Одним из основных элементов процесса заживления ран после хирургических вмешательств является рубцевание, или фиброз. Начинающаяся приблизительно на 15-й день после ранения фаза ремоделирования может продолжаться до 6 мес и закончиться формированием более плотной рубцовой ткани [1]. Миофибробласты, напоминающие одновременно и фибробласты и гладкие миоциты, обычно появляются в ране, способствуя стягиванию ее краев [2].

Впервые миофибробласты описаны в 1971 г. G. Gabbiani и соавт. [3] в гистологических образцах кожных ран. Миофибробласты — особые клетки, сочетающие сократительную способность гладкомышечных клеток и секреторную активность фибробластов. Первое обеспечивается наличием пучков микроволокон гладкомышечного актина (α smooth muscle actin, α-SMA) в цитоплазме клетки, второе – выраженным эндоплазматическим ретикулумом. Основываясь на этой характеристике, ряд исследователей обнаружили миофибробласты в гистологических образцах ран других органов и тканей [4, 5]. Выявлено, что миофибробласты отсутствуют в неповрежденных тканях и появляются в ране, «активируясь» из ряда других типов клеток, прежде всего фибробластов. Трансформация клеток-предшественников в миофибробласты происходит в ответ на воздействие ряда медиаторов фиброза, таких как трансформирующий фактор роста β и фактор роста соединительной ткани [6, 7]. После заживления ран миофибробласты подвергаются апоптозу или деактивируются [8].

Фиброз является также одним из наиболее важных элементов заживления ран при дакриоцисториностомии (ДЦР). Данная операция, применяемая при нарушении слезоотведения, предполагает создание соустья (дакриостомы) между полостью слезного мешка и полостью носа. Фиброз искусственного соустья может привести к его облитерации рубцовой тканью и, как следствие, регрессу эффекта операции [9]. Причиной этого, по-видимому, является продолжающаяся после окончания процесса заживления активность миофибробластов, которая поддерживается упомянутыми выше медиаторами [2].

Попытки выявления факторов, предрасполагающих к избыточному рубцеванию, предпринимались рядом авторов. Так, L. Heindl и соавт. [10] определили, что субэпителиальный фиброз в слизистой оболочке полости носа, являющийся результатом хронического воспаления, сопутствует неблагоприятному исходу ДЦР. Данные результаты подтверждают и исследования других авторов [11, 12], указывающих на связь явлений хронического воспаления слизистой оболочки полости носа с неблагоприятным исходом ДЦР.

Z. Koturović и соавт. [13] отметили, что наиболее частой находкой при гистологическом исследовании получаемых при ДЦР образцов является негранулематозное хроническое воспаление с явлениями фиброза.

O. Ozer и соавт. [14] предложили использовать коэффициент хронического воспаления (КХВ) при оценке гистологических образцов, основанный на определении интенсивности воспалительной инфильтрации, интенсивности фиброза и пролиферации капилляров. Авторы обнаружили связь между величиной данного коэффициента и частотой возникновения рецидива при ДЦР.

Исследований корреляции между количественной характеристикой миофибробластной инфильтрации слизистой оболочки полости носа и исходом ДЦР проведено не было.

Цель исследования — изучить влияние состояния слизистой оболочки полости носа на результаты дакриоцисториностомии на основании данных морфологического исследования.

В исследование вошли 73 пациента (19 мужчин и 54 женщины), которым была проведена эндоназальная эндоскопическая ДЦР (ЭЭДЦР) по поводу дакриоцистита. Все операции выполнял один хирург. Критериями исключения из исследования являлись заболевания полости носа и околоносовых пазух, требующие лечения, новообразования слезоотводящих путей, вторичные дакриоциститы. В исследование не вошли пациенты, которым на завершающем этапе операции была выполнена интубация дакриостомы лакримальным имплантатом. Все пациенты подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Разрешение на исследование получено от локального этического комитета ФГБНУ НИИ глазных болезней.

До оперативного вмешательства всем пациентам проведены стандартное офтальмологическое обследование, а также «цветные» канальцевая и носовая пробы, промывание слезоотводящих путей, мультиспиральная компьютерная томография слезоотводящих путей с их контрастированием, эндоскопическое обследование полости носа. Критерием неудачного исхода оперативного вмешательства считали повторное возникновение слезотечения на фоне непроходимости слезоотводящих путей при промывании и визуализирующих методах исследования. Срок послеоперационного наблюдения составил 6 мес. Контрольные осмотры осуществляли через 7, 14, 28 дней, 3 и 6 мес после оперативного вмешательства.

В соответствии с исходом оперативного вмешательства пациентов разделили на две группы: 1-я — пациенты с неблагоприятным исходом оперативного вмешательства, 2-я — с благоприятным исходом.

Полнослойные тканевые биоптаты слизистой оболочки полости носа у всех пациентов получены из предполагаемой области дакриостомы в среднем носовом ходе. Забор материала осуществляли до начала оперативного вмешательства после проведения местной анестезии. Оперативное вмешательство выполняли по методике P. Wormald [15].

После получения материал фиксировали в течение 24 ч в 10% растворе нейтрального формалина (pH 7,0±0,2). Фрагменты ткани после обезвоживания в гистопроцессоре карусельного типа STP120 («Thermo Fisher Scientific», ФРГ) заливали в парафин в модульной системе заливки TES-99 («Medite», ФРГ). Гистологические срезы толщиной 4 мкм изготавливали на ротационном микротоме HM340E («Microm GmbH», ФРГ), окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для окрашивания срезов HMS 70 («Thermo Fisher Scientific», ФРГ).

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования использовали коммерческое моноклональное антитело Actin, Smooth Muscle (клон 1A4) фирмы «Cell Marque» (США) в разведении 1:400. Срезы для ИГХ-исследования толщиной 4 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, высушивали в течение 2 ч при температуре 58 °C, затем 18 ч при температуре 37 °C. Восстановление антигенной активности проводили на водяной бане WB-4MS («BioSan», Латвия) в Target Retrieval Solution pH 6,0 («Dako Denmark A/S», Дания). Дальнейшие операции с препаратами выполняли во влажной камере Slide Master («Bio-Optica Milano SpA», Италия). Инактивацию эндогенной пероксидазной активности осуществляли посредством инкубирования с блокирующим раствором («Dako Denmark A/S», Дания) в течение 15 мин. Инкубацию с первичными антителами проводили при температуре 4—8 °С в течение 18 ч. Далее следовала инкубация со вторичными антителами системы детекции REAL En Vision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse («Dako Denmark A/S», Дания) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей двукратной инкубацией с диаминбензидином в хромогенном растворе в течение 3 мин при комнатной температуре. После каждого этапа обработки антителами срезы промывали в фосфатном солевом буфере («Cell Marque», США). На последнем этапе препараты докрашивали гематоксилином Майера («Dako Denmark A/S», Дания) и заключали в синтетическую смолу Shandon-Mount («Thermo Fisher Scientific», ФРГ). Также были проведены реакции с положительным и отрицательным контролем.

Гистологические и ИГХ-срезы анализировали на микроскопе AxioImager Z1 («Carl Zeiss AG», ФРГ). Фотосъемку осуществляли при помощи камеры AxioCam («Carl Zeiss AG», ФРГ) с последующей обработкой изображений в программе AxoVision, version 4.7 («Carl Zeiss AG», ФРГ).

При морфологическом анализе оценивали состояние поверхностного эпителия слизистой оболочки полости носа, наличие, характер и состав инфильтратов собственной пластинки слизистой оболочки, наличие и степень выраженности субэпителиального фиброза, наличие и выраженность плоскоклеточной (сквамозной) метаплазии поверхностного эпителия. Среднее количество α-SMA-позитивных клеточных элементов на 1 мм² вычисляли на основании подсчета в нескольких полях зрения для каждого образца.

Выраженность гистопатологических явлений, ассоциированных с хроническим воспалением, определяли при помощи КХВ, предложенного O. Ozer и соавт. [14]. Для этого при 400-кратном увеличении оценивали в поле зрения выраженность следующих явлений:

1) воспалительной инфильтрации (количество лимфоцитов, гистиоцитов и плазматических клеток в поле зрения): слабая (менее 50 клеток), умереннная (50—200 клеток), выраженная (более 200 клеток);

2) фибротических изменений (содержание фиброзной ткани в поле зрения): слабые (менее 25%), умеренные (25—50%), выраженные (более 50%);

3) капиллярной пролиферации (количество капилляров в поле зрения): слабая (менее 5), умеренная (5—10), выраженная (более 10).

В соответствии с интенсивностью каждого из этих элементов ему присваивали коэффициент от 1 до 3. Таким образом, КХВ каждого образца составлял от 3 до 9 в зависимости от выраженности каждого из перечисленных явлений.

Учитывая тот факт, что позитивное окрашивание по α-SMA характерно не только для миофибробластов, но и для других клеток, в частности для гладких миоцитов, являющихся частью сосудистой стенки, для исключения влияния гладких миоцитов на итоговые показатели α-SMA-позитивных элементов подсчет проводили в отдалении от крупных сосудов, а также использовали усредненные показатели нескольких полей зрения.

Статистическую обработку полученных данных проводили в программе IBMSPSS Statistics v23 («IBM Corporation», США). Корреляционные зависимости признавали статистически достоверными при р<0,05. Все количественные данные представлены в виде средних значений (М±SD).

По результатам послеоперационного наблюдения в 1-ю группу вошли 10 (13,7%) пациентов после ЭЭДЦР с неблагоприятным исходом операции, обусловленным рубцовым заращением дакриостомы (рис. 1).

Во всех образцах обнаружены воспалительная инфильтрация, субэпителиальный фиброз, сквамозная (плоскоклеточная) метаплазия поверхностного эпителия слизистой оболочки. Перечисленные находки свидетельствуют о длительно протекающем воспалении в данной ткани, которое может являться причиной возникновения дакриоцистита. Полученные данные поддерживают мнение ряда исследователей [17—19] о «восходящей» природе патогенеза дакриоцистита: воспалительные явления из полости носа распространяются на вертикальный отдел слезоотводящих путей, приводя к облитерации их просвета рубцовой тканью.

Клеточные элементы, имеющие позитивное окрашивание по α-SMA, выявлены во всех образцах. Среднее количество α-SMA-позитивных клеточных элементов во всех образцах составило 4447±1481. Средний КХВ составил 6,17.

Для образцов тканей, полученных у пациентов 1-й группы, характерен более высокий КХВ 8,33. Диапазон значений КХВ в данной группе составил от 7 до 9. Выраженный фиброз наблюдали во всех образцах. Этому сопутствовала выраженная инфильтрация клеточными элементами, имеющими положительное окрашивание по α-SMA собственной пластинки (рис. 3).

Данные о связи выраженности явлений хронического воспаления, в частности сквамозной метаплазии, с неблагоприятным исходом ДЦР согласуются с наблюдениями G. Smirnov и соавт. [11]. Более выраженное образование грануляционной и рубцовой ткани в послеоперационном периоде в 1-й группе свидетельствует о связи данного явления с процессом рубцевания.

Количественная характеристика миофибробластной инфильтрации представлена в таблице

Таким образом, о влиянии хронического воспаления на исход ДЦР также свидетельствует и выраженность миофибробластной инфильтрации в образцах слизистой оболочки полости носа. Учитывая, что миофибробласты считаются основным клеточным элементом, обеспечивающим процесс фиброза, количественная характеристика их инфильтрации может расцениваться как прогностический фактор интенсивности фиброза в ткани. В настоящем исследовании получена статистически достоверная корреляция между α-SMA-положительными элементами и заращением дакриостомы после ДЦР, что может свидетельствовать о влиянии интенсивности фиброза в ткани слизистой оболочки полости носа на процесс заживления в области дакриостомы. По всей видимости, течение фазы ремоделирования раны, обеспечиваемое миофибробластами, нарушается в результате «перенасыщения» ткани данными клетками в сторону избыточного рубцевания и тормозит тем самым наступление следующей стадии (разрешения), характеризующейся апоптозом миофибробластов и окончательной реорганизацией экстрацеллюлярного матрикса в ране.

В настоящем исследовании установлена корреляция между выраженностью фиброза в субэпителиальном слое носа и плотностью миофибробластов и клиническим эффектом дакриоцисториностомии. Таким образом, патологические изменения слизистой оболочки полости носа в виде хронического воспаления с выраженной активностью пролиферирующих миофибробластов могут являться не только причиной развития дакриоцистита, но и фактором риска неблагоприятного исхода хирургического лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Л.А., А.Ф.А.

Сбор и обработка материала — Н.Н.К., А.Ф.А., А.А.Ф.

Статистическая обработка — Д.А.Р., В.Д.Я.

Написание текста — Д.А.Р., В.Д.Я.

Редактирование — Е.Л.А., А.А.Ф., Н.Н.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Атькова Евгения Львовна — канд. мед. наук, зав. отд-нием патологии слезного аппарата; http://orcid.org/0000-0001-9875-6217

Рейн Д.А. e-mail: illefarn@mail.ru; http://orcid.org/0000-0002-0868-3876

Краховецкий Н.Н., http://orcid.org/0000-0002-3247-8418

Ярцев В.Д., http://orcid.org/0000-0003-2990-8111