Ведущее место в структуре перинатальной заболеваемости и смертности отводится гипоксически-ишемическим повреждениям сердечно-сосудистой системы, которые диагностируются в 40—70% случаев у детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию. Частота гипоксических поражений миокарда у новорожденных с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) достигает 58% [1, 2]. Значимость данной патологии определяется неблагоприятным медико-биологическим и социальным прогнозом. Ранние последствия гипоксических кардиопатий определяются снижением систолической функции левого желудочка, перегрузкой правых отделов и нарушениями ритма сердца, которые могут сохраняться в течение 3—6 мес после рождения [3—5]. Отдаленными исходами антенатальной хронической гипоксии являются мелкоочаговый кардиосклероз, неравномерно выраженный фиброэластоз эндокарда и дисхронное развитие сократительного миокарда [6, 7].

Профилактика последствий гипоксических повреждений миокарда тесным образом связана с ранним выявлением патологических изменений в сердце. В последнее время в кардиологии все большее значение приобретает идентификация биохимических маркеров гипоксически-ишемического повреждения кардиомиоцитов. К таковым относятся КФК, КФК-MB, АСТ, АЛТ и тропонины I, T, C контрактильного аппарата мышечных клеток. Определение последних в крови пациентов широко используется в неонатологии для диагностики внутрижелудочковых кровоизлияний и врожденных пороков сердца [8].

Одним из основных мотиваторов фиброзирования миокарда при гипоксических повреждениях является трансформирующий фактор роста β₁ (TGF-β₁), способствующий развитию фиброза путем подавления активности металлопротеиназ [9]. Известно, что у взрослых повышение содержания TGF-β₁ и тропонинов в сыворотке крови происходит до появления патоморфологических изменений в миокарде. В связи с этим особую значимость приобретает изучение экспрессии сердечного тропонина T (cTnT) на тканевом уровне. Морфологическая диагностика гипоксических кардиомиопатий у глубоконедоношенных новорожденных существенно затруднена в связи с гестационными и адаптационными особенностями сердца, поэтому разработка новых методов диагностики гипоксических повреждений миокарда является одной из актуальных проблем неонатологии, кардиологии детского возраста и патологической анатомии.

Цель исследования — определить параметры структурных повреждений миокарда у новорожденных 22—27 нед гестации, развивавшихся в условиях хронической внутриутробной гипоксии.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили образцы сердца 50 умерших новорожденных с ЭНМТ (22—27 нед гестации), из которых 30 развивались в условиях хронической внутриутробной гипоксии (основная группа) и у 20 основной причиной смерти была асфиксия, обусловленная преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты (ПОНРП) (группа контроля).

Проведено комплексное морфологическое исследование биологического материала: органометрия и раздельное взвешивание сердца по методу Г.Г. Автандилова и В.Б. Мацкевич, обзорная гистология фрагментов правого желудочка после стандартной парафиновой проводки материала с окраской препаратов гематоксилином и эозином, гистостереометрия мышечного и интерстициального компонентов миокарда с определением площади ядер и плотности их расположения, трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) с использованием электронного микроскопа ЭВМ-100 АК, иммуногистохимическое (ИГХ) исследование на парафиновых срезах по стандартному протоколу с применением кроличьих поликлональных антител к cTnT и TGF-β₁ в рабочем разведении 1:800 («Biorbyt», Великобритания) и системы детекции Ultra Vision Quanto Detection System HRP («ThermoFisher Scientific», США). Интенсивность ИГХ-окрашивания позитивных клеток оценивали в баллах (от 0 до 3) в 10 различных полях зрения в совокупности не менее чем в 100 клетках при увеличении светового микроскопа в 400 раз. Далее индекс экспрессии (ИЭ) cTnT рассчитывали в условных единицах путем сложения показателей интенсивности окраски клеток в баллах (i), умноженных на процент позитивных клеток P(i), и последующего деления суммы на 100. Оценку результатов ИГХ-идентификации антигена TGF-β₁ проводили полуколичественным методом по интенсивности окраски: отрицательная (–), слабоположительная (+), умеренно положительная (++), резко положительная (+++). При проведении ИГХ-реакций осуществляли положительный и отрицательный контроли. Результаты морфологического исследования обрабатывали статистическими методами с использованием программного обеспечения MS Office Excel 2007, Statistica 6.0 и метода непараметрического анализа по Манну—Уитни с критическим уровнем значимости, равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Новорожденные основной группы в отличие от группы контроля развивались в условиях внутриутробной гипоксии, обусловленной хронической субкомпенсированой плацентарной недостаточностью (ХПН). Структурную основу ХПН составили хронический виллит неуточненной этиологии с исходом в поствоспалительную гиповаскуляризацию со склерозом стромы ворсин и расстройства материнского кровообращения в сочетании с нарушениями созревания ворсинчатого хориона по диссоциированному типу (37%) и типу промежуточных незрелых ветвей (23%).

Средняя продолжительность жизни новорожденных основной группы составила 2 сут 10 ч. Оценка антропометрических параметров позволила в 66,3% случаев (p=0,03) диагностировать нормотрофический тип соматического развития и в 33,7% (p=0,04) — задержку роста плода. При анализе органометрических параметров выявлено увеличение массы сердца новорожденных основной группы по сравнению с аналогичным параметром контрольной (p=0,01). При этом определялась гипертрофия правого желудочка, структурную основу которой составили увеличение площади ядер кардиомиоцитов, удельной площади мышечного компонента и снижение аналогичного параметра интерстициальной ткани по сравнению с группой контроля (см. таблицу). Выявленное снижение плотности кардиомиоцитов в единице площади (510 [497; 521]) свидетельствует о том, что морфологическую основу гипертрофии миокарда правого желудочка составляет именно гипертрофия кардиомиоцитов, а не гиперплазия таковых. По данным A. Cardoso и соавт. [10], кардиомиоциты теряют способность к гиперплазии в 1-е сутки после рождения.

Хроническая внутриутробная гипоксия инициирует формирование повреждений в миокарде на тканевом уровне в виде нарушений ориентации мышечных волокон, фрагментации и фокального некроза кардиомиоцитов (рис. 1, а). Прогрессирование деструктивных изменений паренхимы миокарда осуществляется на фоне нарушений микроциркуляции с развитием венозного полнокровия, кровоизлияний и интерстициального отека (рис. 1, б). Ответная реакция микроциркуляторного русла на гипоксию в миокарде достаточно разнообразна: большая часть капилляров расширена, меньшая — спазмирована. Изменения, обнаруженные со стороны микроциркуляторного русла, преобладают в миокарде правого желудочка.

Рис. 1. Изменения миокарда правого жедудочка у новорожденнных с ЭНМТ при хронической гипоксии, окраска гематоксилином и эозином.

а — миокард новорожденного 27 нед гестации: дистрофические изменения и фокальный некроз кардиомиоцитов, фрагментация мышечных волокон, ×400; б — миокард новорожденного 27 нед гестации: волнообразная деформация мышечных волокон, венозное полнокровие, кровоизлияния, интерстициальный отек, ×400.

Анализ морфометрических параметров правого желудочка сердца

Гипоксическое повреждение миокарда проявляется нарушением сократительной функции кардиомиоцитов, обусловленным снижением экспрессии cTnT — одного из ключевых белков-регуляторов сердечных сокращений [11—13]. Ранее было показано, что экспрессия эмбриональной изоформы тропонина T повышает не только силу сокращений миофибрилл, но и чувствительность миоцитов к ионам Ca [14]. Экспрессия cTnT определяется структурными особенностями кардиомиоцитов: доказано, что большая часть сердечного тропонина плотно связывается с миофибриллами и высвобождается только после их деградации, что впоследствии приводит к устойчивому увеличению циркуляции данного маркера в кровеносном русле [15].

Оценку морфофункционального состояния кардиомиоцитов у новорожденных 22—27 нед гестации проводили путем ИГХ-идентификации cTnT в образцах миокарда. В группе контроля выявлена умеренная экспрессия биомаркера с равномерным распределением DAB-позитивных включений преимущественно в перинуклеарной зоне кардиомиоцитов из субэпикардиальных и трансмуральных отделов миокарда (рис. 2, а). При этом индекс экспрессии cTnT составил 1,47 [1,01; 1,91] усл.ед. У новорожденных основной группы в цитоплазме кардиомиоцитов визуализировались мелкозернистые субмембранно расположенные DAB-позитивные включения и лишь в отдельных клетках иммунные комплексы локализовались перинуклеарно (рис. 2, б). Экспрессия cTnT в миокарде новорожденных при хронической гипоксии была слабой (p=0,01) и сопровождалась снижением ИЭ до 0,9 [0,76; 1,05] усл.ед. В зонах фокального некроза и деструкции кардиомиоцитов в результате их фрагментации экспрессия cTnT практически не определялась.

Рис. 2. Экспрессия сердечного тропонина T в миокарде новорожденных 22—27 нед гестации, иммунопероксидазный метод.

а — выраженная экспрессия в миокарде новорожденного 25 нед гестации (контрольная группа), ×100; б — слабая экспрессия при гипоксических повреждениях миокарда у новорожденного 25 нед гестации, ×400.

По данным N. Frangogiannis [16], развитие гипоксических повреждений миокарда определяется состоянием внеклеточного матрикса, который обеспечивает структурную поддержку миокарда и облегчает передачу ключевых сигналов кардиомиоцитам, эндотелиоцитам и клеткам интерстициальной ткани. Изменения профиля и биохимии внеклеточного матрикса являются одним из звеньев патогенеза сердечной недостаточности [17, 18].

При анализе результатов ИГХ-исследования с первичными антителами к TGF-β₁ в образцах сердца у новорожденных основной группы выявлены следующие особенности. В интерстициальной ткани, фибробластах и эндотелии сосудов микроциркуляторного русла миокарда правого желудочка установлена умеренная экспрессия TGF-β₁ (рис. 3, а). ИЭ фактора роста составил 0,35 [0,18; 0,55] усл. ед., что достоверно выше аналогичного параметра группы контроля — 0,18 [0,1; 0,26] усл. ед. (p=0,04; рис. 3, б). Выявленные особенности экспрессии TGF-β₁ подтверждают риск развития фиброза миокарда, поскольку данный биомаркер является ключевым звеном морфогенеза патологического процесса [9]. Следует подчеркнуть, что при сопоставлении указанных выше значений индекса экспрессии TGF-β₁ с результатами обзорной гистологии, не выявившей очагов фиброза в миокарде новорожденных основной группы, подтверждается возможность ранней ИГХ-диагностики патологического процесса еще до развития его клинико-морфологических проявлений [19].

Рис. 3. Экспрессия TGF-β₁ в миокарде новорожденных 22—27 нед гестации, иммунопероксидазный метод.

а — умеренная экспрессия при гипоксических повреждениях миокарда у новорожденных основной группы, ×100; б — слабая экспрессия в миокарде новорожденных группы контроля, ×400.

При электронно-микроскопическом исследовании миокарда у новорожденных с ЭНМТ, перенесших внутриутробную хроническую гипоксию, детализированы изменения в ультраструктурах миоцитов и отдифференцированы гипоксические повреждения кардиомиоцитов от их незавершенной дифференцировки. Цитоплазма кардиомиоцитов содержит скудное количество органелл, в том числе в околоядерных зонах. Перинуклеарно расположены цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) с мембранными рибосомами (рис. 4, а). Находящийся на начальных этапах дифференцировки сократительный аппарат кардиомиоцитов представлен хаотично расположенными миофибриллами, структура которых нарушена. Тонкие и прерывистые миофибриллы формируют пучки и располагаются преимущественно под сарколеммой (рис. 4, б). Кроме ГЭР и миофибрилл, в цитоплазме визуализируются немногочисленные митохондрии с нарушенной архитектоникой. Деструкция крист митохондрий завершается просветлением матрикса или его вакуолизацией.

В ядрах кардиомиоцитов доминирует субмембранная локализация гетерохроматина. У новорожденных 22—27 нед гестации центральная область ядер мышечных волокон с низкой электронной плотностью, что косвенно свидетельствует о внутриклеточном отеке. Снижение функциональной активности ядер подтверждают и фрагментарные скопления гетерохроматина в центральных отделах нуклеоплазмы. При этом ядерная мембрана формирует остроконечные инвагинаты в саркоплазму (рис. 4, б). В кардиомиоцитах встречается фокальный плазмолизис.

Рис. 4. Ультраструктура миокарда правого желудочка у новорожденных с ЭНМТ при хронической внутриутробной гипоксии, ТЭМ.

а — гиперплазия цистерн ГЭР, очаговые скопления гетерохроматина в центре ядра, эухроматизация ядер; б — инвагинаты сарколеммы, мелкодисперсное распределение эухроматина, единичные лизосомы и групповые скопления миофибрилл в перинуклеарных зонах.

Заключение

Основными морфологическими признаками гипоксических повреждений миокарда у новорожденных с ЭНМТ при рождении являются компенсаторная гипертрофия правого желудочка сердца, расстройства кровообращения в микроциркуляторном русле, снижение экспрессии cTnT в сочетании с незавершенной дифференцировкой органелл в кардиомиоцитах, деформацией, фрагментацией миофибрилл и деструкцией крист митохондрий на фоне повышения экспрессии TGF-β₁ — ключевого механизма фиброзирования миокарда у данной категории новорожденных.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.В. Кулида, П.Л. Перетятко

Сбор и обработка материала — М.В. Малышева, О.П. Сарыева

Статистическая обработка — М.В. Малышева

Написание текста — Л.В. Кулида, О.П. Сарыева

Редактирование — Е.В. Проценко, Л.В. Кулида

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.