Введение

Воспаление — типовой патологический процесс, возникающий в ответ на воздействие инфекционных агентов, а также при механических и термических травмах, массивных оперативных вмешательствах [1]. Одной из главных причин летальности в отделениях реанимации является воспаление, которое играет ключевую роль в повреждении тканей и прогрессировании полиорганной недостаточности у пациентов [2—5]. Одним из ключевых компонентов избыточного иммунного ответа является активация нейтрофилов [6]. Иммунные клетки — нейтрофилы, являясь первой линией защиты организма от патогенов, используют различные механизмы борьбы с чужеродными агентами, включая образование нейтрофильных ловушек, а также синтез и высвобождение бактерицидных веществ, что может приводить к поражению даже собственных тканей организма [7]. Нейтрофильные ловушки представляют собой ядерный хроматин, который связан с ферментами и антимикробными пептидами [8]. При контакте нейтрофилов с патогенными микроорганизмами образуются нейтрофильные ловушки, так же как и во время взаимодействия с активированными тромбоцитами и под влиянием противовоспалительных медиаторов [9, 10]. Нейтрофильные ловушки могут усугублять эндотелиальную дисфункцию при сепсисе, способствуя прогрессированию органной дисфункции, ухудшая прогноз пациентов с сепсисом [11—13]. Нейтрофильные ловушки кроме антимикробного действия активируют и другие клетки иммунной системы, что является важнейшим фактором асептического воспаления [14]. Работы ряда исследователей показали, что присутствие нейтрофильных ловушек во время выделения ими тканевого фактора способствовало тромбообразованию и агрегации тромбоцитов, что наиболее важно для участия в патогенезе микрососудистого и макрососудистого тромбоза [15, 16]. Это приводит к формированию порочного круга: тромбоциты, которые активированы нейтрофильными ловушками, активируют другие нейтрофилы, в результате чего процессы воспаления и тромбообразования поддерживаются по принципу положительной обратной связи [15, 16].

Севофлуран — ингаляционный анестетик, который относится к числу факторов, уменьшающих образование нейтрофильных ловушек. Его положительное влияние на функцию нейтрофилов в критических состояниях выявлено в ряде экспериментов in vitro и in vivo [17—19]. В ряде экспериментов установлено, что этот газ в отличие от других анестетиков (например, изофлурана) наиболее существенно снижает выраженность окислительного стресса, воспалительного процесса, апоптоза нейтрофилов, улучшая выживаемость и снижая микробную нагрузку, в том числе у пациентов при проведении оперативных вмешательств [17, 20—23].

Потенциальная эффективность препарата служит основанием для продолжения исследований применения севофлурана, в том числе у находящихся в септических состояниях пациентов отделений реанимации. Вполне оправданным представляется предположение о том, что севофлуран способен модулировать воспалительный ответ организма. Но молекулярные механизмы реализации противовоспалительных свойств севофлурана остаются не до конца изученными.

Цель исследования — изучить противовоспалительные свойства севофлурана путем его воздействия in vitro на нейтрофилы пациентов с сепсисом.

Материал и методы

Исследование проводилось на базе ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии» Минобрнауки России. Для проведения исследования использовались нейтрофилы, полученные из венозной крови добровольцев-доноров, мужчин в возрасте от 25 до 34 лет. Всего в исследовании приняли участие 5 человек. Доноры давали письменное информированное добровольное согласие и подтверждали, что в предыдущем месяце не сдавали кровь (этическая экспертиза, протокол №3/22/7 от 14 декабря 2022 г.).

Нейтрофилы доноров выделены по следующей методике: гепаринизированную венозную кровь смешивали с 5% раствором декстрана Т-500 (Pharmacosmos, Дания) в PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7,4, производство Россия) в соотношении 4:1 (то есть до конечной концентрации декстрана 1%) и оставляли при комнатной температуре на 30 мин для осаждения эритроцитов. Верхний слой плазмы (обогащенный лейкоцитами и лишенный эритроцитов) наслаивали на раствор фиколла (ООО НПП «ПанЭко», Россия) с плотностью 1,077 г/мл и центрифугировали при комнатной температуре при 400g 30 мин в центрифуге с отключенным режимом торможения. Затем удаляли супернатант и все дальнейшие процедуры проводили на льду и с использованием охлажденных растворов. Удаление примесных эритроцитов проводили с помощью ресуспендирования осадка в 2 мл деионизованной стерильной воды в течение 45 с, а затем добавляли 2 мл двукратного PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7,4, производство Россия) для восстановления тоничности. Центрифугировали при 200g, +4°C 10 мин. Осажденные нейтрофилы промывали PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7,4, производство Россия) и ресуспендировали в культуральной среде (RPMI-1640+10% FBS). Чистоту популяции нейтрофилов (95%) оценивали по прямому и боковому светорассеиванию с помощью проточной цитометрии. Активацию нейтрофилов (дегрануляцию) оценивали по увеличению на поверхности клеток молекул CD11b, CD66b после инкубации их с липополисахаридом (ЛПС) в дозе 200 нг/мл в течение 30 мин при 37°C, затем добавляли 2,5 мкл антител к CD11b, CD66b, конъюгированных с флуоресцентным красителем FITC (Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США), и оставляли на 30 мин во льду. Затем анализировали 50 тыс. клеток с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc., США). Исследование проводилось на выделенных из крови пяти здоровых доноров нейтрофилах, которые активировали с помощью ЛПС (200 нг/мл) и fMLP (100 нМ) и затем оценивали их активность с помощью флуоресцентных антител к маркерам дегрануляции CD11b, CD66b.

Проточная цитофлуориметрия — высокоточный метод анализа клеток в суспензии, позволяющий оценить несколько параметров каждой анализируемой клетки одновременно. Этот метод широко используется для детекции апоптоза, который осуществляется с помощью таких маркеров, как аннексин V и йодистый пропидий (PI). Аннексин V связывается с фосфатидилсерином, локализованным на внешней стороне клеточной мембраны в ходе апоптоза. Для изучения влияние севофлурана на уровень апоптоза нейтрофилов человека через 22 ч после их выделения использовали аннексин V и йодистый пропидий. Нейтрофилы здоровых доноров (5 человек), активированные с ЛПС в дозе 200 нг/мл и пептидом хемотаксиса N-формил-метионин-лейцин-фенилаланином (fMLP) в дозе 100 нМ, инкубировали в течение 22 ч при 37°C в CO₂-инкубаторе (5% CO₂). Затем клетки центрифугировали при 400g в течение 5 мин и ресуспендировали осадок в 70 мкл буфера (10 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂, pH=7,4). К каждой пробе добавляли 2,5 мкл аннексина V (0,5 мг/мл), конъюгированного с флуоресцентным красителем FITC (Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США), и оставляли на 25 мин при 37°C. Далее добавляли иодид пропидия до конечной концентрации 5 мкг/мл, инкубировали еще 5 мин, после чего анализировали 50 тыс. клеток с помощью проточного цитофлуориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc., США). Уровень апоптоза и некроза нейтрофилов оценивали по окраске аннексин V-положительных и пропидий иодид-отрицательных клеток.

Исследование влияния сыворотки пациентов с сепсисом на противовоспалительную активацию нейтрофилов человека проведено в отделении реанимации и интенсивной терапии ГБУЗ города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» в период с 09 января 2022 г. по 11 июля 2022 г.

Для проведения данного исследования выделяли сыворотку у пациентов с сепсисом. После установки диагноза «сепсис» у пациентов в течение 2 ч производился забор венозной крови. После этого кровь помещали в центрифугу и отделяли сыворотку. После отделения сыворотки ее собирали в пробирки и замораживали до тех пор, пока не будут подготовлены нейтрофилы здоровых доноров-добровольцев для активации их с помощью данной сыворотки. Для того чтобы провести экспозицию с севофлураном в различных концентрациях с нейтрофилами, активированными сывороткой пациентов с сепсисом, использовали CO₂-инкубатор (5% CO₂) с дополнительным портом для подключения контура от наркозно-дыхательного оборудования. После выставления заданных параметров необходимой концентрации МАК (0,5/1,0/1,5) инкубатор заполняли газом (севофлураном) с предварительно помещенными туда планшетками с нейтрофилами, активированными сывороткой пациентов с сепсисом. Регистрация конечной концентрации севофлурана выполнялась с помощью стандартного газоанализатора, который установлен в наркозно-дыхательной аппаратуре.

Экспертиза проведена этическим комитетом ФНКЦ РР (протокол № 3/22/7 от 14 декабря 2022 г.). Информированное добровольное согласие получено от каждого пациента или его родственника, если сам пациент не имел такой возможности (в связи с недееспособностью или проведением искусственной вентиляции легких).

Критерии включения: установленный диагноз «сепсис» согласно концепции «Сепсис-3», возраст ≥18 лет, оценка по шкале острых физиологических расстройств и хронических нарушений состояния (англ. Acute Physiology and Chronic Health Evaluation — APACHE) ≥10 баллов, оценка по шкале динамической оценки органной недостаточности (англ. Sequential Organ Failure Assessment — SOFA) ≥2 баллов, задокументированное согласие пациента/его родственника на участие в исследовании.

Критерии исключения: терапия иммуносупрессивными препаратами в анамнезе, онкопатология, перенесенный COVID-19, положительный тест на HBV, HCV или HIV-1/2, прием антибактериальных препаратов на фоне длительного (более 7 дней) воспалительного процесса.

Метод включения пациентов в исследования основывался на сопоставлении данных медицинской документации с критериями соответствия. Метод оценки исходов заключался в изучении медицинской документации. В рамках исследования запланировано проведение трех визитов для каждого участника. Визиты проводили с периодичностью от 1 до 11 дней (в среднем 3,4 дня).

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics 27.0.1.0 (IBM Corporation, США). Количественные данные представлены в виде Me (IQR), где Me — медиана, IQR — межквартильный диапазон. Сравнительный межгрупповой анализ для количественных переменных связанных выборок выполнен с использованием критерия Уилкоксона в случае сравнения двух выборок, а в случае сравнения трех выборок — с использованием двухфакторного рангового дисперсионного анализа Фридмана с последующим множественным попарным сравнением с учетом поправки Бонферрони. Критический уровень значимость p установлен на уровне 0,05 (двусторонний). С целью визуальной демонстрации результатов сравнения групп по количественным параметрам применяли диаграмму «ящик с усами».

Результаты

В данной части исследования изучалось влияние севофлурана на провоспалительную активацию нейтрофилов в условиях ex vivo. В ходе исследования использовались нейтрофилы от здоровых доноров, которые инкубировались с сывороткой пациентов с сепсисом, содержавшей патогены или их компоненты и вызывавшей провоспалительную реакцию. Севофлуран применяли к нейтрофилам в разных концентрациях, выраженных в минимальных альвеолярных концентрациях (МАК). В ходе исследования использовали концентрации 0,5 МАК, 1 МАК и 1,5 МАК, что эквивалентно 1, 2 и 3 объемным процентам севофлурана соответственно. Чувствительными маркерами активации и дегрануляции нейтрофилов являются молекулы CD11b и CD66b, которые находятся во внутриклеточных гранулах нейтрофилов. По результатам исследования, уровень экспрессии CD11b и CD 66b на поверхности интактных нейтрофилов (здоровые доноры) составлял соответственно 3589 [3462—4402] условных единиц флуоресценции (у.е.ф.) (табл. 1) и 9333 [8783—10780] у.е.ф. (табл. 2).

Таблица 1. Значение экспрессии CD11b на поверхности нейтрофилов при воздействии сыворотки пациентов с сепсисом и экспозиции с севофлураном в концентрациях 0,5 МАК (1 об.%), 1 МАК (2,0 об.%), 1,5 МАК (3,0 об.%)

Таблица 2. Значение экспрессии CD66b на поверхности нейтрофилов при воздействии сыворотки пациентов с сепсисом и экспозиции с севофлураном в концентрациях 0,5 МАК (1 об.%), 1,0 МАК (2,0 об.%), 1,5 МАК (3,0 об.%)

Инкубация нейтрофилов с сывороткой пациентов с сепсисом после экспозиции с севофлураном в концентрации 0,5 МАК и 1 МАК статистически значимо увеличивала экспрессию молекул CD11b (см. табл. 1) и CD 66b (см. табл. 2) по сравнению с интактными нейтрофилами, однако после экспозиции с севофлураном в концентрации 1,5 МАК (3 об.%) не выявлено статистически значимого увеличения экспрессии молекул CD11b и CD 66b (см. табл. 2) по сравнению с интактными нейтрофилами.

Результаты показали, что экспозиция с севофлураном в концентрации 1,5 МАК (3 об.%) статистически значимо снижает противовоспалительную реакцию нейтрофилов. Внутриклеточные молекулы CD11b и CD66b, которые являются маркерами активации и дегрануляции нейтрофилов, были использованы для оценки воздействия на активацию нейтрофилов. При инкубации нейтрофилов с сывороткой пациентов с сепсисом без экспозиции с севофлураном уровень экспрессии указанных молекул статистически значимо увеличился по сравнению с интактными нейтрофилами.

Однако экспозиция нейтрофилов с севофлураном в концентрации 0,5 МАК и 1 МАК не приводила к статистически значимому изменению экспрессии CD11b и CD66b по сравнению с интактными нейтрофилами. Это указывает на то, что данные концентрации анестетика не влияли на провоспалительные свойства нейтрофилов. В то же время экспозиция в концентрации 1,5 МАК (3 об.%) статистически значимо снижала экспрессию этих молекул, что свидетельствует об уменьшении провоспалительной активации нейтрофилов.

Проведенное исследование имеет клиническую значимость, так как севофлуран обычно используется для общей анестезии и его потенциальное противовоспалительное действие может оказаться полезным в контексте сепсиса и других воспалительных процессов.

В рамках данного исследования проводилась оценка влияния севофлурана на динамику апоптоза нейтрофилов у пациентов с сепсисом. Установлено, что уровень спонтанного апоптоза нейтрофилов через 22 ч инкубации составил 57 [56,8—57,9]%, а экспозиция с севофлураном в концентрации 0,5 МАК и 1,5 МАК (3 об.%) не влияла на способность нейтрофилов к спонтанному апоптозу: уровень апоптоза составил 52,9 [50,1—54,5]% (p>0,05) при 0,5 МАК, 53 [51,5—54,7]% (p>0,05) при 1,0 МАК и 57,3 [53—58,8]% (p>0,05) при 1,5 МАК. Следовательно, севофлуран не влиял на уровень апоптоза нейтрофилов. Инкубация нейтрофилов с сывороткой пациентов с сепсисом статистически значимо снижала уровень апоптоза — в 1,96 раза, до 29,3 [25,25—33,5]% (табл. 3). Инкубация нейтрофилов с сывороткой пациентов с сепсисом после экспозиции с севофлураном снижала уровень апоптоза статистически значимо только в концентрации 0,5 МАК (p=0,027).

Таблица 3. Показатели апоптоза нейтрофилов при инкубации с сывороткой пациентов с сепсисом и экспозиции с севофлураном

При инкубации нейтрофилов с сывороткой пациентов с сепсисом после экспозиции с севофлураном в различных концентрациях по сравнению с нейтрофилами, которые инкубированы с сывороткой пациентов с сепсисом, но без экспозиции с севофлураном, на противовоспалительную активность нейтрофилов статистически значимо (p=0,027) влияла экспозиция в концентрации 1,5 МАК (3 об.%). Инкубация после экспозиции с севофлураном в концентрацихя 0,5 МАК (1 об.%) и 1,0 МАК (2 об.%) не оказала статистически значимого влияния на провоспалительную активность нейтрофилов. Таким образом, экспозиция с севофлураном в концентрации 1,5 МАК в условиях ex vivo статистически значимо (p=0,027) снижает противовоспалительную активацию нейтрофилов, подвергшихся воздействию сыворотки пациентов с сепсисом (рисунок).

Уровень апоптоза нейтрофилов у пациентов с сепсисом при инкубации с сывороткой и экспозиции с севофлураном.

СС — сыворотка пациента с сепсисом.

Воздействие сыворотки пациентов с сепсисом повышает уровень апоптоза нейтрофилов, однако экспозиция нейтрофилов с севофлураном в концентрации 1,5 МАК (3 об.%) подавляет этот процесс. Тем не менее отсутствие статистической значимости этого эффекта может быть связано с недостаточным количеством проб или более низким уровнем апоптоза по сравнению с нейтрофилами, активированными сывороткой пациентов с сепсисом. Таким образом, вопрос влияния севофлурана на уровень апоптоза нейтрофилов должен быть уточнен в дальнейших исследованиях. Следует отметить, что антиапоптотический эффект севофлурана продемонстрирован в отношении не только нейтрофилов, но и других клеток. Молекулярные механизмы ингибирования апоптоза нейтрофилов под воздействием севофлурана при сепсисе также необходимо уточнить, в том числе в исследованиях in vivo.

Обсуждение

После выхода из костного мозга среднее время жизни нейтрофилов составляет в среднем около 4—5 дней, после чего нейтрофилы подвергаются апоптозу и фагоцитозу [24]. Слишком быстрая и массовая смерть нейтрофилов приводит к нейтропении и подверженности организма инфекциям, а излишне долгая жизнь, наоборот, может вызвать хроническое воспаление [25, 26].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что воздействие сыворотки пациентов с сепсисом на нейтрофилы приводит к снижению апоптоза, способствуя формированию «неразрешаемого воспаления». Экспозиция нейтрофилов с севофлураном в концентрации 1,5 МАК в условиях ex vivo способна индуцировать спонтанный апоптоз нейтрофилов, снижая противовоспалительную активацию нейтрофилов, в отличие от экспозиции с севофлураном в дозах 0,5 МАК и 1,0 МАК. Полученные данные согласуются с результатами других клинических исследований по ингаляционной седации при сепсисе, выявивших снижение уровня некоторых противовоспалительных маркеров и маркера повреждения эпителия легких у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом при использовании ингаляционной анестезии [27, 28]. Влияние севофлурана на окислительный стресс изучено как на клеточных линиях, так и на моделях животных. Констатировано снижение уровня окислительного стресса и статистически значимое повышение выживаемости в моделировании сепсиса у мышей — с 17% до 83% при применении севофлурана [29—32]. В последующем в клинических исследованиях отмечено снижение выраженности воспалительного процесса и окислительного стресса у пациентов после оперативных вмешательств при использовании севофлурана в качестве средства для общей анестезии. Севофлуран снижал ишемически-реперфузионное повреждение миокарда за счет уменьшения образования противовоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 [20]. У пациентов, перенесших открытое торакальное оперативное вмешательство, тоже отмечено снижение синтеза и секреции противовоспалительных медиаторов при использовании ингаляционных анестетиков по сравнению с внутривенной общей анестезией, соперничество которых не прекращается уже длительное время [21, 22].

Таким образом, полученные в ходе исследования данные о противовоспалительных свойствах севофлурана согласуются с данными литературы, подтверждая перспективность использования севофлурана у пациентов с септическими состояниями и необходимость продолжения исследования его свойств.

Заключение

Севофлуран увеличивает способность нейтрофилов к спонтанному апоптозу, который, в свою очередь, ведет к разрешению воспаления. В исследовании продемонстрировано, что одним из возможных путей реализации противовоспалительных свойств севофлурана может быть снижение экспрессии на поверхности нейтрофилов маркеров дегрануляции CD11b и CD66b. Севофлуран способен снижать противовоспалительную активность нейтрофилов, наблюдаемую под действием сыворотки пациентов с сепсисом.

Результаты исследования открывают нам новые перспективы применения севофлурана для лечения «избыточного» воспаления при сепсисе, но эти обнадеживающие данные еще должны быть подтверждены на моделях in vivo. Возможно, наши результаты позволят инициировать ряд клинических испытаний с севофлураном для изучения его предполагаемых противовоспалительных и органопротекторных свойств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Гребенчиков О.А., Кузовлев А.Н., Долгих В.Т.

Сбор и обработка материала — Гребенчиков О.А., Старостин Д.О.

Статистический анализ данных — Поляков П.А.

Написание текста — Старостин Д.О.

Редактирование — Кузовлев А.Н., Долгих В.Т., Старостин Д.О., Гречко А.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.