Введение
В 2020 г. Международная ассоциация по изучению боли (IASP) предложила новое определение понятия «боль» как неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, связанное с действительным или возможным повреждением тканей или схожее с таковым переживанием [1]. Боль — интегративная многокомпонентная реакция организма на повреждающее воздействие, а ее возникновение может быть обусловлено целым рядом этиологических факторов [2].
Согласно системным представлениям выделяют семь компонентов болевой реакции: поведенческий, перцептуальный, эмоционально-аффективный, вегетативный, двигательный, когнитивный, иммунный. Наиболее информативными показателями болевой чувствительности, используемыми в исследованиях, являются перцептуальный, который отражает собственно ощущение боли и позволяет определить локализацию повреждения, и эмоциональный, характеризующий эмоциональную реакцию на ноцицептивное воздействие [2].
Влияние стресса на болевую чувствительность было доказано в ряде исследований. Воздействие стрессогенных факторов может приводить к самым разным, в том числе противоположным изменениям ноцицепции, которые в значительной степени зависят от вида и продолжительности эмоциогенной нагрузки [3]. Для моделирования стрессорных реакций в экспериментальных условиях используются различные подходы. В частности, известно, что короткие и слабые стрессоры у млекопитающих приводят к ослаблению болевой чувствительности, а длительные и сильные стрессогенные факторы — к ее усилению [4—6]. В большинстве исследований влияния стресса на ноцицептивную чувствительность используется изолированный стрессогенный фактор. Основным недостатком такого подхода является возможное развитие адаптации и/или резистентности к повторяющемуся повреждающему воздействию. Выраженность адаптивных реакций зависит от вида, продолжительности и силы стрессовой нагрузки [7—9].
С целью предотвращения развития указанных выше процессов разработаны экспериментальные модели хронического непредсказуемого стресса. Они предполагают последовательное использование нескольких различных стрессоров — для исключения возможности адаптации к эмоциогенным повреждающим воздействиям. Одной из таких моделей является модель хронического непредсказуемого мягкого стресса (ХМС, CUMS), предложенная П. Виллнером и соавт. в 1987 г. [10]. Изучение характера изменений системной организации физиологических функций при многократных стрессовых нагрузках разного вида позволяет наиболее корректно экстраполировать результаты исследований на животных в области стресса на человека.
Необходимо отметить, что экспериментальные исследования в стрессологии предполагают обязательную верификацию формирования состояния стресса у подопытных животных. Согласно классическим представлениям, такой подход включает в себя, в частности, анализ колебаний интенсивности обменных процессов, массы органов-маркеров стресса и состояния слизистой оболочки желудка [11, 12]. Еще одним объективным критерием формирования состояния стресса у млекопитающих при отрицательных эмоциогенных воздействиях является изменение массы тела [13].
Целью нашей работы явилось изучение изменений одних из основных компонентов болевой чувствительности — перцептуального и эмоционального, а также массы тела у крыс как показателей развития стрессорного состояния организма после хронического непредсказуемого мягкого стресса разной длительности.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 64 крысах-самцах породы вистар с массой тела 180—200 г. Все крысы проходили период адаптации к условиям вивария ФГБНУ «НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина» в течение 5 дней после доставки из питомника (Столбовая). При проведении опытов руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (протокол №1 от 03.09.05), требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.
Крысы были распределены в 8 групп по 8 особей в каждой в соответствии с условиями эксперимента: 1) контроль/опыт; 2) длительность воздействия стрессогенных факторов 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней. Животные контрольных групп проходили процедуру хэндлинга с последующим нахождением в «домашних» клетках по 4 особи в каждой при температуре 20—22 °C в искусственных условиях освещения (9:00—21:00 — свет, 21:00—9:00 — темнота) на стандартном пищевом рационе питания и соответственно временным периодам опытных групп.
Крыс опытных групп в течение 1, 2, 3 или 4 нед подвергали семидневным циклам последовательно чередующихся низкоинтенсивных стрессорных воздействий на модифицированной модели хронического непредсказуемого мягкого стресса [10, 14]. К используемым стрессорам относились: наклон клетки 30° в течение 7 ч; дневное освещение — 17 ч; загрязненная клетка — 12 ч; питьевая депривация — 12 ч; пустая бутылка — 12 ч; пищевая депривация — 12 ч; тесная клетка (2 маленькие клетки по 4 крысы) — 12 ч; удаление опилок — 12 ч.
Физиологические показатели животных регистрировали в исходном состоянии и по окончании эксперимента. Массу тела измеряли на ветеринарных весах для взвешивания грызунов (арт. 9202.10; Soehnle Professional, Германия). Учитывая циркадные колебания болевых порогов у млекопитающих [15], показатели ноцицептивной чувствительности регистрировали в одно и то же время, в светлую фазу суток (13:00—16:00). Оценку перцептуального компонента ноцицепции у крыс осуществляли по латентному периоду реакции отведения хвоста (ЛПРОХ) в ответ на светотермальное раздражение (метод tail-flick), используя аппарат Tail-Flick Analgesia Meter 0104-301V (Columbus Instruments, США) [15]. Животных помещали в специальные пластиковые пеналы, после чего производили пять предъявлений болевого раздражителя; рассчитывали среднее значение ЛПРОХ в секундах у каждой особи. Эмоциональный компонент ноцицептивной чувствительности определяли по порогу вокализации (ПВ) крыс (мА) в ответ на электрокожное раздражение хвоста. Для этого на хвост животного фиксировали металлические кольцевые электроды электростимулятора SEN-3201 (Nihon Kohden, Япония). Использовали следующие параметры электростимуляции: частота 10 Гц, длительность импульса 0,5 мс. Силу тока постепенно увеличивали с 0,25 до 1 мА до появления у крыс реакции вокализации (писка) [16].
Статистическую и аналитическую обработку данных осуществляли с помощью пакетов программ Statistica 12.0 и Microsoft Office Excel 2021. Так как распределение полученных значений отличалось от нормального (по критерию Шапиро—Уилка), анализ различий между переменными проводили с применением непараметрических критериев: U-критерия Манна—Уитни и T-критерия Уилкоксона. Числовые данные приведены в виде медианы (Me), верхнего и нижнего квартилей (Q1; Q3).
Результаты
На первом этапе исследования изучены показатели эмоционального и перцептуального компонентов ноцицептивных реакций у крыс через разные временные периоды хронического стрессорного воздействия. Изменения указанных физиологических параметров анализировали по отношению к значениям у особей соответствующих экспериментальных групп в исходном состоянии. Числовые данные, отражающие полученные результаты, представлены в табл. 1, 2.
Таблица 1. Показатель эмоционального компонента ноцицепции (ПВ, мА) у крыс разных экспериментальных групп
| Экспериментальные группы | Исходно | По окончании исследования |
| Контроль — 1 нед | 0,6 (0,4; 0,8) | 0,4 (0,4; 0,6) |
| Стресс — 1 нед | 0,8 (0,6; 0,8) | 0,6 (0,4; 0,6)* |
| Контроль — 2 нед | 0,7 (0,6; 0,8) | 0,6 (0,4; 0,7) |
| Стресс — 2 нед | 0,6 (0,6; 0,8) | 0,6 (0,5; 0,6) |
| Контроль — 3 нед | 0,6 (0,6; 0,7) | 0,6 (0,6; 0,8) |
| Стресс — 3 нед | 0,75 (0,625; 0,85) | 0,6 (0,5; 0,8) |
| Контроль — 4 нед | 0,6 (0,45; 0,7) | 0,6 (0,4; 0,6) |
| Стресс — 4 нед | 0,8 (0,6; 1,0) | 0,6 (0,4; 0,8) |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей: Me (Q1; Q3). Здесь и в табл. 2: * — p<0,05 по сравнению с соответствующими показателями в исходном состоянии.
Таблица 2. Показатель перцептуального компонента ноцицепции (ЛПРОХ, с) у крыс разных экспериментальных групп
| Экспериментальные условия | Исходно | По окончании исследования |
| Контроль — 1 нед | 2,7 (2,6; 3,03) | 3,33 (3,07; 3,57)* |
| Стресс — 1 нед | 2,81 (2,63; 2,91) | 3,05 (2,9; 3,38) |
| Контроль — 2 нед | 3,05 (2,86;3,16) | 3,23 (3,0; 3,31) |
| Стресс — 2 нед | 3,26 (2,67; 3,53) | 3,13 (2,9; 3,21) |
| Контроль — 3 нед | 2,9 (2,68; 3,33) | 3,21 (2,13; 3,45) |
| Стресс — 3 нед | 3,27 (3,01; 3,44) | 2,95 (2,61; 3,33) |
| Контроль — 4 нед | 3,46 (3,27; 3,6) | 3,33 (2,65; 3,63) |
| Стресс — 4 нед | 3,56 (2,9; 3,72) | 3,4 (3,13; 3,43) |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей: Me (Q1; Q3).
При повторной регистрации показателя эмоционального компонента ноцицепции у контрольных крыс, не подвергнутых стрессорной нагрузке, статистически значимых изменений не обнаружено. ПВ животных в ответ на электрокожное раздражение хвоста через 1 нед и 2 нед содержания в «домашних» клетках несколько снижался (на 43,3 и 14,3% соответственно; p>0,05), а через 3 нед и 4 нед не отличался от исходных значений.
Установлено, что через 1 нед хронического мягкого стресса у крыс происходит статистически значимое снижение ПВ (на 25,0%; p<0,05). В другие изученные периоды стресса достоверных изменений показателя эмоционального компонента болевой чувствительности не выявлено. Через 2 нед чередующихся стрессорных воздействий ПВ животных не отличался, а через 3 нед и 4 нед ПВ был незначительно меньше исходных значений (на 20,0 и 25,0% соответственно; p>0,05).
В ходе изучения показателя перцептуального компонента ноцицепции у крыс получены следующие результаты. У контрольных особей при повторной регистрации через 1 нед установлено статистическое значимое увеличение ЛПРОХ в ответ на светотермальное раздражение хвоста — на 23,7% по сравнению с исходными значениями (p<0,05). Данный показатель несколько возрастал через 2 нед и 3 нед (на 5,9 и 10,6% соответственно), но снижался через 4 нед наблюдений (на 3,8%). Однако эти колебания не были статистически значимы.
Продемонстрировано, что хроническая мягкая стрессорная нагрузка разной длительности не приводит к достоверным изменениям показателя перцептуального компонента болевой чувствительности у крыс. Выявлена лишь тенденция к возрастанию ЛПРОХ животных через 1 нед (на 8,9%), но через 2, 3 и 4 нед чередующихся воздействий имелось снижение ЛПРОХ (на 4,0; 9,8 и 4,5% соответственно).
На следующем этапе работы были изучены изменения массы тела крыс, подвергнутых хронической стрессорной нагрузке разной длительности. Числовые данные по указанному показателю у животных разных экспериментальных групп представлены в табл. 3.
Таблица 3. Масса тела крыс (г) разных экспериментальных групп
| Экспериментальные условия | Исходно | По окончании исследования |
| Контроль — 1 нед | 266 (240; 270) | 270 (250; 276)# |
| Стресс — 1 нед | 272,5 (195; 289) | 275 (235; 290) |
| Контроль — 2 нед | 246 (235;249) | 281,5 (279,5; 286)#$ |
| Стресс — 2 нед | 244 (233; 250) | 272 (263; 282,5)# |
| Контроль — 3 нед | 233,5 (228,5; 259,5) | 318,5 (313; 341)#$$∆ |
| Стресс — 3 нед | 233 (215,5; 245) | 278,5 (256; 292)**# |
| Контроль — 4 нед | 223,5 (214; 226) | 297,5 (283; 306)#$● |
| Стресс — 4 нед | 216 (207; 225,5) | 285 (279; 298)# |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей: Me (Q1; Q3). ** — p<0,005 по сравнению с аналогичной контрольной группой; # — p<0,05 по сравнению с соответствующими показателями в исходном состоянии; $ — p<0,05 и $$ — p<0,005 по сравнению с 1-недельной контрольной группой; ∆ — p<0,05 по сравнению с 2-недельной контрольной группой; ● — p<0,05 по сравнению с 3-недельной контрольной группой.
Животные контрольных групп характеризовались статистически значимым увеличением массы тела через 1, 2, 3 и 4 нед исследования по сравнению с исходными значениями (на 1,5; 14,4; 36,4 и 33,1% соответственно; p<0,05).
При проведении межгруппового анализа показателей массы тела у животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, были получены следующие результаты. Масса тела крыс, содержавшихся в контрольных условиях на протяжении 2, 3 и 4 нед, была значимо больше по сравнению с 1-недельной группой (на 4,2% (p<0,05), 17,9% (p<0,005) и 10,2% (p<0,05) соответственно). Аналогичные различия исследуемого показателя обнаружены между 3-недельным и 2-недельным контрольными периодами (на 13,1%; p<0,05).
Установлено, что масса тела животных через 1 нед хронического непредсказуемого мягкого стресса возрастала лишь незначительно по сравнению с исходными значениями (на 0,9%; p>0,05). В последующие периоды повторяющихся стрессорных воздействий — через 2, 3 и 4 нед масса тела крыс превышала исходные показатели на 11,9, 19,5 и 31,9% соответственно (p<0,05). При межгрупповом анализе массы тела животных, подвергнутых чередующимся стрессорным воздействиям, статистически значимых различий данного показателя через разные временные промежутки не обнаружено.
При сравнении массы тела стрессированных крыс с массой тела аналогичных по временным отрезкам контрольных особей получены следующие результаты. Масса тела крыс через 3 нед хронического стресса была на 12,6% меньше соответствующего показателя в 3-недельной контрольной группе (p<0,005). Однако через 1, 2 и 4 нед стрессорных нагрузок данный параметр не отличался от контрольных значений.
Обсуждение
В представленной работе изучен характер изменений перцептуального и эмоционального компонентов ноцицептивной чувствительности и массы тела крыс на модели хронического непредсказуемого мягкого стресса.
Установлено, что хронический непредсказуемый стресс приводит к снижению ПВ у крыс через 1 нед стрессорных воздействий, что указывает на усиление эмоционального компонента болевой чувствительности. Можно предположить, что условия переменной стрессогенности у млекопитающих приводят к росту эмоциональной лабильности, проявляющейся в усилении реакций на предъявление внешних стимулов, в том числе болевых. Полученные результаты дополняют представления об изменениях функциональной активности ноцицептивной системы при стрессорных воздействиях.
Нами выявлено, что перцептуальный компонент ноцицепции у крыс не изменяется в изученные временные периоды хронического мягкого стресса. Этот факт позволяет предположить отсутствие физиологического усиления распространения ноцицептивного возбуждения на уровне периферического звена системы оценки болевого потока в данных условиях. Полученные нами данные подтверждают описанные ранее механизмы восприятия болевого раздражителя. В частности, известно, что степень перцепции ноцицептивного стимула является достаточно стабильным показателем, усиление которого возможно только при воздействии сильного раздражителя [2].
В нашей работе обнаружено отсутствие прироста массы тела у животных через 1 нед непредсказуемых стрессорных воздействий по сравнению с исходными значениями (в отличие от контрольных особей). Наблюдающиеся особенности могут быть обусловлены развитием в данный промежуток времени второй стадии стресса по Г. Селье. Известно, что стресс протекает в три последовательные стадии: тревоги, резистентности и истощения [17]. При этом именно вторая стадия сопровождается гипертрофией надпочечников, появлением базофилов в гипофизе, атрофией гонад и, что наиболее важно, задержкой роста [18].
Необходимо отметить, что во все временные периоды хронического мягкого стресса нами обнаружено замедление темпа роста животных по сравнению с особями контрольных групп. Указанные изменения были более выраженными на 3-й неделе эксперимента. Полученные результаты не только согласуются с данными предыдущих исследований на модели хронического мягкого стресса, но и дополняют их [14, 19]. Предполагается, что подобные изменения массы тела могут косвенно свидетельствовать о развитии признаков снижения пищевой мотивации у животных в указанных экспериментальных условиях.
Заключение
Результаты наших исследований иллюстрируют специфическое влияние хронического непредсказуемого мягкого стресса у крыс на показатели ноцицепции и массы тела. Указанные изменения проявляются в усилении эмоционального компонента болевой чувствительности и отсутствии прироста массы тела исключительно в ранние сроки (1 нед) повторяющихся стрессорных нагрузок. Отсутствие значимых различий показателей ноцицепции у животных опытных и контрольных групп, а также возраст-зависимое увеличение массы тела крыс на 2—4-й неделе повторяющихся стрессорных воздействий (не достигающее, однако, показателей контроля) может быть обусловлено развитием адаптационно-компенсаторных процессов на более поздних стадиях хронического непредсказуемого стресса.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.