Адренокортикальный рак (АКР) представляет собой редкую злокачественную эндокринную опухоль коры надпочечников. Предполагаемая распространенность этого заболевания составляет 1—2 случая в год на 1 млн населения [1] с увеличением частоты встречаемости в 1-й и 4—5-й декадах жизни с более высокой распространенностью среди женщин (соотношение женщины: мужчины 2,5:1) [1, 2]. Клиническая картина заболевания определяется симптомами гормональной опухолевой гиперсекреции практически в 60% случаев [3, 4] (АКТГ-независимая форма гиперкортицизма, вирилизация, смешанная гормональная гиперсекреция), симптомами опухолевой прогрессии (синдромы сдавления, опухолевой интоксикации, болевой синдром) и достаточно часто носит характер случайной находки при радиологическом обследовании (инциденталома надпочечника). Большинство случаев этого заболевания является спорадическими, тем не менее в части наблюдений у пациентов может быть выявлена ассоциация опухоли с герминогенными мутациями в драйверных генах. В этом случае АКР будет являться компонентом того или иного наследственного синдрома, самыми частыми из которых являются синдром Ли—Фраумени (3—5% среди взрослых, 50—80% среди детей) и синдром Линча (3% среди взрослых) [5]. Как правило, АКР имеет неблагоприятный прогноз и крайне агрессивное течение: 5-летняя выживаемость составляет 60—80% для опухолей, ограниченных надпочечником, 35—50% — для местно-распространенных случаев и снижается в случае метастатического процесса, составляя менее 28% [6]. В то же время описаны случаи более благоприятного, индолентного, течения заболевания с медленным прогрессированием и поздним метастазированием.

За последние несколько десятилетий накопленный клиницистами и патоморфологами большой объем знаний о клиническом течении и исходе, морфологической характеристике и молекулярном патогенезе АКР свидетельствует, что определение гистологического варианта опухоли имеет крайне важное значение ввиду морфологической неоднородности этой опухоли. В 2017 г. Международное агентство по изучению рака (International Agency for Research on Cancer, IARC) и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) опубликовали 4-е издание Классификации опухолей эндокринных органов (WHO Classification of Tumors Pathology and Genetics), в котором помимо классического выделено еще 3 морфологических варианта АКР: онкоцитарный, миксоидный и саркоматоидный.

Подтверждение диагноза АКР возможно только при проведении иммуногистохимического (ИГХ) исследования, так как спектр заболеваний, которые необходимо дифференцировать с такой опухолью надпочечника, довольно широк. На сегодняшний день ИГХ-панель включает в себя стероидогенный фактор (SF-1), Inhibin A, Melan A, Calretinin, Synaptophysin, Chromogranin A, эпителиальные маркеры, индекс пролиферативной активности Ki-67.

SF-1 (Ad4 — связывающий протеин (Ad4BP)) является ядерным транскрипционным фактором, играющим ключевую роль в нормальном развитии эндокринной системы и гонад, регулирующим выработку стероидных гормонов в коре надпочечников посредством взаимодействия с цитохромом P-450. В многочисленных исследованиях данный протеин продемонстрировал дозозависимое действие, оказываемое на индукцию пролиферации клеток коры надпочечников за счет изменений в апоптозе и контроле клеточного цикла [7]. Оценка экспрессии Melan A, первоначально считавшейся специфичной в диагностике меланомы, необходима и в случае опухолей надпочечника, так как его иммунореактивность в последующем была описана в кортикальном слое надпочечников, а также других стреоидогенных тканях. Считается, что иммунореактивность для этого маркера в опухолях коры надпочечников обусловлена перекрестной реактивностью с другими эпитопами, а не истинной экспрессией антигена Melan A. Inhibin A — это гормон белковой природы, который присутствует в различных тканях, продуцирующих стероидные гормоны, в том числе демонстрирует стойкую экспрессию в нормальной ткани надпочечников при их гиперплазии и адренокортикальных новообразованиях. Индекс пролиферативной активности Ki-67, оцениваемый при ИГХ-исследовании, позволяет выделить опухолевые клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла на всем его протяжении (G1-, S-, G2- и M-фазы). Существует мнение, что большинство карцином коры надпочечников довольно часто имеет индекс пролиферации, превышающий 5%, аденомы — менее 5%. Кроме того, на сегодняшний день маркер Ki-67 считается наиболее прогностическим морфологическим параметром безрецидивной выживаемости [8]. P53 является транскрипционным фактором, регулирующим клеточный цикл и блокирующим образование злокачественных новообразований, соответственно ген TP53, кодирующий белок p53, является онкосупрессором. Мутации в гене TP53 способствуют накоплению гиперэкспрессии белка p53 в ядрах опухолевых клеток, что позволяет визуализировать эту мутацию с помощью ИГХ-исследования. По разным данным, экспрессия p53 наблюдается в 15—60% АКР [9], таким образом, выявление экспрессии данного маркера может использоваться для дифференциальной диагностики адренокортикальных аденом и карцином. Более того, если у пациентов при исследовании установлено выраженное окрашивание p53, то, как правило, они имеют опухоли с более высоким гистологическим грэйдом, что отражается на стадии опухолевого процесса. С учетом выделения онкоцитарного варианта АКР крайне важно включать в ИГХ-панель антимитохондриальные антитела (АМА) для его дифференциальной диагностики с другими морфологическими вариантами. Тем не менее к настоящему времени все еще не существует четких морфологических критериев для выделения вышеописанных вариантов АКР, также не до конца изучено их клиническое и прогностическое значение.

Цель исследования — подробное описание морфологических вариантов АКР с акцентом на их гистологические характеристики и экспрессию иммуногистохимических маркеров.

Материал и методы

В исследование включено 75 пациентов с новообразованиями надпочечников: 52 женщины и 23 мужчины в возрасте от 18 до 82 лет, медиана 44 года, 52 и 57 лет для классического, онкоцитарного и миксоидного морфологических вариантов АКР соответственно. У 3 пациентов выявлено двустороннее поражение. У всех больных проведена адреналэктомия в период с 2005 по 2020 г. Выполнялось исследование операционного материала пациентов, получивших лечение в НМИЦ эндокринологии Минздрава России, а также материала, поступившего для консультации из других лечебных учреждений. Проведен анализ доступных клинических данных, включающих результаты гормонального и инструментального обследований.

Морфологические методы. Гистологический материал АКР, полученный в ходе хирургического лечения пациентов непосредственно в НМИЦ эндокринологии Минздрава РФ, фиксировали в 10% забуференном формалине, обрабатывали в аппарате гистологической проводки фирмы Leica ASP200 и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, как правило, не превышало 48 ч. В случае проведения оперативного лечения в другом стационаре материалы получали в виде готовых парафиновых блоков. Далее готовили серийные срезы (не менее 10) толщиной 3—4 мкм, которые помещали на полилизиновые стекла (Leica, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 37 °C в течение 12 ч, депарафинировали последовательно в ряде растворов, состоящих из 3 ксилолов, 2 абсолютных спиртов, 80 и 70% спирта, дистиллированной воды, и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.

При гистологическом исследовании опухоли верифицировали в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей надпочечника (ВОЗ, 2017) [2]. В опухолях оценивали паттерн роста, клеточный и ядерный полиморфизм, количество митозов в 10 полях зрения при увеличении микроскопа в 400 раз, наличие некрозов. Тщательно исследовали капсульную, сосудистую опухолевую инвазию, поражение периадреналовой жировой клетчатки.

Для онкоцитарных новообразований надпочечника, характеризующихся зернистой и ярко-эозинофильной цитоплазмой клеток, высоким ядерным полиморфизмом и диффузным характером роста, применяли модифицированную шкалу оценки злокачественного потенциала этих опухолей коры надпочечника Lin—Weiss—Bisceglia, согласно которой онкоцитарный АКР диагностировали при наличии как минимум одного «большого» критерия [10].

Иммуногистохимические методы. ИГХ-исследование проводили на срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах с полилизиновым слоем (Leica, Германия), по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем.

Для ИГХ-исследования были использованы моноклональные антитела к SF1, Inhibin A, Melan A, Ki-67, p53, АМА. Для цитоплазматических и мембранных маркеров оценивали интенсивность экспрессии: 0—20% — 1 балл, 20—70% — 2 балла, 70—100% — 3 балла. Подсчет пролиферативной активности опухолевых клеток (Ki-67) осуществляли визуальным методом в 10 полях зрения при увеличении микроскопа в 400 раз и определяли как процент окрашенных клеточных ядер в участках опухоли с наибольшей активностью (горячие точки). Оценивали экспрессию p53 по наличию или отсутствию окрашенных ядер в 50 полях зрения при увеличении микроскопа в 400 раз.

Результаты и обсуждение

При оценке гистологических препаратов 75 пациентам с АКР выполнена диагностика морфологического варианта заболевания, согласно которой классический подтип выявлен у 51, онкоцитарный — у 15, миксоидный — у 9 (p=0,077) (рис. 1). Саркоматоидный морфологический вариант АКР в данном исследовании диагностирован не был.

Рис. 1. Клинико-патологическая характеристика вариантов АКР.

Классический вариант АКР в исследовании преобладал в 51 (68%) случае, чаще выявлялся у женского пола (соотношение женщины:мужчины 35:16 (2,18)), а пик заболеваемости отмечался в 4—6-й декаде жизни. Функциональная активность опухолей наблюдалась в 43% (18 случаев) классического варианта АКР, при этом наиболее часто клиническая картина проявлялась симптомами гиперкортицизма (38%) и вирилизации (5%).

Для данного подтипа АКР выявлено несколько паттернов: диффузный, характеризующийся солидными полями с практически полным отсутствием стромы (рис. 2, а); трабекулярный — в виде различных по ширине тяжей, разделенных тонкими соединительнотканными перегородками (рис. 2, б); альвеолярный — в виде крупных гнезд (рис. 2, в); псевдожелезистый, формирующий структуры, напоминающие железы с просветом в центре (рис. 2, г); карциноидоподобный (рис. 2, д), сходный по строению с карциноидом; рост в виде цепочек — подобный по строению дольковой карциноме молочной железы. Опухолевые клетки варьировали от среднего размера относительно мономорфных эозинофильных, напоминающих клетки пучковой и сетчатой зоны коры надпочечника, до крупных, выраженно полиморфных и многоядерных гигантских, а также светлых клеток (рис. 2, е, ж). В данном варианте АКР часто встречались обширные очаги некроза, иногда по типу комедонекрозов (рис. 2, з). Сама опухоль, как правило, была заключена в толстую фиброзную капсулу, в которой нередко обнаруживались признаки инвазивного опухолевого роста. Более того, на границе опухоли и капсулы наблюдалась инвазия в кровеносные сосуды. Особого внимания заслуживает тот факт, что в пределах классического гистологического варианта АКР достаточно часто идентифицировали участки гетерогенного строения с различным сочетанием паттернов роста и цитологических особенностей: наличие в пределах одного образования участков из крупных полиморфных клеток солидного строения, а также мономорфных клеток малого или среднего размера, формирующих альвеолярные структуры.

Рис. 2. Паттерны роста классического варианта АКР и его морфологические характеристики.

а — диффузный паттерн характеризуется солидными полями с практически полным отсутствием стромы; б — трабекулярный паттерн в виде различных по ширине тяжей, разделенных тонкими соединительнотканными перегородками; в — альвеолярный паттерн в виде крупных гнезд; г — псевдожелезистый паттерн, формирующий структуры, напоминающие железы с просветом в центре; д — карциноидоподобный паттерн, напоминающий по строению карциноид; е — клетки опухоли крупные, выраженно полиморфные, местами многоядерные, гигантские; ж — клетки опухоли со светлой цитоплазмой; з — в опухоли присутствуют очаги некрозов по типу комедонекрозов; а—з — окраска гематоксилином и эозином, ×100.

Вторым по распространенности морфологическим вариантом АКР в нашем исследовании явился онкоцитарный — 20% (15 случаев), по данным литературы он составляет около 18% [11]. Данный подтип опухоли выявляется на 5—6-м десятилетии жизни и преобладает у женщин в 2,75 раза чаще, чем у мужчин. Ранее считалось, что онкоцитарный вариант АКР довольно редко является гормонально-активным, однако, согласно результатам ряда исследований, гормональная продукция в них может встречаться в 30% наблюдений [12]. В нашем исследовании продукция гормонов при онкоцитарном подтипе опухолей наблюдалась в 4 (33%) случаях и была представлена исключительно избыточной продукцией кортизола. Цитологической особенностью данного варианта является то, что эти опухоли построены преимущественно из онкоцитов. Онкоцитарные клетки АКР в 1—2 раза больше нормальных клеток надпочечника, полиморфны, с зернистой ярко-эозинофильной обильной цитоплазмой и центральным пикнотичным ядром. Зернистость цитоплазмы обусловлена накоплением митохондрий, которые могут занимать до 60% объема клетки. Для этого подтипа АКР выявлено три основных паттерна роста: диффузный (рис. 3, а), трабекулярный (рис. 3, б) и псевдожелезистый (рис. 3, в).

Рис. 3. Паттерны роста онкоцитарного и миксоидного вариантов АКР.

а — онкоцитарный гистологический вариант, диффузный паттерн: солидные поля опухолевых клеток с практически полным отсутствием стромы; б — онкоцитарный гистологический вариант, трабекулярный паттерн в виде различных по ширине тяжей, разделенных тонкими соединительнотканными перегородками; в — онкоцитарный гистологический вариант, псевдожелезистый паттерн: опухолевые клетки формируют структуры, напоминающие железы с просветом в центре; г — миксоидный гистологический вариант, псевдожелезистый паттерн, формирующий структуры, напоминающие железы с просветом в центре; д — миксоидный гистологический вариант с формированием цепочек: рост опухолевых клеток в виде цепочек в миксоидной строме; е — миксоидный гистологический вариант, криброзный паттерн с формированием округлых, резко очерченных просветов; а—е — окраска гематоксилином и эозином, ×100.

Миксоидный вариант АКР характеризуется внеклеточным отложением миксоидного вещества и на сегодняшний день в литературе описано 42 подобных случая [13]. В нашей работе этот подтип опухоли составил 12% (9 случаев) и в 2 раза чаще превалировал в женской популяции с пиком заболеваемости на 6-м десятилетии жизни. Гормональная активность новообразований была выявлена в 2 (22%) случаях из 9 и обусловлена АКТГ-независимым гиперкортицизмом. Для этого подтипа АКР выявлено несколько паттернов: трабекулярный, псевдожелезистый (рис 3, г), рост в виде цепочек в миксоидной строме (рис. 3, д), криброзный (рис. 3, е). Миксоидные опухоли характеризовались относительно мономорфными клетками небольшого и среднего размера с легкой и умеренной ядерной атипией и скудной светлой эозинофильной цитоплазмой.

Миксоидный матрикс обычно положительно окрашивался альциановым синим и являлся отрицательным в отношении муцикармина или PAS-реакции. Следует отметить, что иногда в миксоидном варианте встречались немиксоидные области, представленные классическим вариантом АКР из эозинофильных или светлых клеток с диффузным, трабекулярным или гнездным типом роста.

Этиология и значение миксоидных изменений в АКР являются предметом дискуссии до настоящего времени. В 1994 г., в одном из самых ранних сообщений об этом варианте карциномы Forsthoefel предположил, что такие изменения являются проявлением дегенерации или результатом продукции стромальных фибробластов [14]. В других версиях говорилось о том, что миксоидное вещество образуется клетками коры надпочечников, однако подтверждения этой теории, а именно внутриклеточного генеза миксоидной субстанции, обнаружено не было.

Клиническое поведение миксоидного АКР, по данным литературы, сопоставимо, а иногда и более агрессивно в сравнении с классическими вариантами, в связи с этим в опухолях надпочечников с преобладанием миксоидной стромы даже при наличии явно доброкачественного новообразования на первый взгляд важно иметь настороженность в отношении его злокачественности [14].

Для подтверждения адренокортикального генеза различных морфологических вариантов АКР использовали следующие ИГХ-маркеры: SF-1, Inhibin A, Melan A.

В настоящее время SF-1, по данным разных исследований, является наиболее чувствительным (98%) и специфичным (100%) маркером АКР [15, 16]. Экспрессия этого маркера в нашем исследовании наблюдалась во всех исследуемых случаях АКР независимо от его морфологического подтипа: в 51 (100%) случае классического варианта, в 15 (100%) онкоцитарного и в 9 (100%) миксоидного (рис. 4, а).

Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание АКР с антителами к SF-1, Melan A, Inhibin A, антимитохондриальными антителами, Ki-67.

а — классический вариант, иммуногистохимическое окрашивание с антителами к SF-1, позитивная ядерная реакция в опухолевых клетках; б — классический вариант, иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Melan A, гетерогенная позитивная реакция; в — классический вариант, иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Inhibin A, выраженная гетерогенная позитивная реакция; г — онкоцитарный вариант, иммуногистохимическое окрашивание с антимитохондриальными антителами, выраженная диффузная цитоплазматическая реакция; д — классический вариант, иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Ki-67, выраженная гетерогенность реакции; а—д — ×100.

Что касается экспрессии Melan A и Inhibin A, при проведении ИГХ-исследования выраженность их реактивности отличалась в зависимости от выделяемых вариантов АКР. В классическом варианте АКР экспрессия Melan A была различной — от слабой до выраженной с равномерным распределением количества случаев, в то время как в онкоцитарном варианте превалировала умеренная, а в миксоидном — слабая выраженность данного маркера (p=0,15) (рис. 4, б). Inhibin A характеризовался средней и слабой интенсивностью экспрессии в классическом и онкоцитарных вариантах, а при миксоидном подтипе практически во всех анализированных случаях выявлена низкая интенсивность реакции с данным антителом (p=0,071) (рис. 4, в). Диагностическая чувствительность Melan A в выявлении адренокортикального гистогенеза опухолей составила 89,3% (67/75), Inhibin A — 86,7% (65/75), тогда как использование данных антител совместно показало 100% чувствительность. ИГХ-диагностика АКР все еще представляет значительные трудности ввиду отсутствия высокоспецифичных маркеров (кроме SF-1). Однако совокупная оценка морфологической картины заболевания и результатов ИГХ-исследования при совместном использовании Melan A и Inhibin A позволяет практически со 100% точностью подтвердить адренокортикальный генез опухоли.

АМА представляют собой антитела, направленные к внутренним мембранным митохондриальным белкам и в клинической практике являются сывороточным маркером первичного билиарного цирроза печени, однако в случае АКР ИГХ-исследование с этими антителами способствует идентификации онкоцитарной дифференцировки опухоли. В данном исследовании оценка экспрессии АМА проводилась при всех морфологических вариантах АКР, однако характеризовалась сильным диффузным ИГХ-окрашиванием эозинофильной гранулярной цитоплазмы только при онкоцитарном варианте (p<0,0001) (рис. 4, г).

Индекс Ki-67, оцениваемый с помощью ИГХ-исследования, является маркером клеточной пролиферативной активности, и, по нашим данным, в классическом варианте АКР индекс Ki-67 преимущественно находился на уровне 20%. Онкоцитарный вариант характеризовался более низкой медианой пролиферативной активности (10%), что свидетельствует о более благоприятном прогнозе при таком подтипе АКР в сравнении с классическим вариантом. При миксоидном варианте также не отмечено высокого уровня Ki-67 (15%) (p=0,0056) (рис. 4, д; рис. 5).

Рис. 5. Индекс пролиферативной активности Ki-67 в вариантах АКР.

P53 является транскрипционным фактором, регулирующим клеточный цикл и блокирующим образование злокачественных новообразований, соответственно ген TP53, кодирующий белок р53, — онкосупрессор. В нашем исследовании экспрессия p53 выявлена в 14 (18,6%) случаях из 75 (p=0,19). Кроме того, достоверных различий уровня экспрессии данного маркера в зависимости от вариантов АКР не выявлено.

Заключение

За последние десятилетия фундаментальная наука и клинические исследования АКР значительно расширили наше понимание патологии этого заболевания, отличительной особенностью которого является выраженная морфологическая и иммуногистохимическая гетерогенность. В настоящем исследовании охарактеризованы основные гистологические варианты АКР с описанием паттернов роста, которые позволяют улучшить диагностику АКР. При этом классический подтип выявлен у 51 (68%) человека, онкоцитарный — у 15 (20%), миксоидный — у 9 (12%). Функциональная активность опухолей наблюдалась в 43% (18 случаев) при классическом варианте АКР, в этом случае наиболее часто клиническая картина проявлялась симптомами гиперкортицизма (38%) и вирилизации (5%). Достоверных различий в гормональной активности между различными морфологическими вариантами не обнаружено. Для уточнения гистологического диагноза АКР (коркового гистогенеза опухоли) обязательно следует использовать иммуногистохимическое исследование. Необходимая минимальная панель маркеров должна включать SF1, Melan A, Inhibin A. В свою очередь, каждый гистологический вариант может характеризоваться различной выраженностью экспрессии иммуногистохимических маркеров. Миксоидный вариант отличается достоверным снижением экспрессии Inhibin A, что следует учитывать при диагностике этого подтипа. Использование антимитохондриальных антител необходимо для диагностики онкоцитарного варианта АКР. Индекс пролиферативной активности Ki-67 показал достоверные различия при его определении в морфологических вариантах АКР. Так, онкоцитарный вариант обладает более низкой медианой пролиферативной активности (10%). В нашем исследовании экспрессия p53 выявлена у 14 (18,6%) из 75 пациентов, при этом достоверных различий уровня экспрессии данного маркера в зависимости от вариантов АКР не выявлено. Выделение морфологических вариантов АКР и использование специфичных, чувствительных и прогностически значимых иммуногистохимических маркеров позволит клиницистам и патоморфологам судить о биологических свойствах этой опухоли и клиническом течении заболевания.

Публикация настоящей работы поддержана грантом Президента Российской Федерации — МК-3695.2019.7

Financing source Publication of this paper is supported by a grant of the President of the Russian Federation МК-3695.2019.7

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.С. Селиванова, А.С. Тертычный, Д.Г. Бельцевич

Сбор и обработка материала — Л.С. Селиванова, Д.Г. Бельцевич, А.А. Рослякова, А.В. Ткачук

Статистическая обработка — Л.С. Селиванова, П.В. Белоусов

Написание текста — Л.С. Селиванова, А.С. Тертычный, А.В. Ткачук

Редактирование — Л.С. Селиванова, А.С. Тертычный, Д.Г. Бельцевич, А.А. Рослякова, А.В. Ткачук, П.В. Белоусов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.