Введение
Интерлейкин-10 (IL-10) продуцируется различными клетками организма — Т-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, гепатоцитами, синусоидальными эндотелиальными клетками, Купферовскими клетками, звездчатыми клетками печени [1—4]. IL-10, подавляя выделение провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-12, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и др.), а также снижая экспрессию молекул HLA II класса и костимулирующих молекул макрофагами и дендритными клетками, является одним из ведущих цитокинов, угнетающих иммунные реакции [5]. Цитокин предотвращает апоптоз и усиливает пролиферацию и дифференцировку плазматических клеток, ингибирует выделение различных цитокинов нейтрофилами, что также способствует его противовоспалительному действию [2, 5, 6].
В исследованиях на лабораторных животных при моделировании повреждения печени установлено, что блокировка IL-10 с помощью моноклональных антител приводит к тяжелому печеночному некрозу. В то же время введение рекомбинантного IL-10 может существенно снизить секрецию провоспалительных цитокинов, апоптоз гепатоцитов, нейтрофильную инфильтрацию и некроз тканей печени [2, 7].
В моделях с индуцированной алкогольной болезнью печени у крыс установлено, что сниженная продукция IL-10 является фактором развития хронического заболевания печени. Таким образом, авторы предполагают, что данный цитокин может быть точкой терапевтического воздействия при алкогольной болезни печени, воздействие на который снижает некроз гепатоцитов [2, 8].
Установлено, что IL-10 вовлечен в контроль процессов фиброгенеза. С одной стороны, у лабораторных животных со сниженной продукцией IL-10 выявлены повышенная воспалительная инфильтрация и более выраженный фиброз в тканях печени. Ряд исследований указывают на роль цитокина, как противофиброзного фактора в моделях индуцированного поражения печени. С другой стороны, печеночные звездчатые клетки, непосредственно вовлеченные в процессы фиброгенеза, экспрессируют рецепторы к IL-10 и в то же время продуцируют сам цитокин [9—12].
Показано, что IL-10 подавляет функции звездчатых клеток печени и стимулируют их апоптоз. В то же время IL-10 влияет на продукцию коллагена и коллагеназ, ремоделирование внеклеточного матрикса и ограничивает фиброгенез путем подавления секреции трансформирующего фактора роста (TGF-β1) [13].
Таким образом, очевидна роль IL-10 в процессах фиброгенеза, перестройке внеклеточного матрикса и ингибировании процессов воспаления в моделях индуцированного поражения печени у лабораторных животных. В то же время не до конца изучены роль этого цитокина у пациентов с алкогольной болезнью печени, уровни при разных формах заболевания и его влияние на прогрессирование заболевания.
Цель исследования — изучить уровни IL-10 у пациентов с гепатитом и циррозом печени алкогольной этиологии.
Материал и методы
Исследование выполнено по протоколу контролируемого исследования в параллельных группах пациентов с контролем (практически здоровые лица, доноры станции переливания крови) на фоне стандартной терапии основного заболевания. Исследование проведено на базе гастроэнтерологического отделения и отделения анестезиологии и реанимации УЗ «Витебский областной клинический специализированный центр» (Витебск, Республика Беларусь).
В исследование включены пациенты с верифицированным диагнозом «хронический гепатит» (ХГ) или «цирроз печени» (ЦП) с признаками злоупотребления алкоголем (табл. 1). Из исследования исключены пациенты с другими острыми заболеваниями или декомпенсацией хронических заболеваний; с вирусной, аутоиммунной этиологией заболевания, неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), с онкологическими заболеваниями, беременные и кормящие женщины. Контрольная группа состояла из практически здоровых лиц — доноров станции переливания крови.
Таблица 1. Статистическая характеристика исследуемых групп
| Группа | n | Пол, n (%) | Возраст, годы | |
| Мужчины | Женщины | |||
| 1. Хронический гепатит | 18 | 11 (61,1) | 7 (38,9) | 50,5±11,2 |
| 2. Цирроз печени | 41 | 22 (53,7) | 19 (46,3) | 54,3±9,1 |
| 3. Контрольная | 15 | 8 (53,3) | 7 (43,7) | 52,8±4,2 |
Примечание. Статистическая значимость различий по полу и возрасту между группами — p>0,05.
Определение исходного состояния пациента проведено в соответствии с международными рекомендациями и локальным клиническим протоколом Республики Беларусь. Выполнен сбор анамнеза, проведены объективное исследование, общее клиническое исследование крови, мочи, биохимическое исследование крови, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, определение уровней маркеров вирусного гепатита, биопсия печени при неясном диагнозе, эзофагогастродуоденоскопия, консультации специалистов по показаниям. Рассчитаны неинвазивные маркеры цирроза и фиброза печени (Fib4, Forns, APRI) [14—16].
Вирусная этиология заболевания исключалась путем проведения тестирования на наличие маркеров вирусных гепатитов.
Аутоиммунную этиологию заболевания подтверждали у пациентов с наличием положительных тестов на аутоантитела: ANA, SMA, anti-LKM1, anti-SLA/LP [13].
НАЖБП установлена у пациентов, употребляющих алкоголь в дозах, не превышающих 10 г/сут этанола для женщин и 20 г/сут — для мужчин, и при наличии факторов риска НАЖБП (ожирения, гиперлипидемии, сахарного диабета 2-го типа).
Алкогольный гепатит, фиброз и цирроз печени подозревали при наличии алкогольного анамнеза (употребление более 4 стандартных доз (40 г этанола) для мужчин и 2 стандартных доз (20 г этанола) для женщин), и/или положительных результатов при оценке по опроснику CAGE, Быстрому алкогольному скрининговому тесту, AUDIT, а также при выявлении клинических признаков злоупотребления алкоголем (сосудистые звездочки, увеличение слюнных желез, гинекомастия, контрактура Дюпюитрена), при повышении активности гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП) и коэффициента де Ритиса более 1 и/или индекса ANI >0, задокументированного злоупотребления алкоголем [17].
Определение уровня IL-10 выполнено методом иммуноферментного анализа с использованием набора Human IL-10 ELISA Kit («RayBiotech», США).
Статистическая обработка полученных результатов
Результаты обрабатывались с помощью пакетов программ «Statistica» (Version 10, «StatSoftInc.», США, лицензия №STAФ999K347156W). ROC-анализ производился при помощи программы MedCalc Version 11.6.1.0. Поскольку изучаемые показатели имели распределение отличное от нормального (p<0,05 для критерия Шапиро—Уилка и Лиллиефорса во всех перечисленных группах) использовались непараметрические методы статистики. Вычисляли медиану (Me), 10-й, 90-й перцентили, нижний 25-й (LQ) и верхний 75-й квартили (UQ). Данные представляли в виде: Медиана (Me) [нижний квартиль (LQ) — верхний квартиль (UQ)]; Me [10-й перцентиль — 90-й перцентиль]. Статистическую значимость различий оценивали с использованием критерия Манна—Уитни. Наличие корреляции оценивали с использованием метода Спирмена, коэффициент корреляции представлен в виде r. При регрессионном анализе с подбором лучшей модели оценивали коэффициент корреляции r и коэффициент множественной детеминации r2. Значение коэффициента корреляции r=0,7—0,99 расценивали как сильную корреляцию, r=0,3—0,69 — корреляцию средней силы, r=0—0,29 — слабую корреляцию. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Исследование соответствует этическим нормам, предъявляемым к исследованиям с участием людей, и одобрено комитетом по этике клинических испытаний УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» протокол №1 от 15.02.17.
Исследование выполнено при финансировании Белорусским Республиканским Фондом Фундаментальных исследований.
Результаты
Характеристика пациентов с хроническим гепатитом
В группу хронического гепатита включено 18 пациентов, из них 11 (61,1%) мужчин и 7 (38,9%) женщин (см. табл. 1). Средний возраст составил 50,5±11,2 года.
Повышение уровня одной из трансаминаз при поступлении на стационарное лечение наблюдалось у 12 (66,7%) пациентов, двух трансаминаз — у 6 (33,3%) пациентов. Повышение уровня билирубина наблюдалось у 10 (55,5%) обследованных с хроническим гепатитом. Гепатомегалия выявлена у 14 (77,8%) человек, спленомегалия — у 8 (44,4%).
У 9 (50%) пациентов с хроническим гепатитом наблюдался гепатит с минимальной биохимической активностью, у 7 (38,9%) — с умеренной и у 2 (11,1%) — с высокой активностью. У всех включенных в исследование оценка по шкале Глазго была менее 9 баллов. Алкогольный анамнез и/или признаки злоупотребления алкоголем выявлены у всех пациентов. Уровень ГГТП повышен у 11 (61,1%) обследованных с хроническим гепатитом. Индекс де Ритиса >1 определен у 6 (33,3%) пациентов с хроническим гепатитом.
Характеристика пациентов с циррозом печени
В группу фиброза и цирроза печени включен 41 пациент (см. табл. 1), из них 22 (53,7%) мужчины и 19 (46,3%) женщин. Средний возраст 54,3±9,1 года.
У пациентов с циррозом печени в 7 (17,1%) случаях наблюдался компенсированный цирроз, класс тяжести A по Child-Puge, в 16 (39,0%) случаях — субкомпенсированный и декомпенсированный цирроз класса тяжести B по Child-Puge и в 18 (43,9%) случаях — декомпенсированный цирроз класса тяжести C по Child-Puge. Среди пациентов группы цирроза печени гепатомегалия наблюдалась у 17 (41,4%), а спленомегалия — у 29 (70,1%) человек.
У 27 (65,9%) пациентов с циррозом печени отмечено снижение уровня тромбоцитов, у 16 (39,0%) человек — снижение уровня альбумина, у 22 (53,7%) обследованных — повышение уровня билирубина. У 20 (48,8%) пациентов повышены уровни аспартатаминотрансферазы (АсАТ), у 4 (9,8%) — аланинаминотрансферазы (АлАТ), у 3 (7,3%) — щелочной фосфатазы, у 28 (68,3%) — ГГТП, у 20 (48,8%) пациентов уровень протромбинового индекса (ПТИ) был менее 0,6.
Признаки портальной гипертензии (увеличение диаметра портальной, селезеночной или мезентериальных вен, варикозные вены пищевода и (или) желудка, эктопические варикозные вены, увеличение селезенки, асцит) наблюдались у всех пациентов с циррозом печени.
У 14 (34,1%) обследованных асцит отсутствовал, асцит 1-й степени выявлен у 5 (12,2%) пациентов, 2-й — у 17 (41,5), 3-й — у 1 (2,4%), рефрактерный асцит — у 4 (9,8%) пациентов.
Варикозное расширение вен пищевода (ВРВП) не обнаружено у 10 (24,4%) пациентов, ВРВП 1-й стадии выявлено у 7 (17,1%), 2-й — у 10 (24,4%), 3-й — у 9 (22,0%) обследованных. ВРВП, осложненное кровотечением, отмечено у 4 (9,8%) пациентов.
Стадию портосистемной энцефалопатии оценивали в соответствии с критериями WestHaven. Нарушений ментальных функций не было у 20 (48,8%) пациентов. Портосистемная энцефалопатия 1-й степени выявлена у 10 (24,4%), 2-й — у 8 (19,5%), 3-й — у 3 (7,3%) обследованных.
Клинико-лабораторные показатели пациентов, включенных в исследование, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Клинико-лабораторная характеристика пациентов, включенных в исследование
| Показатель | Группа | |
| хронический гепатит (n=18) | цирроз печени (n=41) | |
| Общий анализ крови | ||
| Эритроциты, ×1012/л* | 4,82; 3,97—5,39 | 3,56; 2,76—4,51 |
| Гемоглобин, г/л | 154; 118—167 | 117; 88—138 |
| Тромбоциты, ×109/л* | 209; 147—254 | 101; 65—152,4 |
| Лейкоциты, ×109/л** | 7,9; 6,8—8,8 | 6,6; 4,85—7,825 |
| СОЭ, мм/ч* | 12; 3—28 | 26; 13—35 |
| Биохимический анализ крови | ||
| Белок общий, г/л** | 70; 67—73 | 68; 59,5—73 |
| Альбумин, г/л* | 41,5; 37—47 | 33; 26—37 |
| АсАТ, Е/л** | 32; 23—90 | 46; 32—76 |
| АлАТ, Е/л** | 49; 24—78 | 29; 22—37 |
| Коэффициент де Ритиса* | 0,67; 0,5—1,53 | 1,49; 1,14—2,12 |
| Билирубин общий, мкмоль/л** | 27; 12—43 | 41,1; 16,4—66,6 |
| Билирубин прямой, мкмоль/л** | 1,3; 0—16,6 | 12,7; 4—23,4 |
| Билирубин непрямой, мкмоль/л** | 24; 11,4—27,9 | 19,1; 11,5—35,3 |
| Щелочная фосфатаза, Е/л** | 93; 65—127 | 106; 77—139 |
| ГГТП, Е/л** | 74; 34—142,5 | 108; 59—241 |
| Холестерин, ммоль/л* | 5,4; 4,5—6,39 | 3,65; 3,1—5,3 |
| Мочевина, ммоль/л** | 6,1; 5—7,6 | 5,8; 4,6—7,2 |
| Креатинин, мкмоль/л** | 71; 69—102 | 69,5; 65—93 |
| Альфа-амилаза, Е/л** | 46; 38—65 | 54; 41—79 |
| Глюкоза, ммоль/л** | 5,55; 4,9—6,6 | 5,1; 4,6—6,1 |
| Коагулограмма | ||
| АЧТВ, с* | 28; 27—31 | 35,5; 31—39 |
| ПТИ* | 0,9; 0,76—0,95 | 0,67; 0,59—0,805 |
| Фибриноген, г/л** | 3,6; 2,5—4,9 | 3,1; 2,5—4 |
Примечание. Данные представлены в виде медианы; 25-го — 75-го процентилей; *— статистическая значимость различий p<0,05; ** — статистическая значимость различий p>0,05. СОЭ — скорость оседания эритроцитов; АсАТ — аспартатаминотрансфераза; АлАТ — аланинаминотрансфераза; ГГТП — глютамилтранспептидаза; АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время; ПТИ — протромбиновый индекс.
У пациентов основных групп выполнена оценка неинвазивных индексов фиброза и цирроза печени Fib4, Forns, APRI [14—16]. Полученные результаты представлены в табл. 3. Группы статистически значимо различались по всем выбранным критериям.
Таблица 3. Неинвазивные индексы фиброза и цирроза печени у пациентов, включенных в исследование
| Показатель | Группа | |
| хронический гепатит (n=18) | цирроз печени (n=41) | |
| Fib4 | 1,25; 0,9—2,1 | 5,05; 2,44—8,12 |
| Forns | 8,54; 6,32—10,2 | 12,19; 9,9 — 15,1 |
| APRI | 0,52; 0,26—1,5 | 1,56; 0,6—2,22 |
Примечание. Статистическая значимость различий между группами p<0,05.
В контрольную группу вошли 15 практически здоровых лица — доноров станции переливания крови в возрасте 52,8±4,2 года (см. табл. 1). Из них 8 (53,3%) мужчин и 7 (47,7%) женщин. Статистически значимых различий по полу и возрасту в исследуемых группах не было.
Уровень IL-10 у пациентов с заболеваниями печени
В ходе исследования установлено, что уровень IL-10 у пациентов с циррозом печени (3,15; 0,37—9,2 пг/мл) выше, чем у пациентов контрольной группы (0; 0—2,7 пг/мл, p<0,01). Уровень IL-10 в группе цирроза печени и группе с хронического гепатита (0; 0—5,92 пг/мл, p>0,05), так и у пациентов с хроническим гепатитом и у пациентов контрольной группы статистически не различаются (табл. 4).
Таблица 4. Уровень IL-10 в сыворотке крови у пациентов исследуемых групп
| Группа | n | Уровень IL-10 в сыворотке крови | |
| Хронический гепатит | 18 | 0; 0—5,92 | 0; 0—11,94 |
| Цирроз печени | 41 | 3,15; 0,37—9,2 | 3,15; 0—16,1 |
| Контрольная | 15 | 0; 0—2,7 | 0; 0—9,62 |
Примечание. Данные представлены в виде медианы; 25-го — 75-го процентилей; статистическая значимость — p2—3<0,01; p1—3>0,05; p1—2>0,05.
У пациентов с циррозом печени выявлены различия уровня IL-10 в зависимости от класса тяжести заболевания (рис. 1). Установлено, что при прогрессирующих формах цирроза печени (класс тяжести B и C по Child-Puge) уровень IL-10 статистически значимо выше (3,15; 1,76—8,24 пг/мл и 6,16; 0,37—12,4 пкг/мл соответственно), чем при циррозе печени класса тяжести A по Child-Puge (0,37; 0—0,83 пг/мл, p<0,05). Статистически значимых различий в группах цирроза печени класса тяжести B и C выявлено не было (p>0,05).
Рис. 1. Сравнение уровней IL-10 у пациентов с циррозом печени в зависимости от класса тяжести по Child-Puge.
Выявлено, что у пациентов с прогрессирующими формами цирроза печени уровень IL-10 статистически значимо выше, чем у пациентов с хроническим гепатитом, p<0,05 (рис. 2). Статистически значимых различий в уровнях IL-10 при циррозе печени класса тяжести A по Child-Puge и хроническом гепатите не было (p>0,05). Мы также установили, что у обследованных с декомпенсированными формами цирроза печени уровень IL-10 статистически значимо выше, чем у пациентов с хроническим гепатитом и циррозом печени класса тяжести A по Child-Puge, p<0,05 (рис. 3).
Рис. 2. Сравнение уровней IL-10 у пациентов с хроническим гепатитом и декомпенсированными стадиями цирроза печени.
Рис. 3. Сравнение уровней IL-10 у пациентов с начальными и прогрессирующими заболеваниями печени.
ХГ — хронический гепатит; ЦП «A» — цирроз печени, класса тяжести «А» по Child-Puge; ЦП «B» — цирроз печени, класса тяжести «B» по Child-Puge; ЦП «C» — цирроз печени, класса тяжести «C» по Child-Puge.
У пациентов с хроническими диффузными заболеваниями печени в целом выявлены слабые корреляции IL-10 с классом тяжести по Child-Puge (r=0,33), Fib4 (r=0,41), APRI (r=0,45), степенью выраженности асцита (r=0,37), степенью выраженности варикозного расширения вен пищевода (r=0,29), с уровнем IL-17 (r=0,59), белка (r= –0,3), альбумина (r= –0,37), АСТ (r=0,31), коэффициента де Ритиса (r=0,31), билирубина прямого (r=0,34), холестерина (r= –0,33) (табл. 5).
Таблица 5. Корреляции уровня IL-10 и клинико-лабораторных показателей пациентов с заболеваниями печени
| № | Показатель | Коэффициент корреляции |
| Пациенты с хроническим гепатитом и циррозом печени | ||
| 1 | Класс тяжести по Child-Puge | 0,33 |
| 2 | Fib4 | 0,41 |
| 3 | APRI | 0,45 |
| 4 | Степень асцита | 0,37 |
| 5 | Степень варикозного расширения вен пищевода | 0,29 |
| 6 | Сывороточный белок | –0,3 |
| 7 | Альбумин | –0,37 |
| 8 | АсАТ | 0,31 |
| 9 | АсАТ/АлАТ | 0,31 |
| 10 | Билирубин прямой | 0,34 |
| 11 | Холестерин | –0,33 |
| Пациенты с циррозом печени | ||
| 1 | Fib4 | 0,54 |
| 2 | APRI | 0,58 |
| 3 | Forns | 0,64 |
| 4 | Эритроциты | –0,6 |
| 5 | Гемоглобин | –0,6 |
| 6 | Тромбоциты | –0,63 |
| 7 | Лимфоциты | –0,52 |
| 8 | Сегментоядерные нейтрофилы | 0,47 |
| 9 | ПТИ | –0,59 |
| 10 | АЧТВ | 0,37 |
Примечание. АсАТ — аспартатаминотрансфераза; АлАТ — аланинаминотрансфераза; ПТИ — протромбиновый индекс; АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время.
У пациентов с циррозом печени установлены корреляции средней силы IL-10 с уровнем Fib4 (r=0,54), APRI (r=0,58), Forns (r=0,64), эритроцитов (r= –0,6), гемоглобина (r= –0,6), тромбоцитов (r= –0,63), лимфоцитов (r= –0,52), сегментоядерных нейтрофилов (r=0,47), ПТИ (r= –0,59), АЧТВ (r=0,37) (см. табл. 5).
Обсуждение
В нашем исследовании установлено повышение уровня IL-10 у пациентов с циррозом печени алкогольной этиологии. Повышенная продукция цитокина, как мы предполагаем, ведет с одной стороны к замедлению процессов воспаления и уменьшению некроза клеток и, таким образом, уменьшению процессов цитолиза, но, при этом, чрезмерной продукции фиброзной ткани и прогрессированию цирроза печени. Это приводит к декомпенсации заболевания и прогрессированию портальной гипертензии.
L.J. Zhang и соавт. указывают, что IL-10 оказывает ингибирующее влияние на воспаление печени (вызываемое хроническим употреблением алкоголя), в том числе и посредством активации STAT3 в клетках Купфера и последующего ингибирования воспаления печени [2, 13]. Ингибирование процессов воспаления и некроза гепатоцитов, а также стимулирование процессов коллагеногенеза и регенерации тканей печени с помощью IL-10 [18] может быть одним из факторов замедления процессов цитолиза и преобладания хронизации и перестройки тканей печени. В настоящем исследовании выявлены более высокие уровни IL-10 у пациентов с прогрессирующими заболеваниями печени. Ускоренное фиброзирование и цирротическая трансформация под влиянием IL-10 могут быть механизмами декомпенсации цирроза печени. Повышение уровня IL-10 у пациентов с алкоголь-зависимыми заболеваниями печени, выявленное в нашем исследовании, подтверждается также и другими авторами [19]. Изменение уровней цитокина, вероятно, связано с преобладанием процессов хронического воспаления над острым цитолизом, что в большей степени выражено у пациентов с циррозом печени. Кроме того, IL-10 может ингибировать продукцию IL-6 и тем самым способствовать стеатозу печени у пациентов с алкоголь-зависимыми заболеваниями печени [19]. Установленные в нашем исследовании корреляции с неинвазивными индексами фиброза и цирроза печени, а также с лабораторными показателями указывают на взаимосвязь прогресса заболевания и уровня цитокина.
Ограничением настоящего исследования является малое количество пациентов, включенных в исследование, таким образом, полученные данные должны быть подтверждены на больших выборках.
Заключение
В нашем исследовании установлено повышение уровней интерлейкин-10 у пациентов с циррозом печени алкогольной этиологии по сравнению с практически здоровыми лицами (p<0,05). У пациентов с декомпенсированными формами цирроза печени (класс тяжести B и C по Child-Puge) уровень интерлейкина-10 статистически значимо выше, чем при классе тяжести A (p<0,05). Более высокие уровни интерлейкина-10 наблюдаются у пациентов с прогрессирующими заболеваниями печени по сравнению с хроническим гепатитом и циррозом печени класса тяжести A по Child-Puge (p<0,05).
Таким образом, интерлейкин-10, предупреждая процессы воспаления и некроза, а также стимулируя регенеративные процессы, является важным противовоспалительным цитокином, участвующим в патогенезе алкоголь-зависимых заболеваний печени.
Финансирование. Исследование выполнено при финансировании Белорусским Республиканским Фондом Фундаментальных исследований.
Funding. The Belarusian Republican Fund House of Basic Research provided funds for the project.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.