Врожденная диафрагмальная грыжа (ВДГ) встречается у новорожденных с частотой 1 случай на 2—5 тыс. родов [1] и завершается летальным исходом в 70—90% наблюдений [2]. В зависимости от локализации и площади дефекта ВДГ сопровождается смещением органов из брюшной в правую или левую плевральные полости и аплазией или гипоплазией соответствующего легкого [3]. ВДГ классифицируют на истинные и ложные. Отличительным признаком истинной ВДГ от ложной является наличие грыжевого мешка, представленного резко растянутой и истонченной частью диафрагмы.

В постнатальном периоде среди непосредственных причин смерти новорожденных с ВДГ первое место занимает дыхательная недостаточность, обусловленная гипоплазией легких и неподдающейся коррекции гипертензией малого круга кровообращения [1]. Встречающиеся в публикациях сведения [1] об определенном проценте выживших детей с ВДГ, к сожалению, не учитывают число досрочных прерываний беременности по медицинским показаниям при диагностированном в антенатальном периоде пороке развития. Известно, что к моменту рождения ребенка легкие при ВДГ соответствуют 10—14-й неделе гестационного развития [4]. Об этом свидетельствует редуцированное до 10—14 генераций бронхиальное дерево с дефицитом терминальных отделов вплоть до агенезии бронхиол. Аномальное строение бронхов проявляется диспропорцией соотношения тканевых и фиброзно-хрящевых элементов в оболочках с гипо-, гипертрофией или дисплазией хрящевых пластинок. Паренхима легких, находящаяся в состоянии первичного ателектаза, занимает незначительную часть органа [5] по сравнению со стромой. Изменения в сосудах, как правило, соответствуют степени гипоплазии легкого [6]. В ходе экспериментов доказано формирование гипоплазии легких у овец, обусловленной механической компрессией [1]. Создана модель ВДГ у крыс при воздействии нитрофена и в результате мутации генов Fog2, Gata4 или Gata4+Gata6 [1]. Доказана роль фактора роста фибробластов 10 [1] в развитии аномалии диафрагмы у мышей. У крысят с ВДГ установлено влияние эндотелина CGS26303 на развитие легких [2]. Согласно существующей теории персистенции [1], дефект диафрагмы и гипоплазию легких относят к симультанным порокам. Вместе с тем в эксперименте на эмбрионах крыс доказана первичность двусторонней гипоплазии легких [7] по отношению к дефекту диафрагмы. Принимая во внимание противоречивую, согласно экспериментальным данным, существующую на данный момент информацию, следует отметить, что ни одна из существующих гипотез не объясняет в полной мере патогенез гипоплазии легких при ВДГ [1]. Кроме того, результаты экспериментальных исследований невозможно в полном объеме экстраполировать на человека [5].

Целью исследования явилось изучение в динамике экспрессии факторов роста (IGF-1, PDGF, EGF, TGF-β) в легких плодов и новорожденных 20—40 нед гестации с ложной левосторонней ВДГ.

Исследовали симметричные фрагменты прикорневой зоны передних бронхолегочных сегментов верхних долей правого и левого легкого, полученные при ранних аутопсиях плодов и новорожденных (не более 2 ч после констатации биологической exitus letalis, заключение этического комитета № 6 от 20.10.08) в патологоанатомических отделениях ФГБУ ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова (Иваново) и БУ РПАБ (Чебоксары). Основную группу составили 45 плодов и новорожденных с ложной левосторонней ВДГ. В группу сравнения вошли 45 плодов, не имеющих пороков развития. Легкие исследовали в динамике с 20-й по 40-ю неделю гестации. Каждая из исследуемых групп (по 45 случаев) с учетом срока гестации разделена на 3 подгруппы. В первую подгруппу (n=15) вошли плоды и новорожденные со сроком гестации 20—24 нед. Подгруппа сформирована согласно сведениям, изложенным в публикациях [8], с учетом завершенного формирования терминальных бронхиол. Следовательно, морфология легких у плодов указанных сроков должна соответствовать каналикулярной стадии развития. Вторую подгруппу (n=15) составили новорожденные 25—27 нед гестации. Обозначенные сроки, с одной стороны, являются «пограничными» для оценки морфологической и функциональной зрелости легких, с другой — наиболее дискутабельными в плане формирования какой-то определенной стадии развития легких [8, 9]. В третью подгруппу (n=15) вошли новорожденные с 28-й по 40-ю неделю гестации. Согласно мнению исследователей [9], после 28-й недели структура легких, соответствующая стадии терминального мешка, не претерпевает существенных морфологических изменений и способна обеспечить самостоятельное дыхание даже недоношенному новорожденному. Материал исследовали с использованием иммуногистохимического (ИГХ) метода окраски на парафиновых срезах. В качестве первичных антител («Abcam», Великобритания) использовали мышиные моноклональные антитела класса IgG2a к инсулиноподобному фактору роста 1 (IGF-1) в рабочем разведении 1:100 и кроличьи поликлональные антитела класса IgG к тромбоцитарному фактору роста (PDGF) в разведении 1:50. Мышиные моноклональные антитела класса IgG1 служили первичными антителами к эпидермальному фактору роста (EGF) в разведении 1:50, а IgG − к трансформирующему фактору роста β (TGF-β) в концентрации 1:100. Визуализацию комплекса антиген—антитело осуществляли стрептавидин-биотин-пероксидазным методом с помощью системы детекции LSAB2 System, HRP («Dako», Германия). Результаты ИГХ-реакций оценивали по интенсивности окрашивания путем расчета индекса экспрессии (ИЭ) в 100 клетках в 10 полях зрения светового микроскопа (СМ) при увеличении в 400 раз. Его рассчитывали по формуле: ИЭ=ΣР(i)·i/100, в которой i — интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (нулевая, слабая, умеренная и максимальная); Р(i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью; 100 — количество клеток. Гистостереометрию осуществляли на оцифрованных препаратах с использованием автоматизированных программ Scope Photo 3.0 и Image Tool 3.0. Удельную площадь структурных компонентов при морфометрии легких рассчитывали согласно методикам Г.Г. Автандилова (1990) по отношению площади изучаемой структуры (в мкм²) к стандартной площади среза (в мкм²), умноженному на 100%. При 100-кратном увеличении СМ (Leika Microsystems CMS GmbH DM 1000) в 5 полях гистологического среза вычисляли удельную площадь бронхиального дерева вплоть до уровня терминальных бронхиол. В бронхах рассчитывали удельную площадь слизистой, собственной пластинки слизистой оболочки, подслизистой соединительнотканной основы, фиброзно-хрящевой ткани и адвентициальной оболочки. Дополнительно определяли удельную площадь структурно-функциональной единицы респираторного отдела легкого (ацинуса), ателектазов, дистелектазов, кровоизлияний. Согласно используемой методике, на гистологических срезах, окрашенных по ван Гизону с докраской по Вейгерту, оценивали толщину трех оболочек (интимы, медии и адвентиции), а также наружный и внутренний диаметры сосуда. Для оценки достоверности различий между группами использован непараметрический критерий Манна—Уитни. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала.

Проведенные ИГХ-исследования легких выявили экспрессию IGF-1 и EGF в эндотелии сосудов, стромальных клетках, а также в альвеолярном и бронхиальном эпителии (рис. 1, а). Локализация TGF-β, кроме эпителиальных клеток в легких, обнаружена в гладкомышечных клетках медии артериол и в легочных макрофагах. В сосудистом эндотелии, клетках стромы, цитоплазме и на мембранах бронхиального и альвеолярного эпителия установлена экспрессия PDGF.

ИЭ IGF-1 во фрагментах легких плодов и новорожденных 20—24 нед гестации, родившихся с ложной левосторонней ВДГ, повышен и статистически значим в цитоплазме стромальных клеток межальвеолярных перегородок и междольковой строме как левого (1,05 [0,72—1,16] усл. ед.; р=0,00322), так и правого (0,78 [0,54—0,92] усл. ед.; р=0,02793) легкого. Повышение И.Э. IGF-1 сочетается, согласно морфометрическим параметрам, с увеличением удельной площади соединительной ткани. Вместе с тем ИЭ IGF-1 снижен в альвеолярном эпителии левого (1,18 [1,02—1,38] усл. ед.; р=0,05348) и правого (1,26 [1,08—1,36] усл. ед.; р=0,05793) легкого. Выявленное снижение ИЭ IGF-1 в эпителии альвеол сопряжено с уменьшением удельной площади ацинуса (рис. 2) наряду с увеличением площади дистелектазов и кровоизлияний в легких (рис. 3).

В основной группе плодов и новорожденных 20—24 нед гестации установлено статистически значимое снижение ИЭ TGF-β в бронхиальном эпителии левого легкого до 1,56 [1,35—1,78] усл. ед. (р=0,00762), которое сочетается с завершением дифференцировки и формирования воздухоносных путей [7]. Достоверное снижение экспрессии TGF-β в эндотелии сосудов обоих легких до 1,85 [1,33—2,17] усл. ед. (р=0,00015) и 2,24 [2,02—2,51] усл. ед. (р=0,00299) приводит к дефициту промежуточных ветвей сосудов микроциркуляторного русла, характерному для гипоплазии легких и подтвержденному обзорной морфологией.

Эпителий бронхов в объектах исследования основной группы (20—24 нед) со статистически значимым снижением экспрессии EGF как в левом (0,75 [0,32—1,86] усл. ед.; р=0,00065), так и в правом (0,76 [0,43—1,86] усл. ед.; р=0,00065) легком. Уменьшение И.Э. EGF на данном этапе развития следует связать с завершением формирования и увеличением удельной площади воздухоносных путей [8], подтвержденными морфометрическими параметрами (рис. 4).

Достоверное снижение ИЭ PDGF в альвеолярном эпителии левого (1,85 [1,35—1,95] усл. ед.; р=0,00026) и правого (1,87 [1,53—1,88] усл. ед.; р=0,00041) легкого сочетается с уменьшением удельной площади ацинусов при гипоплазии легких (см. рис. 2). Статистически значимое снижение ИЭ PDGF в бронхиальном эпителии левого (1,24 [1,16—1,42] усл. ед.; р=0,00041) и правого (1,25 [1,21—1,45] усл. ед.; р=0,00041) легкого способствует формированию дефицита терминальных ветвей бронхиального дерева.

Увеличение ИЭ IGF-1 в эпителии бронхов левого (0,78 [0,45—0,83] усл. ед.; р=0,03499) и правого (0,65 [0,53—0,83] усл. ед.; р=0,0220) легкого у новорожденных 25—27 нед при ложной левосторонней ВДГ отражает пролиферативно-митотический потенциал бронхиального эпителия в преобладающих по площади воздухоносных путях при пороке диафрагмы (см. рис. 4).

Для плодов и новорожденных указанной подгруппы характерно повышение экспрессии TGF-β в миоцитах артериол левого легкого (0,36 [0,24—0,42] усл. ед.; р=0,01823). Статистически достоверное снижение ИЭ в эндотелии сосудов до (1,94 [1,76—2,18] усл. ед.; р=0,0030) в левом и до (1,96 [1,75—2,05] усл. ед.; р=0,00145) в правом легком сочетается с дефицитом сосудов микроциркуляторного русла в гипоплазированных органах.

Клетки стромы левого (0,74 [0,44—1,01] усл. ед.; р=0,00414) и правого (0,58 [0,43—0,96] усл. ед.; р=0,01327) легкого экспрессируют EGF. Достоверное увеличение ИЭ происходит на фоне прогрессирующего склероза и фиброза стромы, диагностированных обзорными методами.

По отношению к показателям группы сравнения статистически значимо снижение ИЭ PDGF в альвеолярном эпителии левого (1,56 [1,24—1,87] усл. ед.; р=0,00002) и правого (1,78 [1,53—1,97] усл. ед.; р=0,00002) легкого, в бронхиальном эпителии 1,78 [1,45—2,02] усл. ед. (р=0,00002) и 1,92 [1,56—2,13] усл. ед. (р=0,00002) соответственно, в клетках стромы как на стороне диафрагмального дефекта (1,21 [1,09—1,67] усл. ед.; р=0,00002), так и в контралатеральном органе (1,32 [1,18—1,78] усл. ед.; р=0,00002). При сопоставлении ИГХ-данных с результатами морфометрии и гистологического исследования установлена прямая связь между снижением PDGF в альвеолярном эпителии и уменьшением удельной площади ацинуса при ВДГ (см. рис. 2) на фоне преобладания соединительной ткани. Снижение И.Э. в бронхиальном эпителии происходит на фоне уменьшения удельной площади эпителия в бронхиальном дереве левого легкого.

При ложной левосторонней ВДГ у новорожденных 28—40 нед в легких выявлено увеличение ИЭ IGF-1 в альвеолярном эпителии только левого легкого (0,77 [0,55—0,83] усл. ед.; р=0,0435) (см. рис. 1, б), расположенного на стороне аномалии диафрагмы, что обусловлено отставанием дифференцировки и созревания легких от срока гестации. Так, в левом легком в 46,67% (n=7) диагностирована каналикулярная стадия, в 40% (n=3) — стадия терминального мешка, в 13,34% — псевдожелезистая стадия развития и в одном случае — левосторонняя аплазия легкого. Паренхима правого легкого находится на стадии терминального мешка. Увеличение И.Э. IGF-1 в стромальных клетках (0,73 [0,56—0,87] усл. ед.; р=0,00145) левого легкого при ВДГ вероятнее всего связано с участием фактора в патогенезе склероза. ИЭ IGF-1 в эндотелии сосудов левого (0,32 [0,25—0,44] усл. ед.; р=0,0021) и правого (0,43 [0,33—0,67] усл. ед.; р=0,0435) легкого снижен, что соотносимо с дефицитом сосудов микроциркуляторного русла, диагностированным морфологически.

Выявлено статистически значимое уменьшение экспрессии TGF-β при дефекте диафрагмы в эндотелии сосудов правого (2,37 [2,16—2,58] усл. ед.; р=0,00762) и левого (2,46 [2,02—2,87] усл. ед.; р=0,01721) легкого у новорожденных с ВДГ 28—40 нед гестации, определяющее дефицит сосудов микроциркуляторного русла в легких (см. рис. 1, в, г).

В эпителии бронхов новорожденных с ВДГ ИЭ ЕGF увеличен как в левом (0,68 [0,53—0,92] усл. ед.; р=0,01013), так и в правом (0,71 [0,55—0,83] усл. ед.; р=0,01327) легком при увеличении удельной площади эпителия бронхов, подтвержденном обзорными методами и морфометрией. Удельная площадь эпителия составила 3,13 [2,48—3,68]% (р=0,0004035) справа и 4,79 [3,64—5,23]% (р=0,000001813) слева. ИЭ ЕGF в альвеолярном эпителии легких при ВДГ уменьшен в левом (0,52 [0,35—0,67] усл. ед.; р=0,00145) и в правом (0,48 [0,37—0,62] усл. ед.; р=0,00974) легком. Диспропорция И.Э. в эпителии связана с уменьшением площади ацинуса, увеличением площади ателектазов и кровоизлияний в легких (рис. 5) и определяет морфофункциональную несостоятельность альвеолоцитов. Выраженный склероз гипоплазированного левого легкого, расположенного на стороне диафрагмального дефекта, подтверждается стойким увеличением ИЭ EGF в клетках стромы (0,64 [0,52—0,87] усл. ед.; р=0,02793).

При сроке гестации 28—40 нед в структурах легких плодов и новорожденных продолжает снижаться ИЭ PDGF во всех изучаемых структурах (см. таблицу). Вполне вероятно, что снижение синтеза PDGF к 40-й неделе гестации в легких при ВДГ связано с повреждением рецепторного аппарата клеток или с увеличением синтеза антагонистов.

Динамика значений ИЭ факторов роста в легких плодов/новорожденных 20—40 нед гестации с ложной левосторонней ВДГ доказывает и частично объясняет морфофункциональную незрелость как интактного легкого, так и легкого на стороне грыжевого дефекта диафрагмы. ИГХ-особенностью легких у плодов/новорожденных с ВДГ, выявленной при исследовании, является наибольшее морфологическое и функциональное соответствие ткани обоих органов основной группы показателям группы сравнения в 20—24 нед гестации, которое уменьшается по мере прогрессирования беременности.

Снижение ИЭ PDGF, IGF-1 и EGF в альвеолярном и/или бронхиальном эпителии обоих легких с 20-й недели при сопоставлении с группой сравнения свидетельствует о вероятном участии факторов роста в формировании первичной гипоплазии легких. Нельзя исключить определенную роль PDGF в патогенезе вторичной, или наведенной, гипоплазии легких. Считается, что в период 20—36 нед PDGF не реализует свои эффекты [8], но важно подчеркнуть, что при ВДГ нарушается стадийность развития легких, типичная для группы сравнения.

Склероз в легких при ВДГ объясняется высокими значениями ИЭ IGF-1 и EGF в клетках стромы обоих легких на протяжении всего изучаемого периода. Известно [9], что IGF-1 осуществляет ауто- и паракринную регуляцию пролиферации и дифференцировки клеток, увеличивает транспорт аминокислот и глюкозы в цитоплазму, запускает каскад фосфорилирования белков и ингибирует внутриклеточные протеиназы. Кроме того, IGF-1 и EGF активируют один и тот же трансмембранный тирозинкиназный рецептор, имея общие точки приложения [10, 11]. Эпидермальный фактор роста повышает активность внутриклеточных тирозинкиназ, концентрацию внутриклеточного кальция и усиливает гликолиз.

Доказана роль PDGF и TGF-β в ангиогенезе легких [9, 11, 12]. Дефицит терминальных сосудистых ветвей в легких основной группы, диспропорциональное развитие сосудистой стенки обусловлены увеличением ИЭ TGF-β в медии артериол и мелких артерий, поскольку известно, что фактор роста, выполняя функцию антимитогена, по типу обратной связи регулирует неоангиогенез [11]. Известно [13], что TGF-β ингибирует митоз клетки, вызывая остановку в G0/G1-фазу и препятствуя переходу в S-фазу, следовательно, фактор тормозит пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток и эндотелия, индуцируя дифференцировку клеток-предшественников в перициты. Установлено [11], что TGF-β тормозит переход клеток в S-фазу, способствуя активации PDGF. Последний, действуя в G0/G1-фазу с помощью белков c-foc и c-myc, индуцирует вхождение клетки в S-фазу. В период ангиогенеза [8, 9] сосудистый эндотелий (tip-клетки) экспрессирует PDGF, создавая градиент концентрации фактора, способствующий миграции перицитов и новообразованию капилляров. Важной предпосылкой формирования постнатальной легочной гипертензии капиллярного типа или другого варианта дезадаптации дыхательной системы с клинических позиций является кратковременное повышение ИЭ TGF-β в период интенсивного ангиогенеза (25—27 нед) [8, 9]. В течение последующего периода исследований в легких при ВДГ не обнаружены признаки прогрессирующего развития. Установленный факт свидетельствует об отсутствии прямой зависимости между морфофункциональной полноценностью ткани легких при ВДГ и гестационным сроком в отличие от группы сравнения, в которой степень зрелости легких соотносима со сроком гестации. Полученные ИГХ-данные позволяют расценить изменения в венозном отделе сосудов легких основной группы как вторичные/компенсаторные по отношению к сосудам артериального звена, поскольку в венозных сосудах статистически значимых различий ИЭ факторов роста между группами не выявлено. Нельзя исключить влияние других, не менее значимых факторов роста и цитокинов, участвующих в регуляции дифференцировки и созревания структур в легких, поскольку спектр используемых факторов в данном исследовании ограничен. Неоспоримым остается факт, что структура сосудов и состояние системы кровотока легких при ВДГ соответствуют степени гипоплазии последних [6].

Динамика изучаемых факторов роста (IGF-1, EGF, TGF-β, PDGF) в структурах легких плодов/новорожденных 20—40 нед гестации, имеющих ложную левостороннюю ВДГ, характеризует функциональные изменения в соединительной ткани, сосудах, эпителии бронхов и альвеол. В ходе исследования на основании сопоставления морфологических изменений, морфометрических параметров с результатами пролонгированного иммуногистохимического исследования доказано участие факторов роста (PDGF, IGF-1 и EGF) в формировании первичной гипоплазии легких у новорожденных с ВДГ. В присоединившейся на поздних сроках гестации вторичной гипоплазии легких, кроме недоразвития плевральных полостей и компрессии легкого комплексом органов брюшной полости, определенную роль играет дефицит PDGF, выявленный с 20—24-й недели внутриутробного развития легких.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.П.П., Е.В.А.

Сбор и обработка материала: Е.В.А.

Статистическая обработка: Е.В.А.

Написание текста: Е.В.А., Л.П.П.

Редактирование: Л.П.П., А.И.М., Е.В.А.

Конфликт интересов отсутствует.