Влияние экстрактов головного мозга человека на клетки культуры нейробластомы

Авторы:
  • Н. Ю. Каралян
    Кафедра патанатомии и клинической морфологии Ереванского государственного медицинского университета, Ереван, Республика Армения
  • Л. О. Аброян
    Лаборатория клеточной биологии и вирусологии Института молекулярной биологии НА РА, Ереван, Республика Армения
  • Л. А. Акопян
    Лаборатория клеточной биологии и вирусологии Института молекулярной биологии НА РА, Ереван, Республика Армения
  • Н. Г. Хостикян
    Кафедра патанатомии и клинической морфологии Ереванского государственного медицинского университета, Ереван, Республика Армения
  • Н. Г. Нерсисян
    Лаборатория клеточной биологии и вирусологии Института молекулярной биологии НА РА, Ереван, Республика Армения
  • З. Б. Семерджян
    Лаборатория клеточной биологии и вирусологии Института молекулярной биологии НА РА, Ереван, Республика Армения
  • З. А. Каралян
    Лаборатория клеточной биологии и вирусологии Института молекулярной биологии НА РА, Ереван, Республика Армения
Журнал: Архив патологии. 2018;80(6): 29-34
Просмотрено: 1393 Скачано: 78

Известно, что при старении головного мозга наблюдается пролиферация клеток глии. В работе V. Lombardi и соавт. [1] показано ускорение пролиферативных процессов в клетках микроглии в условиях in vitro под воздействием сыворотки крови пациентов с болезнью Альцгеймера, а M. Nieto-Sampedro [2] выявил схожее воздействие на астроциты экстрактов мозга.

Увеличение активности микроглии, вероятно, имеет универсальный характер и наблюдается как при старении, так и при различных нейродегенеративных состояниях [3]. Сравнительное исследование патолого-анатомических и патофизиологических механизмов при старении и ряде нейродегенеративных заболеваний выявило если не идентичную, то достаточно схожую картину изменений [4]. Таким образом, можно предположить, что с возрастом происходит накопление и/или секреция биологически активных факторов, модифицирующих физиологическое состояние клеток глии.

В связи с этим мы изучили влияние экстрактов головного мозга человека разных возрастных групп на возможные изменения морфологии и поведения клеток в условиях in vitro.

Материал и методы

Экстракты головного мозга человека. Образцы мозговой ткани человека получены через 12—24 ч после вскрытия. Фронтальные части коры головного мозга замораживали при –32 °С. Фронтальные части мозга хранили при –30 °С до использования и затем гомогенизировали в трех объемах холодного 25 мМ буфера трис-HCl; pH 7,4, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола (DTT) и 0,1 мМ пиридоксаль-5’-фосфата. Гомогенаты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин при 40 °C [5]. M. Arvaniti и соавт. [6] брали экстракт мозга молодых людей (ЭММЛ), умерших в возрасте 22,5±2,7 года, и старых (ЭМСЛ), которым на момент смерти было 80,9±3,0 года. Хранение экстрактов до начала экспериментальной работы осуществляли при –80 °С. Количество экстрактов в группе ЭМСЛ — 9, а в группе ЭММЛ — 4.

Клетки. Культуру клеток нейробластомы SK-N-MC культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Посевная доза клеток составляла 105 клеток/мл. В контрольных исследованиях (в качестве положительного контроля) использовали человеческую сыворотку в дозе 50 мг/мл.

Цитофотометрия ДНК. С помощью микроскопа-фотометра SMP-05 телевизионным методом после окраски препаратов реактивом Шифа по Фельгену определяли количество ДНК (длина волны 575 нм) в ядрах культуры клеток. В качестве диплоидного стандарта использовали нестимулированные лимфоциты человека и выявляли распределение клеток культуры по плоидности. Данная методика удобна для определения нарушений клеточного цикла, а также полиплоидизации [7].

Окраска кислых белков быстрым зеленым (Fast green FCF). Окраску быстрым зеленым применяли согласно Brumberg, Pevzner, 1978. Подобная окраска является количественным методом для определения кислых (негистоновых) белков ядра [8, 9]. С помощью данного метода изучали количество кислых белков цитоплазмы ядра и ядрышка. Содержание кислых белков определяли отдельно в ядре и ядрышках.

Поляризационная микроскопия. Поляризационную микроскопию применяли для изучения морфологических характеристик созревания и дифференцировки клеток в культуре. Данная методика основана на способности двойного лучепреломления и используется для исследования неокрашенных и живых клеток [10].

Результаты

Исследование токсичности экстрактов привело к выводу, что диапазон концентраций экстракта головного мозга человека, являющийся нетоксичным для клеток SK-N-MC, составляет 0,1—100 мг/мл. При концентрации экстракта головного мозга человека 0,1 мг/мл стимулирующего пролиферацию клеток действия состава выявлено не было. Составы с концентрацией экстракта 100 мг/мл применять нецелесообразно из-за опасности токсического воздействия на клетки и повреждения клеточного монослоя. После нескольких экспериментальных воздействий с различными концентрациями выбрана доза 50 мг/мл. Надо добавить, что в одинаковых концентрациях ЭММЛ несколько более токсичны по сравнению с ЭМСЛ.

Параллельно поставлены опыты с положительным контролем с использованием вместо экстрактов мозга человека сыворотки крови в аналогичных дозах. Однако в изучаемых дозах сыворотка крови человека не вызывала изменений по сравнению с контролем (поэтому при описании дальнейших исследований эти данные не приводятся).

Из таблицы

Популяционные показатели клеток SK-N-MC под воздействием экстрактов мозга человека Примечание. *— достоверно ниже по сравнению с контролем (p<0,05–0,01); ** — достоверно выше по сравнению с контролем (p<0,05).
следует, что ЭМСЛ вызывает достоверное повышение митотической активности клеток SK-N-MC при 48-часовой инкубации. Более раннего эффекта (на 24 ч) не обнаружено. В дальнейшем активизация пролиферации, вызванная ЭМСЛ, снижается, постепенно доходя до значений контроля. Воздействие ЭММЛ на пролиферативную активность уже через 24 ч после начала инкубации подавляло пролиферацию клеток SK-N-MC. Этот эффект постепенно снижался, но разница с контролем продолжала оставаться достоверной и при 48-часовой инкубации.

По данным литературы, контрольная популяцияsk-N-MC в целом псевдодиплоидная — модальное количество хромосом в ней колеблется от 43 до 50, однако примерно 4% клеток культуры полиплоидны, что совпадает с данными R. Seeger и соавт. [11]. На рис. 1 видно,

Рис. 1. Распределение ядер клеток культуры SK-N-MC по классам плоидности после 24-часового воздействия экстрактов (а), после 48-часового воздействия экстрактов (б).
что около 1/3 популяции культуры SK-N-MC составляют тетраплоидные клетки, примерно столько же приходится на клетки с «промежуточными» (Н2с< и Н4с<) значениями содержания ДНК в ядре. Это свидетельствует о прохождении ими фазы синтеза ДНК и процесса формирования 4с- и даже 8с-клеток и дальнейшем их блоке в фазе G2 митотического цикла. Возможно, что некоторая часть 4с-клеток вступает в следующий цикл, вторично проходит фазы S и G2 и превращается в 8с-клетки. В целом при анализе гистограммы распределения ядер клеток SK-N-MC по классам плоидности ДНК в контрольной популяции заметно, что уровень полиплоидных клеток (8с и более 8с) составляет в среднем 6,7±0,6% (см. рис. 1, б), что выше, чем в цитируемой литературе. Небольшую разницу в количестве полиплоидных клеток по сравнению с данными R. Seeger и соавт. [11] можно объяснить использованием насыщенного монослоя и в результате этого блоком клеток в фазе G2.

Под воздействием ЭМСЛ происходит сдвиг гистограммы распределения ядер клеток SK-N-MC по классам плоидности ДНК влево. С учетом данных, касающихся пролиферативных изменений в клетках (см. таблицу), можно заключить, что при воздействии ЭМСЛ происходит деблокирование клеток, находящихся в фазе G2 (что приводит к увеличению митотической активности культуры). При воздействии ЭММЛ происходят гибель чувствительных клеток и блок некоторых клеток в фазе G2 (в целом сдвиг происходит на фоне подавления митотической активности культуры).

Одновременно с этим происходят и изменения в морфологии клеток SK-N-MC. Как видно на рис. 2, в

Рис. 2. Морфологические изменения клеток SK-N-MC в контроле и под воздействием экстрактов мозга человека. а, б — контроль 72 ч; в, г — 48-часовое воздействие ЭМСЛ; д, е — 48-часовое воздействие ЭММЛ. Шкала — 20 мкм.
контрольной популяции клеток SK-N-MC через 48—72 ч после начала культивации начинают образовываться длинные отростки, превышающие длину тела клетки в несколько раз (рис. 2, а, б). Под воздействием ЭМСЛ у значительной части клеток культуры меняется морфология, происходит значительное укорочение отростков клеток (см. рис. 2, в, г). Клетки из отростчатых становятся полигональными, что больше характерно для эпителиоидных клеток. При воздействии ЭММЛ (см. рис. 2, д, е) клетки сохраняют полигональную форму, однако отростки клеток значительно укорочены по сравнению с контрольными. Также отмечается уменьшение размеров клеток.

Изменения количественных показателей содержания кислых белков в различных частях клеток в контроле и под воздействием ЭМСЛ представлены на рис. 3.

Рис. 3. Количественные изменения кислых белков в клетках SK-N-MC в контроле и под воздействием ЭМСЛ. Данные контрольных клеток приняты за 100%.
На рис. 3 не приведены данные по изменению аналогичных показателей при воздействии ЭММЛ, так как последние достоверно не отличались от контроля. Как видно на рис. 3, в цитоплазме клеток, получивших ЭМСЛ, происходит достоверное возрастание содержания кислых белков в сроки 24—72 ч после начала опыта (а). В эти же сроки снижается содержание кислых белков в ядре (в). В ядрышке содержание кислых белков после кратковременного подьема к 24-му часу после начала опыта © (p<0,1) сменяется длительным снижением данного показателя.

Обсуждение

Под влиянием ЭМСЛ снижается содержание кислых белков в ядре и ядрышке при сохранении их размеров. В цитоплазме происходят обратные процессы — увеличивается содержание кислых белков. При этом под воздействием ЭММЛ эти же показатели в целом остаются без заметных изменений. Одновременно с этим возникают выраженные изменения морфологии и поведения клеток в условиях in vitro — укорачиваются отростки клеток нейронального происхождения и увеличивается их пролиферационная активность. Последнее не в последнюю очередь является следствием деблокирования клеток, находящихся в фазе G2 при воздействии ЭМСЛ.

Учитывая, что кислые белки чаще всего имеют ферментативную активность и в цитоплазме в основном связаны с синтезом белка (B. Setyono и соавт., 1979) [12], можно предполагать усиление синтетических процессов в клетках SK-N-MC под влиянием ЭМСЛ. Уменьшение количества кислых белков в ядре и ядрышках клеток связано с деблокированием клеток, находящихся в фазе G2 (следовательно, и с уменьшением количества ДНК) и носит кратковременный характер.

Патология мозга (механическая травма, болезнь или даже нормальное старение) вызывает сильную пролиферативную реакцию, называемую астроглиозом [13]. Астроглиоз можно рассматривать как попытку восстановить гомеостаз в поврежденном мозге с помощью важных функций, включая формирование глиального шрама, регуляцию иммунных реакций и модуляцию выживаемости нейронов [14]. Это приводит к морфологическим и функциональным изменениям клеток нейронального происхождения [15].

Повышение содержания кислых белков в цитоплазме клеток SK-N-MC под воздействием ЭМСЛ свидетельствует, с одной стороны, об активации синтетических процессов в клетке, а с другой — о ее старении [16].

Показано, что ЭММЛ не усиливает (в некоторой степени даже снижает), а ЭМСЛ усиливает пролиферацию клеток культуры. Изменение морфологии клеток под воздействием ЭМСЛ говорит об упрощении структуры клеток.

На сегодняшний день глиальные клетки, поддерживающие цитоархитектуру и гомеостатическую регуляцию, без которых нейроны не могут нормально функционировать в здоровых тканях, являются основными клетками, реагирующими на повреждение ЦНС. Изменения функции глиальных клеток во время ответа на патологию могут сильно влиять на нейронные взаимодействия и функции ЦНС [17]. Таким образом, реакция клеток ЦНС на повреждение рассматривается как одно из проявлений восстановления поврежденной ткани, свойственной практически всем биологическим объектам [17].

Полученные данные свидетельствуют о накоплении с возрастом в мозге человека факторов, ускоряющих пролиферацию клеток в условиях in vitro. Одновременно с ускорением пролиферации клеток происходит изменение метаболической активности и морфологии клеток. Показано, что факторы, стимулирующие подобные реакции, легко экстрагируются и сохраняют свою биологическую активность в условиях in vitro. Действие ЭММЛ является более токсическим и не вызывает усиления пролиферации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Каралян Наира Юрьевна — e-mail: naira_karalyan@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3401-0939

Список литературы:

  1. Lombardi VR, García M, Cacabelos R. Microglial activation induced by factor(s) contained in sera from Alzheimer-related ApoE genotypes. J Neurosci Res. 1998;54(4):539-553.
  2. Nieto-Sampedro М. Astrocyte mitogenic activity in aged normal and Alzheimer’s human brain. Neurobiol Aging. 1987;8(3):249-252.
  3. Mrak RE, Griffin WS. Glia and their cytokines in progression of neurodegeneration. Neurobiol Aging. 2005;26(3):349-354.
  4. Goldgaber D, Lerman MI, McBride WO, Saffiotti U, Gajdusek DC. Isolation, characterization, and chromosomal localization of human brain cDNA clones coding for the precursor of the amyloid of brain in Alzheimer’s disease, Down’s syndrome and aging. J Neural Transm. 1987;24(Suppl.):23-28.
  5. Cuchillo-Ibañez I, Mata-Balaguer T, Balmaceda V, Arranz JJ, Nimpf J, Sáez-Valero J. The β-amyloid peptide compromises Reelin signaling in Alzheimer’s disease. Sci Rep. 2016;6:31646. https://doi.org/10.1038/srep31646
  6. Arvaniti M, Jensen MM, Soni N, Wang H, Klein AB, Thiriet N, Pinborg LH, Muldoon PP, Wienecke J, Imad Damaj M, Kohlmeier KA, Gondré-Lewis MC, Mikkelsen JD, Thomsen MS. Functional interaction between Lypd6 and nicotinic acetylcholine receptors. J Neurochem. 2016;138(6):806-820. https://doi.org/10.1111/jnc.13718
  7. Fujikawa-Yamamoto K, Miyagoshi M, Ota T, Yamagishi H. Haploid unit-ploidy transition of tetraploid and octaploid H1 (ES) cells in long-term culturing. Hum Cell. 2011;24(2):78-85. https://doi.org/10.1007/s13577-011-0017-0
  8. Dhar AC, Shak CK, Citichemical method to localize acidie nuclear poteins. Stain Technol. 1982;57(3):151-155.
  9. Zirkin BR. A cytochemical study of the nonhistone protein content of condensed and extended chromatin. Exp Cell Res. 1973;78(2):394-398.
  10. Kroese AB, van Netten SM. The application of incident light polarization microscopy for the visualization of vertebrate sensory hair cells in vivo. J Microsc. 1987;45(Pt3):309-317.
  11. Seeger RC, Rayner SA, Banerjee A, Chung H, Laug WE, Neustein HB, Benedict WF. Morphology, growth, chromosomal pattern, and fibrinolytic activity of two new human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1977;37(5):1364-1371.
  12. Setyono B, Schmid HP, Köhler K. The role of acidic proteins from cytoplasmic fractions of Krebs II ascites cells for efficient translation. Z Naturforsch C. 1979;34(1-2):64-75.
  13. Pekny M, Nilsson M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 2005;50(4):427-434.
  14. Sofroniew MV. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 2009;32(12):638-647. https://doi.org/10.1016/j.tins.2009.08.002
  15. Aras R, Barron AM, Pike CJ. Caspase activation contributes to astrogliosis. Brain Res. 2012;1450:102-115. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2012.02.056
  16. Goss JR, Finch CE, Morgan DG. Age-related changes in glial fibrillary acidic protein mRNA in the mouse brain. Neurobiol Aging. 1991;12(2):165-170.
  17. Schöll M, Carter SF, Westman E, Rodriguez-Vieitez E, Almkvist O, Thordardottir S, Wall A, Graff C, Långström B, Nordberg A. Early astrocytosis in autosomal dominant Alzheimer’s disease measured in vivo by multi-tracer positron emission tomography. Sci Rep. 2015;5:16404. https://doi.org/10.1038/srep16404