Скрининг на мутации TERTp методом цифровой капельной ПЦР коллекции из 52 парных образцов ДНК из плазмы крови и опухолевых тканей пациентов с глиобластомой

ПЦР — полимеразная цепная реакция

цкПЦР — цифровая капельная ПЦР

ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

TERT — обратная транскриптаза теломеразы

TERTp — промоторная область гена TERT

МАФ — мутантная аллельная фракция

РНК — рибонуклеиновая кислота

вкДНК — внеклеточная ДНК

цоДНК — циркулирующая опухолевая ДНК

WT — ДНК дикого типа

MT — ДНК мутантного типа

NTC — контрольная реакция без добавления матрицы ДНК

Глиомы — это наиболее часто встречающаяся группа опухолевых заболеваний ЦНС. Они составляют до 30% всех первичных опухолей головного мозга и около 80% всех злокачественных опухолей ЦНС. Одной из наиболее распространенных и злокачественных форм глиомы является глиобластома, которая характеризуется высокой агрессивностью, сложностью в лечении и крайне неблагоприятным прогнозом общей выживаемости [1]. Терапия и диагностика глиом также сопряжена с рядом трудностей, вызванных наличием ГЭБ, гетерогенностью, отсутствием достаточного количества биомаркеров для характеризации глиом средней степени злокачественности [2].

Молекулярная диагностика играет ключевую роль в персонализированном подходе к лечению глиом, позволяя уточнить прогноз и подобрать наиболее эффективную терапию. По установленному мутационному статусу тех или иных биомаркеров можно с высокой точностью поставить правильный диагноз. Для повышения возможностей терапии и применения подхода персонализированной медицины необходимо создание неинвазивных методов диагностики по биомаркерам глиом с первоочередностью для глиобластом [3].

К значимым биомаркерам, связанным с прогнозом и прогрессией глиом, относятся мутации в промоторной области гена TERT, или TERTp. Мутации C228T и C250T TERTp являются ключевыми биомаркерами для определения мутационного статуса промоторной области гена TERT и значимы для дифференциальной диагностики глиом высокой степени злокачественности (WHO Grade II, III) согласно классификации ВОЗ от 2021 г. (WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System, 5th edition) [4].

Мутации TERTp C228T и C250T считаются «драйверными», так как они стимулируют биосинтез матричной РНК TERT, после трансляции которой происходит образование активного теломеразного комплекса, способствующего поддержанию длины теломер. Исследования показывают, что у 60—80% пациентов с глиобластомой и некоторыми другими высокоагрессивными формами глиом, такими как анапластические олигодендроглиомы и астроцитомы, выявляются мутации TERTp [5]. В литературе четко установлена взаимосвязь между уровнем малигнизации глиомы и представленностью данных мутаций TERTp, что нашло свое отражение в классификации ВОЗ [6].

В медицинской диагностике особый интерес представляет развитие неинвазивных методов определения мутационных статусов биомаркеров с целью быстрой постановки более точных диагнозов и в качестве существенной альтернативы для инвазивных методов в случае, когда использование последних неоправданно по тем или иным причинам [7].

У пациентов с глиобластомой наблюдается повышенный уровень вкДНК по нескольким причинам, связанным с особенностями онкогенеза опухоли. До первичного хирургического вмешательства у пациентов с диагнозом глиобластомы концентрация вкДНК в плазме крови была выше, чем у сопоставимых по возрасту здоровых людей (в среднем 13,4 нг/мл против 6,7 нг/мл, p<0,001). Концентрация вкДНК в плазме крови также коррелировала с рентгенографическим объемом опухоли при первом послелучевом МРТ-исследовании (ρ=0,77, p=0,003) и имела тенденцию к повышению до рентгенографической прогрессии опухоли или одновременно с ней [8]. В работе J.J. Jones и соавт. обнаружено, что средняя концентрация вкДНК значимо увеличивается с ростом степени опухоли (p=0,0067): 11,94 нг/мл в глиомах 2-й степени, 14,29 нг/мл в глиомах 3-й степени и 18,55 нг/мл в глиомах 4-й степени согласно классификации ВОЗ [9]. цоДНК выделяется из раковых клеток по различным причинам и составляет небольшую (0,1—5%) часть от общего количества вкДНК, что определяет требования к методам обнаружения ДНК, несущей опухолевые мутации [10].

Цифровая ПЦР и цкПЦР составляют группу методов, отличающихся высокой точностью и чувствительностью обнаружения мутаций в случаях, когда концентрация цоДНК низкая и традиционные методы не подходят. Так, в работе J. Ge и соавт. показана возможность определять мутации TERT на уровне 0,1% МАФ при анализе выборки из 80 пациентов с глиомами [11]. Во всех вариациях цифровых ПЦР молекулы ДНК распределяются по микрореакторам (капли эмульсии либо микроячейки специального пластикового картриджа), что позволяет определять опухолевую ДНК на уровне отдельных молекул. Этот метод перспективен для диагностики мутаций TERTp в образцах крови, для неинвазивного мониторинга. Метод может быть особенно полезен в клинической практике характеризации опухолевых поражений ЦНС, а именно глиом, поскольку отличается высокой специфичностью, чувствительностью, точностью, устойчивостью к ингибиторам ПЦР, сниженными требованиям к TaqMan-системе (по сравнению с ПЦР в реальном времени) [12, 13].

Ранее была показана возможность определения мутаций TERTp с помощью высокочувствительных методов в случае жидкостной биопсии в терапии и диагностике педиатрических глиом [14]. В упомянутой работе J.J. Jones и соавт. метод цкПЦР применили для поиска мутаций TERTp в плазме крови взрослых пациентов с глиобластомами. Была установлена однозначная зависимость повышения содержания вкДНК в плазме крови от степени прогрессирования заболевания [9].

В данной работе была использована система, ранее разработанная и описанная M.I. Hosen и соавт., для определения точечных мутаций TERTp при неинвазивной молекулярной диагностике рака мочевого пузыря [15]. M. Zvereva и соавт. разработали подход для выявления мутаций TERTp (C228T, C228A, CC242-243TT и C250T) и детализировали цкПЦР-методики для определения мутаций C228T и C250T в ДНК, содержащейся в моче [16]. Система была адаптирована для определения мутаций в клетках глиом. В.Д. Макарова и соавт. провели сравнение методов ПЦР в реальном времени и цкПЦР для определения мутаций TERTp с разными системами детектирующих зондов, показано преимущество метода цкПЦР для анализа глиом [17].

В нашей работе была проведена проверка возможности создания неинвазивной системы для диагностики на основе определения мутаций C228T и C250T TERTp методом цкПЦР в ДНК плазмы крови и парных опухолевых образцах на примере глиобластомы (4-й степени злокачественности согласно классификации ВОЗ) для российской когорты из 52 пациентов.

В рамках исследования парных образцов на наличие мутаций TERTp C228T и C250T были отобраны 52 пациента с диагнозом глиобластомы. У каждого пациента была проведена процедура забора крови из вены перед началом операции. Минимум 4—5 мл венозной крови собирали в вакуумные пробирки EDTA K3 Tube (Granat Biotech, Россия), чтобы получить не менее 2 мл плазмы крови. Отобранную кровь центрифугировали при 1500—2000g в течение 15 мин и в течение 2 ч с момента получения для предотвращения деградации вкДНК. Супернатант отделяли от фракции эритроцитов и лимфоцитов и центрифугировали при 12 000g в течение 15 мин при 4°C, чтобы получить очищенную плазму крови. Плазму (не менее 2 мл) отделяли от остатков лимфоцитов в пробирку Eppendorf на 2 мл и хранили при температуре −25°C.

Из 2 мл образцов плазмы вкДНК выделяли с помощью набора MagicPure Cell-Free DNA Kit (Transgen Biotech, Китай) по инструкции производителя. Количественное определение ДНК проводили с помощью спектрофлуориметра (Qubit 4 Fluorometer, Thermo Fisher Scientific, США) с использованием высокочувствительного набора для количественной оценки ДНК и РНК Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Образцы вкДНК хранили при температуре −20°C.

Образцы опухолевой ткани были получены от пациентов во время операции и после процедуры криоконсервации хранились в жидком азоте. Из образцов ткани 52 пациентов отбирали фрагмент массой 20—30 мг, из которого выделяли ДНК. Геномная ДНК из опухолевых тканей была получена с помощью наборов для выделения ДНК QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия) и Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB, США) по протоколу производителя. Количественное определение ДНК проводили с помощью микроспектрофотометра (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific, США). Была измерена концентрация полученной ДНК и определены показатели чистоты ДНК A260/A280 и A260/A230. Критерий качества образца ДНК A260/A280 и A260/A230 для анализа цкПЦР составил ≥1,8 и ≥2. Далее образцы хранили при −40°C.

Для определения мутационного статуса TERTp (мутации C228T и C250T) взяли пары праймеров и флуоресцентно-меченных зондов, каждый из которых комплементарен последовательности WT и MT. В качестве флуоресцентной метки 5′-концы зондов WT и MT содержали гексахлорфлуоресцеин (HEX) и 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) соответственно. 3′-концы зондов содержали BHQ1-группы в качестве тушителя зонда. Были использованы следующие праймеры: TERT_fw1 — CCCTCCCGGGTCC, TERT_rev1 — CCGCGGAAAGGAAGG, TERT_fw2 — CTTCACCTTCCAGCTCC, TERT_rev2 — GAGGGCCCGGAGG с длиной ампликонов 64 п.н. и 88 п.н. соответственно. Для детектирования WT и MT вариантов взяли: TERT C228T Wt зонд — HEX-CGGAgGGGGCTGG-BHQ1, TERT C228T Mt зонд — FAM-CCCGGAaGGGGCTG-BHQ1, TERT C250T Wt зонд — HEX-ACCCGGgAGGGGT-BHQ1, TERT C250T Mt зонд — FAM-CCCGGaAGGGGTCG-BHQ1. Праймеры и зонды были взяты из работы авторов [17] и синтезированы по заказу («Гентерра», Россия).

При постановке цкПЦР был использован универсальный мастер-микс RainSure 3 (Rainsure Scientific, Китай) для детекции с зондами согласно стандартному протоколу производителя. Полученные парные образцы ДНК из опухолевых тканей и плазмы крови были проанализированы по схожему протоколу. Приготовленные реакционные смеси для каждого парного образца содержали следующие компоненты в конечной точке смеси: 11 мкл 2x концентрированной смеси цкПЦР Supermix для зондов, 900 нМ прямого праймера, 900 нМ обратного праймера, 250 нМ каждого типа зондов в паре WT/MT, 10 ед. акт. RsaI («СибЭнзим», Россия), 200 мМ 7-деаза-dGTP, (Biosan/Biolabmix, Россия), 30 нг геномной ДНК из опухолевых образцов или 1,5—3 нг выделенной вкДНК из плазмы крови (соответствует 3 мкл выделенной вкДНК), воду до общего объема реакции в 22 мкл. ПЦР проводили на термоциклере T100 (Bio-Rad Laboratories Inc., США). Количественный анализ флуоресценции в каждой капле по двум каналам проводили с помощью системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories Inc., США).

Протокол амплификации состоял из следующих этапов: 1) активация фермента при 95°C в течение 10 мин; 2) 40 циклов амплификации: денатурация при 94°C в течение 30 с и отжиг-элонгация при 54°C в течение 1 мин; 3) деактивация фермента при 98°C в течение 10 мин; 4) хранение при 4°C. Скорость изменения температуры на этапе отжига составляла 2°C/с. Для каждой мутации, C228T или C250T, использовали положительный и отрицательный контроль. В качестве положительных контролей к тестам на C228T и C250T были использованы геномные ДНК клеточных культур G-01 и Bu73, полученные в НМИЦ им. акад. Н.Н. Бурденко и охарактеризованные нами ранее [17].

Для определения базовой линии использовали воду, в которой подтверждено отсутствие ДНК. Базовую линию установили на уровне сигнала контрольной реакции без добавления матрицы ДНК, non template control (NTC). Расчет данных проводился по числу копий ДНК в 1 мкл реакции. Данные образцов, где количество уникальных зарегистрированных событий флуоресценции по 2 каналам FAM и HEX было менее сигнала NTC или равно ему, исключили из анализа. Также были исключены данные с отрицательным числом копий. Расчет МАФ по числу копий проводился исходя из отношения количества мутантной ДНК к сумме ДНК мутантного и дикого типов (МАФ=MT/(MT+WT)), вычисленных в программе QuantaSoft v. 1.7.4 при анализе данных цкПЦР в двух каналах, FAM и HEX. Сигналы флуоресценции зондов для определения вариантов копий WT (HEX-канал) или MT (FAM-канал) в исследуемом образце ДНК в зависимости от распределения по положительному и отрицательному сигналу зондов соответствовали количеству обнаруженных вариантов WT или MT.

С целью визуализации данных анализа цкПЦР построены графики типа violin-plot, на которых можно увидеть соотношение количества полученных ДНК WT и MT в зависимости от исходных параметров. Статистический анализ данных проводился с помощью DATATab Statistics Calculator (https://datatab.net).

Диапазон концентраций полученной геномной ДНК из опухолевой ткани составил в среднем 251±237 нг/мкл. Диапазон концентраций полученной вкДНК из плазмы крови пациентов составил в среднем 0,65±0,34 нг/мкл и варьировал в пределах 0,4—1,2 нг/мкл, что соответствует концентрациям геномной и вкДНК в опубликованных работах [9, 10, 14]. Все образцы прошли контроль качества выделения по соотношению оптической плотности, и все образцы были использованы в анализе цкПЦР.

Методом цкПЦР при анализе выборки из 52 парных образцов ДНК (плазма — ткань) пациентов было показано наличие мутаций C228T и C250T в опухолевых образцах: C228T была обнаружена в 33 (63,5%) случаях, C250T — в 14 (26,9%) случаях (таблица). В образцах вкДНК было показано наличие 5 образцов с мутацией C228T и 3 образцов с мутацией C250T. Мутация C228T была обнаружена в 5 (15,1%) из 33 случаев, мутация C250T — в 3 (21,4%) из 14 случаев. Мутации в образцах вкДНК были обнаружены только в образцах плазмы пациентов, у которых такие мутации были обнаружены в опухолевых образцах.

Пример полученных результатов при анализе на наличие мутации C250T геномной ДНК опухолевых образцов тканей и вкДНК плазмы, а также NTC представлен на рис. 1а—1в соответственно. Каждая точка на рисунке отражает уникальное событие регистрации измерения флуоресценции по двум каналам, FAM|HEX, в каждой капле.

Рис. 1. Цифровая капельная полимеразная цепная реакция парных образцов ДНК на TaqMan-зондах с флуоресцентной детекцией по двум каналам (FAM|HEX).

а — ДНК из образцов опухолей; б — внеклеточная ДНК; в — контрольная реакция без добавления матрицы ДНК (NTC).

Проиллюстрирован пример результатов анализа цифровой капельной полимеразной цепной реакции на наличие мутаций C228T в парных образцах ДНК и в контрольной пробе (NTC). Область точек зеленого цвета соответствует кластеру событий, положительных по гексахлорфлуоресцеину (HEX), что соответствует ДНК дикого типа (WT). Область точек синего цвета — кластер событий, положительных по 6-карбоксифлуоресцеину (FAM), что соответствует ДНК мутантного типа (MT). Область точек оранжевого цвета — кластер событий, положительных одновременно по FAM и HEX. Область точек черного цвета отражает кластер событий, в которых не обнаружено сигнала ни по FAM-каналу, ни по HEX-каналу.

В программе можно проводить расчет как по числу копий ДНК, так и по числу событий, при которых было зарегистрировано явление флуоресценции в 2 каналах — FAM и HEX, чтобы соотнести результаты с наличием TERTp-положительных мутаций в исследуемом образце ДНК. В случае анализа мутаций C228T в образцах ДНК ткани опухоли NTC составил 231 событие MT, или концентрацию 19,9 копии/мкл MT в реакции, и 293 события для WT, или концентрацию 25,4 копии/мкл WT в реакции. При анализе мутаций C250T NTC составил 1 событие MT, или концентрацию 0,8 копии/мкл MT в реакции, и 48 событий для WT, или концентрацию 48,2 коп/мкл в реакции. Все данные по числу событий и копий были исправлены с учетом этих выявленных данных NTC.

Данные о количестве зарегистрированных положительных событий представлены на рис. 2. Для каждого образца была рассчитана МАФ. Для достоверного отнесения образцов к положительному результату обнаружения мутации была выбрана граница МАФ 4%.

Рис. 2. Разница в количестве регистрируемых положительных событий при анализе методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции в зависимости от источника ДНК при сопоставлении образцов парной коллекции.

Данные по дикому типу ДНК (WT) и мутантному типу ДНК (MT) приведены с поправкой на величину фона, полученную в контрольной реакции без матрицы ДНК (NTC).

Результаты распределения TERTp-положительных мутаций в коллекции 52 парных образцов представлены в таблице.

Распределение TERTp-мутаций в коллекции 52 парных (плазма — ткань опухоли) образцов

В работе проведен скрининг методом цкПЦР коллекции пар клинических образцов ДНК из тканей опухолей ЦНС и плазмы крови 52 пациентов на предмет наличия мутаций C228T и C250T TERTp. Уровень диагностированных концентраций вкДНК, определенных с помощью флуоресцентного метода на приборе Qubit 4.0 производителя ThermoFisher Scientific, находится в диапазоне концентраций, описанных ранее для больных с диагнозом глиобластомы [9]. Сопоставимость определенных нами концентраций внеклеточной ДНК с данными, представленными в литературе, свидетельствует об эффективности применяемого нами метода. Выявляемость снижается для двух мутаций одинаково — с 33 до 5 и с 14 до 3 соответственно, что свидетельствует о систематическом снижении, обусловленном прежде всего влиянием концентрации матрицы в реакции, а не снижением эффективности используемых праймеров и зондов.

Полученные результаты в сравнении с данными J.J. Jones и соавт. [9] позволяют сделать вывод о необходимости использования большего количества вкДНК в качестве исходной матрицы для цкПЦР или дополнительных систем амплификации, чтобы в получаемой из плазмы крови вкДНК содержалось достаточное количество фракции цоДНК для достоверного определения мутаций TERTp. Исходя из данных [9], для выявления мутаций TERTp в плазме крови с высокой специфичностью в подавляющем большинстве случаев требуется забор крови в объеме не менее 20 мл. Мутация C228T TERTp была обнаружена в плазменной вкДНК в 88% образцов, а вариант C250T — только в 49% образцов, полученных из выборки 19 пациентов с диагностированными глиомами, содержащими положительные мутации TERTp, подтвержденные методом секвенирования нового поколения (Next-Generation Sequencing — NGS).

Апробирована и показана возможность неинвазивного определения мутаций C228T и C250T TERTp в плазме крови пациентов с глиобластомой. Необходимо увеличение количества внеклеточной ДНК, используемой в анализе методом цифровой капельной полимеразной цепной реакции за счет повышения количества доступной плазмы пациента до 20 мл для повышения общего количества циркулирующей опухолевой ДНК или снижения уровня неспецифических событий для повышения чувствительности и специфичности метода.

Апробированный подход неинвазивной диагностики мутаций TERTp во внеклеточной ДНК плазмы крови пациентов с глиобластомой открывает новые возможности для клинического мониторинга опухоли и подбора персонализированной терапии в режиме реального времени.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-1343 от 04.10.2021)

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Зверева М.Э., Павлова Г.В., Пронин И.Н.

Сбор и обработка материала — Гасанов Т.Н., Писарев Э.К., Дрозд С.Ф., Павлова С.А., Пантелеев Д.Ю.

Написание текста — Гасанов Т.Н., Зверева М.Э.

Редактирование — Гасанов Т.Н., Писарев Э.К., Сергеев А.В., Зверева М.Э.

Администрирование проекта — Зверева, М.Э., Павлова Г.В., Пронин И.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Статья Т.Н. Гасанова и соавт. посвящена разработке метода неинвазивной дифференциальной диагностики и молекулярно-генетической характеризации опухолевых поражений ЦНС для более точной постановки диагноза и подбора схемы терапии. Материалом для исследования служили 52 парных образца крови и опухолевой ткани пациентов с глиобластомой. Объектом исследования были драйверные мутации C228T и C250T в промоторной области каталитической субъединицы белка теломеразы (TERTp), поскольку нарушение регуляции экспрессии TERT часто сопряжено со злокачественной трансформацией тканей мозга. В качестве рабочей гипотезы авторы рассматривали корреляцию между детектируемыми мутациями в образцах ДНК из опухолевой ткани и внеклеточной ДНК плазмы крови. Дизайн эксперимента соответствует поставленной задаче, размер тестируемой выборки позволил выполнить статистический анализ полученных первичных данных.

Результатом проведенного исследования стало обнаружение мутаций в образцах в следующем соотношении: C228T 63,5% и C250T 26,9% в опухолевых образцах и C228T 15,1% и C250T 21,4% в образцах внеклеточной ДНК плазмы крови. Анализ указанных мутаций проводили современным молекулярно-генетическим методом, а именно цифровой капельной ПЦР (цкПЦР) с использованием флуоресцентно-меченных TaqMan-зондов, что позволяет тестировать мутации в образцах с малым количеством ДНК-матрицы.

Комбинация современного метода анализа мутаций с грамотным подбором исследуемых образцов определяет новизну полученных результатов. Проведенное исследование показало, что указанный метод перспективен для неинвазивного мониторинга мутаций TERTp в образцах крови больных, при этом стадия выделения ДНК требует дальнейшей оптимизации, что отражено в выводах работы.

Статья представляет интерес для онкологов, разработчиков противоопухолевых препаратов, разработчиков тест-систем и молекулярных биологов, работающих в области канцерогенеза.

О.А. Коваль (Москва)