Введение
В конце 2019 г. произошла вспышка новой коронавирусной инфекции (COVID-19), возбудителем которой явился одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2). Всемирная организация здравоохранения охарактеризовала принявшее мировой масштаб распространение болезни как пандемию [1]. Коронавирусная инфекция COVID-19, потенциально жизненно угрожающая инфекция, представляет собой заболевание, которое может протекать как в легкой форме острой респираторной вирусной инфекции, так и в тяжелой форме — приблизительно у 15—25% пациентов, а летальный исход развивается в 4—15% наблюдений [2].
Тяжесть течения новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, во многом обусловлена развитием у больных иммунопатологического состояния [3]. Известно, что большинство вирусных инфекций сопровождается лимфоцитозом, однако при COVID-19 чаще отмечается выраженная относительная и абсолютная лимфопения и увеличение соотношения нейтрофилы/лимфоциты. При этом количество лимфоцитов в периферической крови коррелирует с тяжестью состояния пациента и является неблагоприятным диагностическим и прогностическим критерием [4]. Согласно данным литературы, у 85% пациентов с тяжелым течением COVID-19 отмечается лимфопения. Тяжелая форма COVID-19 связана со значительной гиперактивацией лимфоцитов, инфильтрацией органов и повреждением тканей, что предполагает широко распространенную и, возможно, пагубную иммунную активность [5]. Дифференцировке и коллапсу лимфоцитов может способствовать рецептор смерти CD95. Описывают повышенную экспрессию CD95 на лимфоцитах пациентов с COVID-19 и предполагают, что это может обусловить развитие лимфопении у больных с COVID-19, в том числе в связи с повышенным апоптозом лимфоцитов [6].
Цель исследования — провести анализ апоптотической гибели лимфоцитов и изменений белков — регуляторов программируемой смерти клеток у больных с тяжелым течением COVID-19.
Материал и методы
В исследование включили 93 пациента (мужчин — 42, женщин — 51) в возрасте от 28 до 91 года (медиана 58 лет, средний возраст 60,53±12,27 года), находившихся на лечении в реанимационных отделениях ГБУЗ «НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ».
Критерии включения в исследование: возраст пациентов старше 18 лет; подтвержденная вирусная инфекция, вызванная SARS-CoV-2 (результат полимеразной цепной реакции или характерная картина при компьютерной томографии — КТ); наличие пневмонии и необходимость пребывания в ОРИТ более 48 ч.
Состояние пациентов с COVID-19 в период цитокинового шторма оценивалось на основании разработанной клиническим комитетом Департамента здравоохранения города Москвы шкалы тяжести (табл. 1).
Таблица 1. Шкала оценки тяжести состояния пациентов с COVID-19
| Степень тяжести | T, °C | SpO2,% | КТ | C-реактивный белок | Фибриноген | D-димер | Ферритин | Лимфоциты, ∙109/л | ЛДГ |
| Легкая | N | N | 0 | N | N | N | N | N | N |
| Средняя | <37,8 | <95 | 1—2 | 20—50 | <4 | 1,5—2N | 1,5—3N | >0,9 | 1,5—2N |
| Тяжелая | 37,8—39 | <90 на нИВЛ, ВПО | 3 | 50—100 | 4—6 | 2—4N | 3—6N | 0,5—0,9 | 2—4N |
| Крайне тяжелая | >39 | <90 на ИВЛ, ЭКМО | 4 | >100 | >6 | >4N | >6N | <0,5 | >4N |
Примечание. КТ — компьютерная томография; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; нИВЛ — неинвазивная вентиляция легких; ИВЛ — искусственная вентиляция легких; ВПО — высокопоточная оксигенотерапия; ЭКМО — экстракорпоральная мембранная оксигенация.
Степень тяжести определяли по пяти и более показателям, соответствующим значениям табл. 1. Пациентам в возрасте старше 65 лет, а также при наличии декомпенсированных хронических заболеваний добавляли по одной степени. При поступлении пациента в стационар для оценки тяжести состояния использовали шкалу NEWS. Органную дисфункцию оценивали по шкале SOFA.
Всех обследованных пациентов в зависимости от степени тяжести и исхода заболевания распределили в три группы согласно критериям включения.
В 1-ю группу включили 53 пациента (29 мужчин и 24 женщины) с благоприятным течением и исходом заболевания. В этой группе преобладали пациенты с легким и среднетяжелым течением заболевания.
Во 2-ю группу включили 26 пациентов (7 мужчин, 19 женщин) с неблагоприятным течением и благоприятным исходом заболевания. Неблагоприятным течением заболевания считалась тяжелая и крайне тяжелая степень по шкале оценки степени тяжести заболевания, разработанной клиническим комитетом Департамента здравоохранения города Москвы.
В 3-ю группу вошли 14 пациентов (6 мужчин, 8 женщин) с неблагоприятным течением и исходом заболевания. Неблагоприятным исходом заболевания считалась оценка 4 балла и более по модифицированной шкале Рэнкина.
Забор крови для исследования маркеров апоптоза проводили на 5—12-е и на 14—18-е сутки от момента начала заболевания. Первая точка исследования ассоциирована с временным интервалом развития пика цитокинового шторма, и результаты лабораторных исследований совместно с клиническими данными на момент забора биологического материала характеризовали исходную тяжесть состояния пациента. Вторая точка исследования представляет собой период стихания клинико-лабораторной картины цитокинового шторма и выздоровление пациента, а в случае неблагоприятного течения происходит прогрессирование заболевания, также в этот период отмечается присоединение гнойно-септических осложнений и дальнейшее ухудшение состояния пациента.
У пациентов в венозной крови определяли общее число лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание лимфоцитов, концентрацию С-реактивного белка (СРБ), прокальцитонина, активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Методом проточной цитометрии оценивали количество лимфоцитов крови, экспрессирующих CD95 (Fas-рецептор) (норма 37,3—45,4%), число лимфоцитов на ранней (Annexin V+/7AAD–) и поздней (Annexin V+/7AAD+) стадиях апоптоза (норма 1,9—5,5% и 0,01—0,06% соответственно), число антигенпрезентирующих моноцитов с фенотипом CD14+HLA-DR+ (норма ≥80%). Регуляторные белки апоптоза (фосфорилированную АКТ, JNK, BAD, Bcl-2, p-53, активную каспазу-8 и -9) определяли в лизате лимфоцитов периферической крови с помощью наборов Milliplex map Kit Erly Apoptosis 7-plex Magnetic Bead Kit на платформе Luminex (Luminex Corporation, США). Значение каждого параметра представлено в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI, у.е.). Базовый уровень свечения составил: АКТ — 124 у.е., JNK — 190 у.е., BAD — 141 у.е., Bcl-2 — 18,6 у.е., каспаза-8 — 82,4 у.е., каспаза-9 — 29,0 у.е., p-53 — 350 у.е..
Статистический анализ данных проводили с помощью программного пакета Statistica 10 (StatSoft, Inc., США). В ходе статистической обработки данных определяли среднее значение, стандартное отклонение, для оценки различий в сравниваемых группах использовали критерий Краскела—Уоллиса для независимых выборок. При определении корреляционной зависимости использовали критерий Спирмена (r). Различия значений считали статистически значимыми при уровне значимости более 95% (p<0,05).
Результаты
Средняя продолжительность госпитализации пациентов 1-й группы составила 15,2±4,4 сут, 2-й группы — 30,5±14,6 сут, 3-й группы — 23,3±11,2 сут. Между группами во временном интервале цитокинового шторма выявлены статистически значимые различия (табл. 2).
Таблица 2. Клинико-лабораторные показатели пациентов исследуемых групп на пике цитокинового шторма
| Показатель | 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | p |
| Клинико-инструментальные показатели и шкалы | ||||
| Максимальная температура, °C | 37,99±0,51 38,0 (37,5; 38,3) | 38,76±0,35 38,9 (38,4; 39,0) | 39,01±0,33 39,0 (39,0; 39,3) | 0,001* |
| КТ | 1,65±0,61 2 (1; 2) | 2,88±0,55 3 (2; 3) | 3,43±0,74 4 (3; 4) | 0,001* |
| Оценка по шкале NEWS, баллы | 3,6±1,3 4 (2; 4) | 7,96±2,81 8 (5; 9) | 10,86±3,16 11,5 (10; 14) | 0,001* |
| Оценка по шкале SOFA, баллы | 0,9±0,5 1 (0; 1) | 3,3±0,8 3 (3; 4) | 4,9±0,6 5 (5; 5) | 0,001* |
| Лабораторные показатели | ||||
| Лейкоциты, ∙109/л | 5,2±1,6 5,1 (3,9; 5,9) | 6,7±3,0 5,6 (3,8; 9,2) | 8,5±4,5 8,2 (4,1; 12,0) | 0,136 |
| Лимфоциты, ∙109/л | 1,19±0,49 1,0 (0,7; 1,5) | 1,08±0,45 1,0 (0,7; 1,4) | 0,53±0,25 0,64 (0,34; 0,70) | 0,001* |
| СРБ, мг/л | 41,9±34,1 26,8 (5,8; 56,3) | 93,2±66,7 64,2 (30,2; 148,5) | 127,4±69,9 88,5 (70,8; 181,3) | 0,001* |
| ЛДГ, ед/л | 264,9±63,2 247 (209; 296) | 356,6±64,0 367 (300; 409) | 394,4±81,4 356(332; 470) | 0,001* |
| Прокальцитонин, нг/мл | 0,06±0,02 0,05 (0,05; 0,05) | 0,17±0,16 0,05 (0,05; 0,10) | 0,09±0,04 0,08 (0,05; 0,10) | 0,122 |
| CD14+HLA-DR+-моноциты, % | 87,5±10,9 93,9 (82,6; 96,9) | 76,2±14,7 78,8 (64,9; 92,1) | 43,1±27,0 28,8 (16,7; 73,9) | 0,001* |
| Маркеры апоптоза лимфоцитов | ||||
| CD95+-лимфоциты, % | 37,1±8,1 35,8 (29,9; 43,2) | 37,0±11,3 35,8 (29,9; 43,2) | 37,9±13,1 36,0(28,8; 49,3) | 0,975 |
| Ранний апоптоз, % | 10,8±4,9 9,9 (6,3; 14,8) | 7,3±3,1 6,4 (4,5; 9,1) | 5,6±4,0 3,8 (2,1; 5,5) | 0,001* |
| Поздний апоптоз, % | 0,11±0,09 0,08 (0,03; 0,17) | 0,12±0,09 0,08 (0,03; 0,17) | 0,12±0,06 0,10 (0,07; 0,13) | 0,630 |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения — М±SD, а также в виде медианы, 1-го и 3-го квартилей — Me (Q1; Q3). КТ — компьютерная томография; СРБ — C-реактивный белок; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; * — статистически значимые различия в группах (критерий Краскела—Уоллиса для независимых выборок).
У всех пациентов исследуемых групп отмечали лихорадку, наиболее выраженную при неблагоприятном течении заболевания. При неблагоприятном течении COVID-19 у пациентов 2-й группы рентгенологическая картина характеризовалась пневмонией с поражением более 50% легочной ткани. Состояние пациентов по шкале NEWS оценивали как тяжелое (7,96±2,81), с высоким риском органной дисфункции по шкале SOFA (3,27±0,83). У пациентов 3-й группы, по данным лучевой диагностики, поражение легочной ткани было 75% и более, а оценка по шкалам NEWS и SOFA составила 10,86±3,16 и 4,86±0,65 соответственно, что свидетельствует о более тяжелом состоянии пациентов и присоединении органной дисфункции. При этом различия между группами, оцениваемые с помощью критерия Краскела—Уоллиса, статистически значимы.
Лабораторные показатели, отражающие тяжесть состояния пациентов с COVID-19, более выражены при неблагоприятном течении и неблагоприятном исходе заболевания (см. табл. 1). Так, при неблагоприятном течении заболевания у пациентов 2-й группы в крови в разгар цитокинового шторма отмечали значительное повышение уровня СРБ (93,2±66,7 мг/мл), активности ЛДГ (264,88±63,16 ед/л), а также лимфопению (1,08±0,45∙109/л). Уровни лейкоцитов и прокальцитонина находились в пределах референсных значений. У больных 3-й группы уровни лабораторных маркеров воспаления на 5—12-е сутки заболевания статистически значимо выше: СРБ — 127,4±69,9 мг/мл, ЛДГ 394,45±81,4 ед/л, кроме этого, отмечали развитие выраженной лимфопении — 0,53±0,25∙109/л.
HLA-DR принадлежит к молекулам главного комплекса тканевой совместимости класса II (MHC класса II), ответственным за представление антигена T-клеткам. Клетки с фенотипом CD14+HLA-DR+ являются основной популяцией моноцитов в крови здоровых людей. Уменьшение или отсутствие экспрессии молекул HLA-DR на моноцитах ассоциировано с иммунной дисфункцией. При развитии COVID-19 на 5—12-е сутки заболевания содержание CD14+HLA-DR+-моноцитов в венозной крови соответствует норме только у пациентов 1-й группы и несколько снижено у больных 2-й группы (76,2±14,7%). В то же время у пациентов с неблагоприятным течением и исходом заболевания отмечали статистически значимо выраженное снижение этого показателя (43,1±27,0%). При анализе также выявили корреляционную зависимость содержания в венозной крови CD14+HLA-DR+-моноцитов от тяжести дыхательной недостаточности (r=–0,627; p=0,001) и органной дисфункции (r=–0,621; p=0,001), концентрации лимфоцитов (r=0,402; p=0,001), С-реактивного белка (r=–0,547; p=0,001) и лимфоцитов на ранних стадиях апоптоза (r=0,281; p=0,006).
Молекула CD95 представляет собой Fas-рецептор, стимуляция которого приводит к индукции апоптоза клетки. Исследование экспрессии CD95 на лимфоцитах венозной крови больных не выявило различий между исследуемыми группами. Содержание CD95+-лимфоцитов у больных с COVID-19 на 5—12-е сутки заболевания регистрировали в пределах нижних границ нормы. Известно, что Fas опосредует также передачу неапоптотических сигналов в лимфоцитах, в том числе способствуя их дифференцировке [7]. Таким образом, низкое содержание CD95+-лимфоцитов в периферической крови пациентов в разгар цитокинового шторма может свидетельствовать о нарушении активационных процессов в системе иммунитета, отмечаемое как при благоприятном, так и при неблагоприятном течении и исходе заболевания.
Содержание апоптотических лимфоцитов у больных исследуемых групп статистически значимо различается (см. табл. 1). При этом у пациентов 3-й группы количество лимфоцитов на ранних стадиях апоптоза регистрировали в пределах верхних границ нормы (5,6±4,0%), а у пациентов с неблагоприятным течением заболевания — выше нормы (7,3±3,1%). Самые высокие значения концентрации апоптотических лимфоцитов в венозной крови в разгар цитокинового шторма отмечены у пациентов с благоприятным течением заболевания (10,8±4,9% по сравнению с 2,74±0,23% в норме). При корреляционном анализе выявлена слабая, но статистически значимая обратная связь между концентрацией в венозной крови лимфоцитов на ранних стадиях апоптоза и оценкой тяжести состояния (оценка по шкале NEWS; r=–0,315; p=0,002) и органной дисфункции (оценка по шкале SOFA; r=–0,359; p=0,001). Результаты исследования содержания белков — регуляторов апоптотической гибели представлены в табл. 3.
Таблица 3. Уровень белков, участвующих в регуляции апоптоза клеток в лимфоцитах пациентов с COVID-19, на 5—12-е сутки заболевания
| Белок | Базовый уровень MFI | 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | p |
| AKT | 127±28 124 (107; 148) | 368±188 318 (195; 426) | 450±309 367 (181; 531) | 514±178 489 (349; 710) | 0,471 |
| BAD | 128±18 128 (121; 140) | 103±29 99 (77; 128) | 139±76 113 (86; 144) | 253±80 273 (186; 330) | 0,009* |
| BCL-2 | 20,8±7,6 18 (17; 24) | 38,9±17,1 31 (26; 45) | 36,7±10,7 35 (26; 38) | 27,4±7,7 23 (22; 26) | 0,256 |
| CASP-8 | 76,9±10,2 82 (81; 84) | 56,3±12,9 53 (45; 62) | 62,5±12,0 66 (57; 72) | 62,5±20,2 70 (50; 76) | 0,144 |
| CASP-9 | 31±10 29 (24; 37) | 270±12 261 (179; 365) | 302±147 236 (182; 397) | 419±207 439 (208; 625) | 0,430 |
| JNK | 134±132 40 (34; 190) | 196±177 94 (81; 119) | 210±54 139 (103; 207) | 222±16 233 (108; 326) | 0,179 |
| p-53 | 49,6±28,3 43 (29; 60) | 58,6±12,9 58 (44; 71) | 71,9±14,4 67 (57; 88) | 48,8±15,6 54 (38; 62) | 0,038* |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения — М±SD, а также в виде медианы, 1-го и 3-го квартилей — Me (Q1; Q3); CASP — каспаза; * — статистически значимые различия в группах (критерий Краскела—Уоллиса для независимых выборок).
У пациентов всех исследуемых групп отмечали изменения содержания белков, отвечающих за внутренний (митохондриальный) путь активации апоптотической гибели клеток. Так, обращает на себя внимание значительное увеличение уровня каспазы-9, относящейся к инициаторным каспазам, активирующим эффекторные каспазы (-3, -6, -7), в результате чего развивался каспазный механизм апоптотической гибели клеток. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий этого показателя у пациентов исследуемых групп, отмечается тенденция к увеличению уровня каспазы-9 у больных с неблагоприятным течением и исходом COVID-19.
BCL-2 является одним из членов антиапоптотического семейства, который препятствует высвобождению цитохрома С из митохондрий, что, в свою очередь, блокирует активацию каспазы-9. У пациентов исследуемых групп отмечено некоторое увеличение уровня BCL-2 в лимфоцитах венозной крови. При этом в первой группе у больных содержание BCL-2 в лимфоцитах имело тенденцию к увеличению по сравнению с умершими пациентами. Полученные нами данные согласуются с результатами исследования, опубликованными испанскими учеными, которые продемонстрировали статистически значимо более низкие концентрации BCL-2 в плазме крови умерших пациентов с COVID-19 [8]. Увеличение содержания BCL-2 в лимфоцитах, вероятно, связано с блокированием преждевременной гибели клетки до окончания реализации эффекторной функции. В то же время увеличение уровня BCL-2 может быть вызвано функцией этого белка, не связанной с антиапоптотическим действием. При вирусной инфекции BCL-2 способен блокировать сборку вируса в цитоплазме клетки, что продемонстрировано при инфицировании культуры клеток вирусом гриппа А [9]. При этом, несмотря на высокий уровень BCL-2 в инфицированных клетках, антиапоптотическое действие этого белка не проявлялось.
Другой белок этого семейства, BAD, напротив, обладает проапоптотическим действием. У пациентов 1-й и 2-й групп содержание BAD в лимфоцитах крови было минимальным или этот белок отсутствовал в клетках, тогда как у умерших пациентов уровень BAD статистически значимо выше (p=0,009). Протеинкиназа AKT участвует в координации множественных процессов передачи сигналов внутри клетки, в том числе в выживании и индукции апоптоза. Действие АКТ направлено как на подавление активности каспазы-9, так и на выработку BCL-2. В лимфоцитах крови пациентов с COVID-19 отмечено увеличение уровня АКТ по сравнению с базовым уровнем, наиболее выраженное при неблагоприятном течении и исходе заболевания.
Изменение уровней белков, участвующих в регуляции внешнего пути индукции апоптотической гибели (таких как каспаза-8, JNK), не выявлено. У пациентов 2-й группы отмечено незначительное увеличение уровня ядерного белка p-53, участвующего в репарации ДНК и индукции апоптоза.
В период разрешения цитокинового шторма у пациентов с COVID-19 уменьшалась выраженность признаков системного воспаления, снижалась температура. Клинические признаки дыхательной и органной дисфункции сохранялись у больных 2-й и 3-й групп (табл. 4).
Таблица 4. Клинико-лабораторные показатели пациентов исследуемых групп на 14—18-е сутки заболевания
| Показатель | 1-я группа | 2-я группа | 3-я группа | p |
| Клинико-инструментальные показатели и шкалы | ||||
| Максимальная температура, °C | 36,8±0,1 36,8 (36,7; 36,8) | 37,5±0,5 37,3 (37,1; 37,8) | 37,4±0,7 37,4 (37,1; 37,8) | 0,034* |
| КТ | 2,1±0,4 2 (2; 2) | 2,9±0,6 3 (2; 3) | 3,5±0,5 3,5 (3; 4) | 0,001* |
| Оценка по шкале NEWS, баллы | 2,9±1,4 3 (1; 4) | 5,8±1,8 5 (4; 8) | 7,7±2,7 7 (5; 10) | 0,001* |
| Оценка по шкале SOFA, баллы | 1,0±0,7 1 (0; 2) | 2,5±0,9 2 (2; 3) | 4,0±1,5 3,5 (3; 5) | 0,001* |
| Лабораторные маркеры | ||||
| Лейкоциты, ∙109/л | 5,2±1,0 5,4 (4,4; 5,8) | 6,8±3,0 5,3 (4,7; 7,2) | 6,2±1,9 6,6 (4,9; 7,9) | 0,703 |
| Лимфоциты, ∙109/л | 1,4±0,5 1,2 (0,9; 1,8) | 1,3±0,4 1,3 (0,9; 1,5) | 0,7±0,1 0,7 (0,6; 0,9) | 0,064 |
| СРБ, мг/л | 18,6±17,5 8,4 (4,4; 21,8) | 23,2±23,1 11,0 (2,9; 18,0) | 100,5±60,2 82,5 (54,3; 128,8) | 0,041* |
| ЛДГ, ед/л | 263±49 242 (216; 282) | 366±150 289 (237; 371) | 403±62 416 (359; 460) | 0,019* |
| Прокальцитонин, нг/мл | 0,050±0,008 0,05 (0,05; 0,05) | 0,12±0,12 0,05 (0,05; 0,09) | 12,5±18,6 0,16 (0,09; 12,9) | 0,005* |
| CD14+HLA-DR+-моноциты, % | 85,3±12,2 92 (78; 96) | 77,5±13,3 81 (63; 91) | 65,8±11,3 61 (57; 70) | 0,053 |
| Маркеры апоптоза | ||||
| CD95+-лимфоциты, % | 42,4±8,4 47 (32; 61) | 42,4±9,0 44 (31; 49) | 38,5±2,0 39 (38; 40) | 0,665 |
| Ранний апоптоз, % | 13,4±3,8 12,9 (10,0; 15,4) | 10,1±3,6 9,3 (7,3; 13,0) | 13,1±6,1 12,2 (9,0; 16,0) | 0,131 |
| Поздний апоптоз, % | 0,08±0,05 0,08 (0,03; 0,10) | 0,06±0,03 0,05 (0,03; 0,06) | 0,09±0,05 0,06 (0,05; 0,10) | 0,383 |
Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения — М±SD, а также в виде медианы, 1-го и 3-го квартилей — Me (Q1; Q3). КТ — компьютерная томография; СРБ — C-реактивный белок; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; * — статистически значимые различия в группах (критерий Краскела—Уоллиса для независимых выборок).
В крови пациентов исследуемых групп количество лейкоцитов оставалось нормальным, отмечалась тенденция к восстановлению концентрации лимфоцитов. Высокая концентрация СРБ и повышенная активность ЛДГ сохранялись у пациентов с неблагоприятным течением и исходом заболевания. Кроме того, у пациентов 3-й группы в связи с иммунной дисфункцией и присоединением бактериального компонента воспаления отмечали статистически значимое увеличение уровня прокальцитонина. Содержание лимфоцитов в венозной крови, вступающих в процесс апоптотической гибели, было повышенным у больных всех исследуемых групп.
Обсуждение
При вирусной инфекции, как правило, отмечается развитие лимфоцитоза, что обусловлено особенностями иммунного ответа, необходимостью инактивации вируса и элиминации зараженных клеток путем апоптоза, реализуемого через Т-цитотоксические лимфоциты. При COVID-19 в тяжелых случаях, напротив, развивается лимфопения, коррелирующая с тяжестью состояния пациента на фоне неконтролируемой воспалительной реакции. Одной из причин развития глубокой лимфопении при COVID-19 является усиленный апоптоз иммунокомпетентных клеток. В работах, посвященных патогенетическим особенностями коронавирусной инфекции, отмечены высокий апоптоз лимфоцитов [10, 11] и более высокая экспрессия Fas [12, 13] у пациентов с COVID-19 по сравнению со здоровыми людьми. В своей работе мы также отметили увеличение количества апоптотических лимфоцитов в венозной крови пациентов с COVID-19, что никак не коррелирует с развитием лимфопении. Так, наиболее высокие показатели апоптоза лимфоцитов отмечены у пациентов с благоприятным течением и исходом заболевания, у которых содержание лимфоцитов в венозной крови регистрировалось в пределах границ нормы во все периоды наблюдения. Кроме того, мы не отметили значительного повышения экспрессии CD95 на лимфоцитах ни в одной из исследуемых групп. Известно, что экспрессия и чувствительность к стимуляции CD95 повышается при активации Т-лимфоцитов [7]. При этом активация лимфоцитов может быть осуществлена за счет суперантигенного мотива на шиповидном белке SARS-CoV-2. А реализация апоптотического сигнала Fas-рецептора происходит посредством активации каспазы-8, изменения уровня которой в нашем исследовании также не отмечено. В то же время CD95 не только является проводником апоптотического сигнала, но также может активировать дифференцировку клеток с помощью протеинкиназы АКТ. Таким образом, проведенное нами исследование демонстрирует как нарушение активации лимфоцитов в ответ на вирусную агрессию, так и нарушение индукции апоптоза лимфоцитов при реализации внешнего пути у больных с тяжелым течением COVID-19.
Выраженные изменения отмечены при исследовании белков, регулирующих внутренний путь индукции апоптоза, при развитии цитокинового шторма на 5—12-е сутки заболевания у пациентов с COVID-19. У умерших больных преобладало влияние проапоптотических факторов при снижении активности антиапоптотических факторов. Несмотря на развитие у этих больных более выраженной лимфопении, коррелирующей с тяжестью дыхательной недостаточности по шкале NEWS (r=–0,373; p=0,001), органной дисфункции (r=–0,355; p=0,001), концентрацией С-реактивного белка (r=–0,425; p=0,001), содержание апоптотических клеток в венозной крови как на ранних, так и на поздних стадиях апоптоза регистрировали в пределах нормы. Кроме того, нам не удалось выявить корреляционную зависимость концентрации лимфоцитов в венозной крови от уровня белков — регуляторов апоптоза. Отсутствие апоптотических лимфоцитов в периферической крови у пациентов с неблагоприятным течением и исходом COVID-19 может быть связано с их быстрой элиминацией из кровяного русла, однако для уточнения требуются дальнейшие исследования.
Выводы
1. У реанимационных пациентов с COVID-19 снижение экспрессии молекулы HLA-DR на моноцитах на пике цитокинового шторма является неблагоприятным прогностическим признаком. При этом концентрация CD14+HLA-DR+-моноцитов в крови пациентов имеет обратную корреляционную зависимость от тяжести состояния и органной дисфункции, а также от некоторых показателей, отражающих выраженность воспаления (C-реактивного белка).
2. Высокая концентрация апоптотических лимфоцитов в крови пациентов с COVID-19 на 5—12-е сутки заболевания сопряжена с благоприятным течением и исходом заболевания.
3. У умерших пациентов с COVID-19 на пике цитокинового шторма отмечено нарушение регуляции апоптотической гибели лимфоцитов крови с преобладанием проапоптотических факторов на фоне снижения активности противоапоптотических факторов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Квасников А.М., Боровкова Н.В., Петриков С.С., Годков М.А.
Сбор и обработка материала — Андреев Ю.В., Сторожева М.В., Полуэктова В.Б., Кашолкина Е.А., Лебедев Д.А., Попугаев К.А.
Статистический анализ данных — Боровкова Н.В., Андреев Ю.В., Сторожева М.В.
Написание текста — Квасников А.М., Боровкова Н.В., Полуэктова В.Б.
Редактирование — Петриков С.С., Годков М.А., Андреев Ю.В., Попугаев К.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.