Новая коронавирусная инфекция — быстро распространяющееся инфекционное заболевание, вызванное вирусом SARS-CoV-2, встречающееся в популяции до сих пор, после заявления Всемирной организации здравоохранения об окончании пандемии [1]. Многие аспекты патоморфогенеза COVID-19 описаны в мировой и отечественной литературе [2—4], однако вопросы о диссеминации вируса в макроорганизме и механизмах поражения ткани легких остаются открытыми. Особую роль в патогенезе поражения легких могут играть внеклеточные везикулы (ВКВ) — пузырьки, окруженные фосфолипидным бислоем, несущие активные биомолекулы, такие как белки (например, ферменты, поверхностные рецепторы и лиганды), липиды (холестерин, фосфатидилхолин и сфингомиелин) и нуклеиновые кислоты (в частности, ДНК, мРНК, микро-РНК и длинные некодирующие РНК) [5]. ВКВ синтезируются всеми типами клеток эукариот, бактерий и архей [6]. ВКВ включают несколько подвидов, отличающихся по структуре, составу и механизму синтеза: экзосомы, эктосомы, микровезикулы, апоптозные тельца, онкосомы и др. Однако нередко критерии классификации везикул пересекаются, что усложняет их дифференцировку, а в разных источниках приводятся различные подтипы [7—9]. ВКВ принимают участие не только в широком спектре физиологических процессов, но и в развитии заболеваний: было показано, что вирусы могут «перехватывать» пути сборки везикул и использовать их для завершения своего цикла и распространения в макроорганизме [10, 11]. Помимо распространения в организме, ВКВ делают клетки более восприимчивыми к инфекциям путем модуляции экспрессии рецепторов [12, 13], способствуют стабильности и репликации вируса через молекулы хозяина [14] и активируют латентные вирусы с помощью неинфицированных клеток [15]. Еще одной важной ролью ВКВ может являться запуск механизмов иммунной системы ввиду наличия в их составе вирусных частиц [8]. Определение внеклеточных везикул на светооптическом уровне затруднительно вследствие их маленького размера. Наличие везикул можно определять с помощью иммуногистохимического (ИГХ) исследования с антителами к CD63, CD81 и CD9, которые являются белками-тетраспанинами, встречающимися преимущественно в составе экзосом и других внеклеточных везикул [5]. Подобная методика позволяет определять наличие везикул в патолого-анатомической практике.

Цель данного исследования — определить потенциальную роль внеклеточных везикул в межклеточных взаимодействиях при различных вариантах поражения легких в летальных случаях COVID-19.

Материал и методы

Проведен клинико-морфологический анализ 118 летальных исходов от SARS-CoV-2. Критериями включения явились следующие параметры: 1) наличие вируса SARS-CoV-2, подтвержденное прижизненным и/или посмертным ПЦР-исследованием мазка со слизистой оболочки полости рта и/или носа; 2) коронавирусная инфекция — первоначальная причина смерти; 3) упоминание о поражении легких в заключительном патолого-анатомическом диагнозе; 4) полная стационарная медицинская документация.

На вскрытии забирали фрагменты ткани из наиболее пораженных участков легкого с макроскопическими признаками диффузного альвеолярного повреждения (ДАП) и кровоизлияниями. Кусочки легких фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине и проводили по общепринятой методике.

Микроскопическое исследование: изготавливали серийные срезы с парафиновых блоков с последующей окраской гематоксилином и эозином. В 32 (27%) наблюдениях была проведена ИГХ-реакция с использованием моноклональных антител к белкам-тетраспанинам, участвующим во внутриклеточной сборке экзосом (CD63). Параллельно на серийных срезах выполняли ИГХ-исследование с антителами к вирусным белкам: Nucleocapsid, Spike-протеину. Основанием для отбора наблюдений при ИГХ-исследовании являлось наличие определенной формы поражения ткани легких, визуализируемой при гистологическом исследовании. ИГХ-реакцию проводили на серийных срезах с парафиновых блоков. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30 мин согласно предусмотренной фирмой производителем спецификации к антителу. В качестве первичных использовали следующие антитела: Anti-CD63 Rabbit pAb Antibody, производитель Servicebio (GB11620), разведение 1:500 по стандартным методикам, SARS-Cov-2 (COVID-19) Spike Polyclonal Rabbit Antibody, производитель GeneTex (cat. #GTX135356), разведение 1:500, а также SARS-Cov-2 (COVID-19) Nucleocapsid Polyclonal Rabbit Antibody, производитель GeneTex (cat. #GTX135357), разведение 1:500 по стандартным методикам. Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Все ИГХ-микропрепараты были отсканированы с помощью гистосканера Leica Aperio AT2 для дальнейшего морфометрического анализа окрашенных клеток в приложении QuPath. В каждом выбранном наблюдении находили наиболее репрезентативные поля зрения, для каждого варианта поражения легких определяли основные клетки-продуценты ВКВ в различные фазы патологических процессов, производили их подсчет в процентах от общего числа клеток в полях зрения, определяли локализацию вирусных белков, осуществляли сравнение клеток-продуцентов ВКВ и клеточной локализации вирусных белков. Статистический анализ осуществляли, используя коэффициент корреляции Пирсона, статистическую значимость полученных результатов (p-value) интерпретировали с помощью шкалы Чеддока.

Результаты

Гистологическое исследование

При микроскопическом исследовании фрагментов легких среди выбранных для ИГХ-исследования выявили изменения в экссудативной стадии ДАП (рис. 1, а) в 78,1% (25) наблюдений, в стадии пролиферации (рис. 1, б) в 46,9% (15). В 59,8% (19) наблюдений определяли реактивный аденоматоз в виде выраженной пролиферации пневмоцитов II типа с полной выстилкой просветов альвеол и формированием железистоподобных структур. Признаки аденоматоза практически всегда были выявлены в сочетании с диффузным альвеолярным повреждением и лишь в 1 наблюдении были изолированными. В 59,8% (19) наблюдений обнаружены признаки альвеолита, сопровождающиеся выраженной инфильтрацией межальвеолярных перегородок и стромы легких (рис. 1, в). Признаки васкулита (рис. 1, г) определяли реже — всего в 28% (9) наблюдений.

Рис. 1. Гистологическое исследование ткани легких.

а — гиалиновые мембраны при ДАП в фазе экссудации; б — очаги плоскоклеточной метаплазии при ДАП в фазе пролиферации; в — выраженная лимфомакрофагальная инфильтрация интерстиция легкого; г — лимфомакрофагальная инфильтрация стенки сосуда.

Окраска гематоксилином и эозином; отсканированные изображения, ×40.

Вышеуказанные формы развивались у различных пациентов как сочетанно, так и изолированно друг от друга, а клеточный состав был схожим: в исследованных зонах преобладали альвеолярные макрофаги, пневмоциты II типа, лимфоциты, нейтрофилы. Число макрофагов при ДАП было высоким даже с самых первых дней заболевания.

Иммуногистохимическое исследование

Наиболее яркое окрашивание везикул определяли в альвеолярных макрофагах, пневмоцитах II типа, эндотелиоцитах, лимфоцитах, лейкоцитах. Также окрашивание выявляли в мезотелии, бронхиальном эпителии, фибробластах, гладкомышечных клетках, однако интенсивность и частота окрашивания последних были сравнительно ниже. Характер окрашивания цитоплазматический, гранулярного вида преимущественно в субапикальной области клеток. При большом увеличении определяли и зернистое окрашивание во внеклеточной области, близкое к поверхности мембраны (рис. 2, а). Клеточная локализация и характер ИГХ-окрашивания антителами к CD63 соответствовали клеточной локализации вирусных частиц, которая была показана в нашем предыдущем исследовании [16]. При проведении ИГХ-реакции с антителами к вирусным белкам (S-белок и нуклеокапсид) окрашивание обнаруживали с первых дней заболевания в цитоплазме и реже в ядрах аналогичных клеток, преимущественно в макрофагах, пневмоцитах как I, так и II типа, эндотелиоцитах, а также в лейкоцитах и бронхиальном эпителии (рис. 2, б).

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование ткани легких.

а — цитоплазматическое окрашивание макрофагов и пневмоцитов II типа антителами к CD63 при ДАП в стадии экссудации; б — цитоплазматическое окрашивание макрофагов и пневмоцитов II типа антителами к Nucleocapsid при ДАП в стадии экссудации; в — окрашивание макрофагов и пневмоцитов II типа антителами к CD63 при ДАП в стадии экссудации; г — окрашивание пневмоцитов II типа в очагах аденоматоза и плоскоклеточной метаплазии антителами к CD63 при ДАП в фазе пролиферации; д — окрашивание макрофагов и лимфоцитов антителами к CD63 при альвеолите; е — окрашивание макрофагов, лимфоцитов и эндотелиоцитов антителами к CD63 при васкулите. ИГХ реакация, а, б — ×1000, в — е —отсканированные изображения, ×40.

Диффузное альвеолярное повреждение и аденоматоз

В наблюдениях с экссудативной фазой ДАП наиболее яркое окрашивание везикул определяли в макрофагах, пневмоцитах II типа и эндотелиоцитах (рис. 2, в). Средняя доля окрашенных макрофагов составила 94,4%, пневмоцитов II типа — 86,4%, эндотелиоцитов — 59,3%. S-белок был обнаружен в 86,9% макрофагов, в 90% пневмоцитов II типа и в 20,9% эндотелиоцитов, а окрашивание антителами к нуклеокапсиду обнаруживали в 90,2% макрофагов, в 92,2% пневмоцитов II типа, в 36,6% эндотелиоцитов. В пролиферативную фазу ДАП клеточный состав был идентичен. Средняя доля окрашенных макрофагов антителами к CD63 составила 95%, пневмоцитов II типа — 91,9%, эндотелиоцитов — 62,2%. S-белок в пролиферативную фазу ДАП был выявлен в среднем в 87% макрофагов, в 99,4% пневмоцитов II типа, в 41,5% эндотелиоцитов. Нуклеокапсид был обнаружен в 93,2% макрофагов, в 99,8% пневмоцитов II типа и в 41,5% эндотелиоцитов.

В наблюдениях с аденоматозом везикулы были выявлены в 96% макрофагов, в 92,1% пневмоцитов II типа и в 62,8% эндотелиоцитов. Среди особенностей можно отметить особо яркое гранулярное субапикальное окрашивание пневмоцитов II типа при развитии реактивного аденоматоза, а также снижение интенсивности окрашивания до единичных гранул или до тотального отсутствия окраски в очагах плоскоклеточной метаплазии пневмоцитов II типа (рис. 2, г). S-белок определялся в 94,9% макрофагов, в 98,9% пневмоцитов II типа, в 26,1% эндотелиоцитов. Нуклеокапсид был обнаружен в 95,6% макрофагов, в 99,7% пневмоцитов II типа, в 37% эндотелиоцитов.

Альвеолит

При исследовании наблюдений с альвеолитом чаще всего окрашивание антителами к CD63 было обнаружено в макрофагах, лимфоцитах, эндотелиоцитах прилежащих мелких сосудов (рис. 2, д). Средняя доля окрашенных макрофагов составила 91,7%, лимфоцитов —70,7%, эндотелиоцитов — 64,5%. Интенсивность окрашивания эндотелиоцитов была заметно ярче в сравнении с наблюдениями при ДАП. Как уже было сказано выше, в некоторых наблюдениях среди клеток воспалительного инфильтрата встречали и немногочисленные лейкоциты, яркое цитоплазматическое окрашивание которых было выявлено в 100% обнаруженных клеток. Вирусные белки определены в цитоплазме макрофагов и эндотелиоцитов. Среднее окрашивание антителами к S-белку установлено в 90,6% макрофагов и 24,3% эндотелиоцитов. Нуклеокапсид был выявлен в 83,7% макрофагов и в 32% эндотелиоцитов.

Васкулит

В полях зрения с воспалением сосудистой стенки наиболее интенсивное окрашивание было выявлено в макрофагах (89,6%), лимфоцитах (74,9%) и эндотелиоцитах (59,5%) (рис. 2, е). Средняя доля окрашенных антителами к S-белку эндотелиоцитов составила 12,2%, против нуклеокапсида 25,1%.

Обсуждение

Результаты предыдущего исследования, в котором мы наблюдали локализацию вирусных белков в тех же клетках, что и маркеров экзосом, доказывают роль ВКВ в патогенезе COVID-19 [16]. В настоящем исследовании ВКВ, как и вирусные белки, были обнаружены в различных клетках при всех формах поражения легких. Ключевыми клетками-продуцентами ВКВ явились макрофаги, пневмоциты II типа, эндотелиоциты, лимфоциты, лейкоциты. Окрашивание вирусных белков имело схожий гранулярный цитоплазматический характер. Основные клетки, в которых были выявлены вирусные частицы: макрофаги, пневмоциты II типа и эндотелиоциты, что сопоставимо с основными продуцентами ВКВ (рис. 3).

Рис. 3. Средняя доля CD63-положительных клеток при разных вариантах поражения легких.

Среднее и 95% доверительный интервал доли окрашенных клеток антителами к CD63.

Самым частым вариантом поражения легких при COVID-19 является диффузное альвеолярное повреждение, патогенез которого напрямую зависит от ВКВ. Антигены микроорганизмов или эндогенные молекулы, связанные с повреждением клеток (danger- or pathogen-associated molecular patterns), которые могут секретироваться с помощью экзосом, взаимодействуя с Toll-подобными рецепторами пневмоцитов и альвеолярных макрофагов, активируют врожденную иммунную систему и приводят к повышению проницаемости сосудов и активации нейтрофилов [17, 18]. Повреждение альвеолоцитов приводило к повышению продукции ими экзосом и микровезикул с дальнейшей активацией макрофагов, синтезирующих провоспалительные вещества, такие как воспалительный протеин макрофагов 2 (MIP-2), привлекающих и активирующих в ткани легких нейтрофилы [20]. Нейтрофилы являются авангардом неспецифического иммунного ответа, активация которых на ранних этапах ДАП приводит к повреждению эпителиоцитов, повышению проницаемости и отеку. На начальных этапах ДАП лейкоциты и макрофаги действуют содружественно, запуская каскад провоспалительных механизмов, однако было показано, что в дальнейшем нейтрофилы с помощью секреции везикул могут осуществлять обратный противовоспалительный эффект и ускорять репарацию тканей [19]. Макрофаги, как полагается, являются основным продуцентом ВКВ не только при COVID-19, но и при других инфекционных процессах [20]. В настоящем исследовании обнаружили ВКВ в цитоплазме и на поверхности макрофагов при всех формах поражения легких, а среднее число окрашенных макрофагов было наибольшим среди прочих исследованных клеток (см. рис. 3). Также было показано, что макрофаги, содержащие вирусные частицы, могут способствовать распространению SARS-CoV-2 в легких, приводя к инфицированию другие клеточные популяции и дальнейшему распространению возбудителя в организме хозяина [21]. Генерализация SARS-CoV-2 будет способствовать взаимодействию с адаптивной иммунной системой организма и формированию иммунитета.

Во все фазы ДАП и при аденоматозе ВКВ выявлены в пневмоцитах II типа. В некоторых наблюдениях с пролиферативной фазой ДАП число окрашенных клеток в нашем исследовании достигало 100%, а в очагах плоскоклеточной метаплазии это число и интенсивность окрашивания заметно снижались. При исследовании наблюдений с аденоматозом было выявлено, что пневмоциты II типа активно участвуют в продукции ВКВ, так как среднее число окрашенных клеток достигало 92,1%, а яркость окрашивания была заметно выше, чем в очагах плоскоклеточной метаплазии. Вероятно, пневмоциты II типа могут выполнять двоякую роль: быть активными участниками регуляции воспаления, активируя макрофаги на начальных этапах с помощью синтеза ИФН-гамма, а затем в случаях метаплазии в связи с сохранением в их цитоплазме вирусных частиц выступать в качестве инертной «тюрьмы». Стоит полагать, что пневмоциты II типа могут участвовать в хронизации процесса и потенциальном развитии постковидного синдрома.

Еще одними основными продуцентами ВКВ являются эндотелиоциты [22]. В мировой литературе и в нашем исследовании было показано, что вирусные частицы находились внутри эндотелиальных клеток, но в настоящее время неясно, поддерживают ли эти клетки репликацию вируса in vivo и способствует ли инфицирование этих клеток тяжести заболевания [2]. Однако течение коронавирусной инфекции у большинства пациентов особенно в летальных случаях сопровождалось серьезными, порой, жизнеугрожающими сосудистыми осложнениями: от синдрома гиперкоагуляции с ишемическими повреждениями внутренних органов и полиорганной недостаточности до геморрагического синдрома. Наличие ACE2 на эндотелиальных, гладкомышечных клетках и периваскулярных перицитах почти во всех органах указывает на то, что SARS-CoV-2 может легко диссеминировать по всему организму после попадания в систему кровообращения [23]. Секреция ВКВ эндотелиальными клетками оказывает провоспалительное действие, приводя к повреждению межклеточных контактов, активации нейтрофилов, которые путем нетоза могут вновь повреждать эндотелиоциты, замыкая порочный круг [22, 24].

Выводы

1. Ключевыми клетками-продуцентами внеклеточных везикул, в которых также содержатся белки вируса SARS-CoV-2, являются макрофаги, пневмоциты II типа, эндотелиоциты, лейкоциты.

2. Внеклеточные везикулы являются механизмом диссеминации возбудителя в организме хозяина.

3. Диссеминация вируса SARS-CoV-2 приводит к взаимодействию с адаптивной иммунной системой и формированию иммунитета.

4. Внеклеточные везикулы являются ключевым механизмом в межклеточных взаимодействиях в патогенезе различных форм поражения легких.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.А. Зарубин, Е.А. Коган, А.М. Авдалян, Д.Н. Проценко

Сбор и обработка материала — Е.А. Зарубин, Н.В. Жарков.

Статистическая обработка — Е.А. Зарубин.

Написание текста — Е.А. Зарубин, Е.А. Коган.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.