2) или неравномерного его накопления (n=1) (табл. 1, см. рис. 1 а)

Таблица 1. Сводная таблица данных исследуемой группы пациентов

Примечание. диф. — диффузная опухоль; отгр. — отграниченная опухоль; диф./отгр. — промежуточная форма опухоли; СМ — средний мозг; М — мост; ПМ — продолговатый мозг; СТБ — стереотаксическая биопсия; СУ — субтотальное удаление; ЧУ — частичное удаление; ОБ — открытая биопсия; ГБ — глиобластома; ДСГ — диффузная срединная глиома; ДА — диффузная астроцитома; АТРО — атипичная тератоидно-рабдоидная опухоль.

Рис. 1. Магнитно-резонансные томограммы, варианты опухолей ствола в исследуемой группе пациентов.

а — «классическая» диффузная опухоль ствола мозга; магнитно-резонансная томограмма, Т2 — образование гетерогенного сигнала на фоне увеличенного в размере и деформированного ствола мозга; б — «смешанная» структура опухоли ствола; магнитно-резонансная томограмма, Т1+контраст, на фоне диффузного изменения сигнала визуализируется участок ограниченного сигнала, накапливающий контраст в виде «кольца»; в — «магнитно-резонансно отграниченная» опухоль; магнитно-резонансная томограмма, Т2 — отграниченное образование повышенного сигнала покрышки моста мозга слева.

В 5 случаях опухоли, обнаруженные при МРТ, можно было охарактеризовать как «смешанные». В этих наблюдениях, наряду с зоной «классического» диффузного изменения сигнала, в опухоли фиксировали участок отграниченного изменения сигнала. В этих «МР-отграниченных» участках опухоли контрастное вещество накапливалось в виде «кольца», в то время как в остальной диффузной части опухоли накопление контраста отсутствовало (рис. 1 б).

У 4 пациентов с опухолями, локализованными исключительно в покрышке ствола, МР-сигнал в режиме Т2 и FLAIR можно было описать как отграниченный (рис. 1 в). Эти образования либо не накапливали контраст (n=2), либо накаливали его по периферии в виде «кольца» (n=2).

Явной корреляции между давностью заболевания и МРТ-характеристиками опухоли не прослеживалось; у большинства пациентов (n=10) она составила более 2 мес (Me~2,5 мес).

Клинически заболевание преимущественно проявлялось головными болями (n=9), вестибулярным синдромом (головокружение, n=8), атаксией (n=8), глазодвигательными нарушениями (n=4) и пирамидной симптоматикой (n=4).

Ткань опухоли для морфологического и молекулярно-генетического анализа получена у 14 пациентов. У 6 больных с МР-картиной «классической» диффузной опухоли ствола выполнена стереотаксическая биопсия (СТБ) из прекоронарной точки. У пациентов со «смешанными» формами в 2 случаях проведена открытая биопсия, а в 2 — частичное удаление. У 3 пациентов, у которых опухоль локализовалась исключительно в покрышке ствола и была отграничена по данным МРТ, произведено субтотальное ее удаление.

Гистологическое исследование биопсионного материала выявило глиомы различной степени злокачественности (n=13) и атипичную тератоидно-рабдоидную опухоль (n=1) (см. табл. 1). Молекулярно-генетическое исследование позволило обнаружить онкогенную миссенс-мутацию H3F3A K28M, также известную под названием H3 K27M, у 5 пациентов с морфологическим диагнозом «диффузная астроцитома» и у одного пациента с диагнозом «глиобластома», в связи с чем интегральный диагноз у них звучал как диффузная срединная глиома с альтерацией H3 K27 (n=6) (см. табл. 1). Генетических вариантов в кодоне 600 гена BRAF не было выявлено ни в одном случае.

СцДНК из СМЖ в количестве, необходимом для проведения анализа, получена во всех 16 случаях, что подтверждено наличием амплификации аллеля, не несущего мутацию (аллеля «дикого типа»). Мутация BRAF V600E не выявлена ни в одном случае. Онкогенная миссенс-мутация H3F3A K28M определялась в 5 образцах сцДНК, полученных от 14 пациентов, у которых молекулярно-генетическое исследование ткани опухоли и сцДНК осуществлено в параллели (рис. 2). В 8 случаях указанная мутация не выявлена ни в ликворе, ни в ткани опухоли. Только у одного пациента онкогенный вариант H3F3A K28M, определенный в ткани опухоли, не подтвержден при исследовании СМЖ, что объясняется меньшей аналитической чувствительностью метода жидкостной биопсии. Таким образом, общая конкордантность выявления мутации H3F3A K28M в ликворе и ткани опухоли составила 92,9% (13/14). У двух пациентов, которым стандартная биопсия выполнена не была, мутация H3F3A K28M в ликворе не определялась (см. табл. 1).

Рис. 2. Детекция мутации H3F3A Lys28Met (K27M) методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции.

Капли, в которых произошла амплификация мутантного аллеля, обозначены синим цветом, амплификация аллеля «дикого типа» — зеленым цветом.

Обсуждение

Диффузные опухоли ствола головного мозга представляют собой онкологическое заболевание, стандартом лечения которого в настоящее время является только лучевая терапия. Назначается она без предварительной верификации клеточной структуры опухоли, не говоря уже о ее молекулярно-генетическом профиле. Это происходит из-за того, что хирургическое удаление данных опухолей неосуществимо, а проведение биопсии, стереотаксической или открытой, считается малоприемлемым многими специалистами из-за достаточной информативности МРТ и высокого риска неврологических осложнений после хирургических вмешательств. Кроме того, биопсия небольшого фрагмента опухоли может оказаться неинформативной из-за ее гетерогенности [1, 8].

Жидкостная биопсия — это малоинвазивная альтернатива традиционным методам биопсии, позволяющая получить информацию о молекулярных маркерах опухоли. В основе метода лежит анализ следовых количеств ДНК опухолевых клеток, свободно циркулирующих в крови, слюне и СМЖ.

На сегодняшний день описаны способы выделения циркулирующей опухолевой ДНК, микро-РНК, внеклеточных везикул и экзосом опухолевых клеток. Возможности выявления в них специфических мутаций или характерного генетического профиля помогают в постановке диагноза и оценке динамики заболевания, а также могут служить маркером чувствительности к проводимой терапии (лучевая терапия, химиотерапия, таргетная терапия). При этом специфичность и чувствительность методики жидкостной биопсии при исследовании опухолей центральной нервной системы (ЦНС) до конца не изучены.

Лишь в единичных публикациях приводятся данные, сопоставляющие исследование мутаций H3F3A K28M в биопсионном материале и СМЖ при опухолях ЦНС, но анализируемые группы пациентов разнородны как по морфологии опухолей, так и по их топографии, что не позволяет считать приводимые результаты о чувствительности метода (55,5%) надежными [8]. В настоящее время в литературе отсутствуют сведения о сравнении результатов жидкостной и тканевой биопсии у взрослых пациентов с диффузными опухолями ствола, что не позволяет утверждать о взаимозаменяемости этих методов [9—11].

СМЖ считается наиболее приемлемой биологической средой для исследования сцДНК в диагностике опухолей ЦНС [5, 6]. Использование иных сред, например, плазмы крови, менее эффективно из-за гематоэнцефалического барьера (зачастую, интактного при глиальных опухолях ствола головного мозга), который препятствует распространению циркулирующих опухолевых клеток и сцДНК [6, 12—14]. Но, по данным литературы, показатели чувствительности жидкостной биопсии ликвора при опухолях ЦНС сильно разнятся — от 39 до 95% (табл. 2).

Таблица 2. Чувствительность жидкостной биопсии при исследовании сцДНК в ликворе у взрослых пациентов с глиомами ЦНС по данным литературы

Такая вариабельность публикуемых данных обусловлена разными подходами в сборе и хранении образца для дальнейшего его изучения, а также различными методами выделения сцДНК и определения мутаций (аллель-специфическая ПЦР или высокопроизводительное секвенирование) [12, 15—24].

Считается, что люмбальный ликвор менее информативный источник сцДНК, чем вентрикулярный. Так, в литературе указывается, что в ликворе, полученном в ходе операции из желудочков мозга, концентрация сцДНК и вероятность выявления мутации H3K27M выше, чем в люмбальном ликворе [8], но при этом забор люмбального ликвора в этих исследованиях не был унифицирован (от 1 мл до 3,5 мл), а в ряде случаев производился уже после хирургического вмешательства, когда концентрация сцДНК была уже значимо снижена [17, 18].

Вопрос минимального необходимого объема ликвора для проведения исследования является важным, поскольку он существенно влияет на чувствительность метода «жидкостная биопсия». Однако в большинстве публикаций объем собранного материала для проведения исследований не уточняется [6, 23—25], что оставляет вопрос о необходимом минимальном объеме ликвора для получения сцДНК открытым и требующим дальнейшего исследования.

В 2009 г. C.E. Teunissen и соавт. предложили протокол забора люмбального ликвора для изучения сцДНК в минимальном объеме 12 мл, но этот алгоритм не нашел широкого применения на практике из-за риска развития постпункционного синдрома, который встречается от 3 до 7,5% случаев при заборе большого объема СМЖ [5, 17].

В нашей серии объем СМЖ (10 мл для взрослых и 5 мл для пациентов детского возраста) выбран эмпирически. Ни в одном из случаев мы не наблюдали постпункционных осложнений, и во всех наблюдениях (n=16, 100%) нам удалось выделить из ликвора сцДНК для дальнейшего ее изучения.

Циркуляция СМЖ является до конца неизученным и сложным физиологическим процессом. При локализации опухоли в головном мозге сцДНК может не попадать в субарахноидальное пространство поясничной области. При люмбальной пункции формируется нисходящий ток СМЖ, и взятие большего объема ликвора увеличивает вероятность попадания циркулирующей опухолевой ДНК в материал. Ряд авторов в своих публикациях уже указывали на такую особенность, как изменение градиента вещества по мере тока СМЖ [18, 25, 26].

Очевидно, что вентрикулярный ликвор при опухолях головного мозга должен содержать большее количество сцДНК, чем люмбальный, но это «преимущество» можно нивелировать количеством получаемой СМЖ при люмбальной пункции. Более того, люмбальную пункцию можно выполнить в амбулаторных условиях, как было в наших 2 наблюдениях, что существенно расширяет диагностическую доступность метода жидкостной биопсии.

В 2021 г. Всемирная организация здравоохранения внесла изменения в классификацию опухолей, вводя новое понятие — «диффузная глиома средней линии с изменением H3 K27M». Ранее данное заболевание называлось диффузной срединной глиомой с мутацией H3 K27 в классификации Всемирной организации здравоохранения 2016 г. или DIPG (диффузная глиома моста) до 2016 г. Этот тип опухоли, который чаще обнаруживается у детей, характеризуется высокой степенью злокачественности и неблагоприятным прогнозом. У детей она чаще локализуется в стволе мозга, а у взрослых — в таламусе [27—29].

Жидкостная биопсия является методом, который может обеспечить своевременную и минимально инвазивную диагностику данной патологии. Проведенное нами исследование и полученный результат (конкордантность выявления мутации H3F3A K28M в люмбальном ликворе и ткани 92,9% у пациентов с опухолями ствола мозга) продемонстрировали высокую эффективность этого метода для обнаружения мутации H3F3A K28M в ликворе у пациентов с опухолями ствола мозга, что делает его перспективным средством для малоинвазивной диагностики диффузных глиом средней линии (diffuse midline glioma).

Заключение

Длительное время правильный морфологический диагноз являлся «краеугольным камнем» в онкологии. На нем были основаны классификации опухолей и схемы их лечения. Но сегодня, помимо клеточного строения опухоли, важно знать и ее молекулярно-генетическую структуру, из-за чего последняя классификация Всемирной организации здравоохранения опухолей ЦНС стала более молекулярно-направленной, и диагноз первичных опухолей мозга перестал быть только гистологическим [29].

Такой подход привел к выделению новой группы опухолей ствола головного мозга — диффузные срединные глиомы (diffuse midline glioma). Эти образования характеризует мутация K28M в генах H3F3A (гистон H3.3, 75%) и реже в H3C3 (гистон H3.1, 25%) независимо от их морфологической структуры.

Малоинвазивная методика жидкостной биопсии позволяет улучшить диагностику глиальных опухолей ствола. Выявление мутации H3F3A K28M в сцДНК, полученной из люмбального ликвора, дает возможность выставить диагноз «диффузная срединная глиома ствола» без гистологической верификации, но при этом отсутствие обнаруженной мутации однозначно не исключает данный диагноз и требует рассмотрения вопроса о проведении стандартной биопсии, особенно в случаях нетипичной МРТ-картины.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Гаврюшин А.В., Папуша Л.И., Хухлаева Е.А., Веселков А.А.

Сбор и обработка материала — Веселков А.А.

Написание текста — Гаврюшин А.В., Хухлаева Е.А., Веселков А.А.

Редактирование — Гаврюшин А.В., Веселков А.А., Зайцева М.А., Хухлаева Е.А., Коновалов А.Н., Друй А.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Статья представляет собой первичные результаты собственных исследований по теме диагностики стволовых новообразований головного мозга. Проведенный авторами анализ новой методики неинвазивной альтернативы традиционным методам биопсии показал ее высокую информативность. Значимым достоинством методики жидкостной биопсии, предлагаемой авторами, является возможность получения образцов из различных отделов, что позволяет избежать рисков, связанных с инвазивными процедурами. Кроме того, этот метод дает возможность получить информацию о мутациях генов и других биомаркерах, которые могут быть связаны с развитием опухолей. Методика жидкостной биопсии является высокоинформативной для выявления специфической мутации H3F3A K28M и позволяет в значительной доле случаев верифицировать диагноз диффузной срединной глиомы без проведения стандартной биопсии. Появление практически неинвазивного метода диагностики и возможностей в перспективе таргетной терапии позволяет «увидеть луч света» в лечении настолько сложной группы новообразований, как опухоли ствола головного мозга. Статья представляет безусловный интерес для онкологов, нейрохирургов, радиологов.

В.Ю. Черебилло (Санкт-Петербург)