Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место в структуре онкологической заболеваемости среди мужчин и пятое место в структуре онкологической смертности. В 2012 г. число впервые диагностированных случаев по всему миру составило 1,1 млн и представляло собой 15% всех впервые выявленных злокачественных новообразований у мужчин [1]. Золотым стандартом диагностики является патологоанатомическое исследование биопсийного материала. Тем не менее существует ряд диагностических трудностей, наибольшую из которых представляет дифференциальный диагноз предракового процесса — простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени (вПИН) — с доброкачественными и злокачественными состояниями, способными ее имитировать, в частности с внутрипротоковой карциномой и атипическими крибриформными поражениями. Согласно исследованию D. Bostwick и J. Ma, гипердиагностика вПИН оставляет 23,9% [2].

Другими не менее важными проблемами в диагностике новообразований предстательной железы являются оценка агрессивности опухоли и определение прогноза заболевания. По результатам многих исследований, к прогностическим факторам при аденокарциноме предстательной железы относят клиническую стадию, в том числе местную распространенность процесса (наличие инвазии за пределы капсулы или в семенные пузырьки), размер опухолевого узла (узлов), степень дифференцировки опухоли по шкале Глисона и уровень простатического специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови [3—10]. Ни один из параметров не является абсолютно достаточным, подход к оценке прогноза должен быть комплексным.

Накопленные к настоящему моменту данные генетического и протеомного анализа неоплазий в предстательной железе свидетельствуют в пользу связи канцерогенеза с прогрессирующим накоплением аномалий фенотипа и генотипа, что открывает новые дифференциально-диагностические возможности. Особенностью канцерогенеза в предстательной железе является образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS. Простатспецифические промоторные элементы химерных генов TMPRSS2/ETS обеспечивают высокую стойкую экспрессию онкогенов, запуская процессы пролиферации и трансформации клеток в предстательной железе. Конечным результатом всех перестроек ETS является аномальная гиперэкспрессия измененных вариантов транскрипционных факторов. Наиболее частым вариантом (в 50—60%) является слияние TMPRSS2 с расположенным рядом геном ERG4 [11, 12]. Исследования S. Tomlins и соавт. [13] показали, что в 95% случаев гиперэкспрессия ERG4 ассоциирована с наличием химерного гена TMPRSS2/ERG4. В результате слияния 1 экзона TMPRSS2 и 3’-конца ERG4 образуется химерный ген, который после альтернативного сплайсинга дает 8 вариантов химерных транскриптов, наиболее частым (86%) является вариант 1 экзон TMPRSS2 — 4 экзона ERG4. Данное химерное событие, приводящее к гиперэкспрессии измененного белка ERG, можно наблюдать с помощью иммуногистохимического метода наравне с анализом химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР.

Целью работы являются оценка диагностической и прогностической значимости анализа экспрессии ERG, а также анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG в неоплазиях предстательной железы.

За период с 2011 по 2012 г. последовательно отобраны 100 пациентов с раком предстательной железы, перенесших радикальную простатэктомию. Средний возраст пациентов составил 62 года (от 41 года до 76 лет). Наличие в образцах аденокарциномы и вПИН подтверждалось иммуногистохимическими реакциями с антителами P504S и 34βE12 на серийных срезах. Анализ экспрессии ERG проводился иммуногистохимическим методом на тех же сериях срезов. В качестве морфологических факторов прогноза опухоли выбраны размер и распространенность опухоли (pT), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах и степень дифференцировки по шкале Глисона.

Иммуногистохимическое исследование. С выбранных блоков (100 наблюдений) изготавливали срезы толщиной 3 мкм и монтировали на высокоадгезивные стекла (Superfrost plus «Thermo Scientific»). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи специализированной системы EnVision Flex («Dako», Дания) по стандартному протоколу в модуле предобработки (РТ-Module) к автостейнеру Autosteiner Plus («Dako», Дания). Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли в автоматическом режиме с помощью автостейнера Autosteiner Plus («Dako»). В качестве системы детекции использовали набор EnVision Flex («Dako», Дания) с DAB-хромогеном. В каждой серии препаратов присутствовал соответствующий положительный и отрицательный контроль. В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела в готовом разведении к белку ERG, клон EP111 Flex («Dako», Дания), к белку P504S, клон 13H4 Flex («Dako», Дания) и моноклональные мышиные антитела к цитокератинам высокой молекулярной массы, клон 34βE12 Flex («Dako», Дания). Результаты реакции экспрессии P504S и 34βE12 оценивали качественно, ERG (маркер ядерной локализации) — в процентах окрашенных опухолевых клеток. Критерием гиперэкспрессии выбрано положительное окрашивание 1% и более клеток аденокарциномы или вПИН.

Оценку статистической значимости результатов исследования выполняли методом точного теста Фишера и χ². Уровень значимости (р) приняли равным 0,05.

Анализ хромосомных перестроек. По результатам иммуногистохимического исследования отобрано по 15 образцов с выраженной гиперэкспрессией ERG и с достоверным ее отсутствием в опухолевой ткани. Анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 проводили на соседних блоках, отобранных по принципу наличия в блоке не менее 40% опухолевой ткани. РНК из парафиновых блоков выделяли с использованием набора RNeasy FFPE Kit («Qiagen», Германия) по соответствующему фирменному протоколу. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit («Applied Biosystems», США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере («ДНК-технология», Россия) по следующей температурной схеме: 60 °C — 20 мин, 37 °C — 120 мин. Образцы кДНК хранили при температуре –20 °С.

Перед анализом экспрессии целостность и количество выделенной РНК оценивали по экспрессии гена GAPD. Анализ химерных генов TMPRSS/ERG осуществляли с праймерами, последовательность которых описана ранее [14]. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1—2 ед. Taq-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95 °C в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95 °C — 30 с, отжиг и элонгация при 60 °C — 2 мин 30 с. Продукты ПЦР разделяли в 6% денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра. Секвенирование осуществляли по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits («Applied Biosystems», США). Анализ хроматограмм секвенированных последовательностей проводили с помощью программы Chromas. Компьютерный анализ кДНК проводили с использованием баз данных Blast и Blat.

Экспрессия ERG отмечена в 46% аденокарцином и 26% вПИН. Следует отметить, что во всех наблюдениях ERG-положительной вПИН экспрессия белка выявлена в структурах, расположенных вблизи аденокарциномы (рис. 1). У 8 (8%) пациентов отмечена гетерогенная экспрессия ERG: выраженная экспрессия в одних участках сочеталась с полным ее отсутствием в других участках опухоли (рис. 2). Клинико-морфологические характеристики и экспрессия ERG в новообразованиях представлены в таблице.

При оценке зависимости экспрессии ERG и морфологических факторов прогноза отмечено равномерное распределение EGR⁺— и ERG^–-опухолей по стадии процесса и распространенности первичной опухоли (рТ). По данным некоторых авторов [15], экспрессия ERG ассоциирована с более агрессивным ее течением: наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и большим объемом поражения. В нашей выборке различия между группами по данным признакам оказались статистически незначимыми (p=0,2 и p=0,12 соответственно), прогностическое значение экспрессии ERG на текущем этапе исследования выявить не удалось.

Оценка взаимосвязи экспрессии ERG и степени дифференцировки опухоли оказалась невозможной в связи с небольшим количеством наблюдений низкодифференцированной аденокарциномы.

Анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4. Частота перестройки TMPRSS2/ERG4 в образцах РПЖ составила 57% (17/30) (рис. 3). Подлинность химерного гена TMPRSS2/ERG4 подтверждена секвенированием исследуемого фрагмента кДНК (рис. 4). При этом перестройка обнаружена во всех 15 случаях с наличием гиперэкспрессии ERG в опухоли и в 2 случаях с отсутствием гиперэкспрессии. В двух случаях с несовпадающими результатами при повторном пересмотре препаратов предположили, что в связи с мультицентрическим характером роста опухоли в образцах для иммуногистохимического анализа и для ПЦР оказались разные очаги опухоли, при этом в одном случае с одинаковой градацией по шкале Глисона, в другом — с различной. Для подтверждения гипотезы о причине несоответствия результатов повторно проведено иммуногистохимическое исследование на срезах блоков, с которых проводилось выделение РНК для ПЦР, в ходе которого выявлена выраженная экспрессия ERG в анализируемых образцах.

Атипические крибриформные поражения и концепция внутрипротоковой карциномы. Большие диагностические трудности вызывают атипические крибриформные поражения предстательной железы — крибриформные железы, выстланные люминальным эпителием с цитологическими признаками злокачественности и сохранением базального слоя. Подобные структуры могут представлять вПИН или внутрипротоковую (неинвазивную) карциному, в большинстве случаев ассоциированную с агрессивным вариантом инвазивной аденокарциномы предстательной железы. Термин «внутрипротоковая карцинома» впервые введен в 1973 г. для обозначения гетерогенной группы, включающей уротелиальную, плоскоклеточную, протоковую и ацинарную аденокарциному, распространяющуюся по просвету протоков и ацинусов.

Впервые вопросами внутрипротокового распространения интенсивно занялась группа ученых под руководством J. Kovi. Внутрипротоковый рост обнаружен ими в 48% аденокарцином предстательной железы, что было расценено как возможность опухоли к внутрипротоковому распространению с вытеснением нормального эпителия в прилежащих доброкачественных структурах при сохранении общей структуры пораженных протоков [16]. Позднее идея была развита J. McNeal и C. Yemoto, отметившими, что внутрипротоковая карцинома чаще всего ассоциирована с инвазивной аденокарциномой с градацией по шкале Глисона 4 балла, а также экстракапсулярным распространением опухоли, с выраженной периневральной инвазией, наличием метастазов в лимфатических узлах и высокой частотой рецидивов, при этом редко обнаруживалась в опухолях небольшого объема (менее 2 мл), на основании чего высказано предположение, что внутрипротоковая аденокарцинома является формой распространения опухоли, а не предопухолевым поражением [17]. Позднее R. Cohen и соавт. [18] предложили большие и малые морфологические критерии дифференциальной диагностики внутрипротоковой аденокарциномы и вПИН. Пять больших критериев присутствуют, как правило, всегда: 1 — большой калибр желез, более чем в 2 раза превосходящий диаметр нормальных желез периферической зоны, 2 — сохранение слоя базальных клеток, 3 — клеточная атипия, 4 — экспансивный рост клеточных масс в просвет ацинуса, 5 — комедонекроз (присутствует не всегда). К малым критериям относятся: 1 — железы с ветвлением прямоугольной формы или 2 — железы c ровными, округлыми границами, 3 — наличие двух популяций клеток: вытянутые полиморфные клетки с низкой митотической активностью, не экспрессирующие ПСА, — по внешнему периметру, мономорфные клетки кубической формы без признаков митотической активности, с обильной цитоплазмой, содержащей большое количество ПСА — по внутреннему периметру.

В настоящем исследовании во всех 6 случаях с наличием структур внутрипротоковой карциномы отмечена близость их расположения к инвазивной ацинарной аденокарциноме. При этом во всех данных структурах отмечена выраженная экспрессия ERG (рис. 5). Таким образом, определение экспрессии ERG может быть рекомендовано при наличии изолированных атипических крибриформных поражений в игольных биоптатах.

В результате проведенного исследования было отмечено, что относительно низкая частота ERG-положительной вПИН свидетельствует в пользу ограниченной роли данного маркера в дифференциальном диагнозе между вПИН и имитирующими ее доброкачественны-ми процессами. Экспрессия ERG в вПИН вблизи рака служит свидетельством образования химерного гена TMPRSS2/ERG на раннем этапе канцерогенеза и подтверждает теорию опухолевого поля. Наличие ERG⁺— и ERG^–-паттернов в пределах одной опухоли подтверждает мультицентрический рост аденокарциномы предстательной железы, объясняет высокую частоту расхождений клинической и патологоанатомической стадии, различия в определении степени дифференцировки опухоли по результатам пункционной биопсии и радикальной простатэктомии. Согласованность результатов иммуногистохимического анализа и ОТ-ПЦР позволяет использовать иммуногистохимический метод в качестве альтернативы молекулярно-генетическим методам в клинической практике.

Относительно невысокая частота ERG⁺-карцином и низкая ERG⁺ вПИН не позволяет изолированно использовать ERG как маркер дифференциальной диагностики. Панель ERG, P504S и 34βE12 может быть использована в дифференциальной диагностике вПИН и внутрипротоковой карциномы.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15−04−03629 а.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Ю.А., Л.Э.З., Г. А.Ф.

Сбор и обработка материала: Д.О.А., Ю.Ю.А., Т.В.К., А.А.Ш.

Статистическая обработка: Д.О.А., Л.В.М.

Написание текста: Д.О.А., Т.В.К.

Редактирование: Л.В.М., Ю.Ю.А., Л.Э.З., Г. А.Ф.

Конфликт интересов отсутствует.