С каждым годом неуклонно растет количество случаев мужского бесплодия [1], в том числе среди лиц, получавших сеансы химио- и радиотерапии вследствие онкологической патологии [2, 3].

Ионизирующее излучение прямо и косвенно активирует генерацию активных форм кислорода и азота, приводит к хромосомным аберрациям [4], вызывает разрушение зрелых половых клеток и нарушение процессов деления и созревания новых клеточных поколений. Токсические эффекты облучения наиболее выражены по отношению к активно пролиферирующим клеткам и, вероятно, по этой причине семенник с присущей ему практически перманентной митогенной активностью сперматогоний оказывается одним из наиболее радиочувствительных органов [5].

Изучение механизмов инфертильности и оценка эффективности ее терапии требуют создания экспериментальных моделей с возможностью экстраполяции результатов на человека. В отличие от распространенных моделей гипосперматогенеза (способ введения цитостатиков и цитотоксических препаратов) облучение позволяет добиться как обратимых, так и необратимых эффектов на сперматогенез путем варьирования доз, локального облучения гонад или облучения всего тела животных [5].

Известно, что многие факторы роста, высокие концентрации которых содержатся в α-гранулах тромбоцитов, обладают выраженной способностью активировать регенерацию, поддерживая жизнедеятельность клеток и тканей [6] и оказывая позитивное влияние на их реабилитацию после разного рода повреждений [7—9]. Так, трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) стимулирует пролиферацию фибробластов, синтез молекул коллагена I типа и фибронектина [7]. Эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) активируют ангиогенез, фактор роста тромбоцитов (PDGF) участвует в регуляции ауто- и паракринных механизмов регуляции. Также получены доказательства митогенной активности у инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) и его позитивного влияния на процессы спермато- и стероидогенеза [7, 10—13].

Плазма, обогащенная тромбоцитами (англ. Platelet rich plasma — PRP), содержит большое количество факторов роста и широко используется в современной регенеративной медицине [14, 15]. Перспективным для репродуктологии является способность PRP ускорять восстановление овофолликулогенеза, что показано в экспериментах на инфертильных самках крыс [16]. В вопросах влияния PRP на развитие мужских половых клеток состояние их микроокружения и гематотестикулярный барьер отмечается существенный дефицит информации.

Цель исследования — морфологическая оценка сперматогенеза после локального β-облучения в дозе 8 Гр и его возможная реабилитация при помощи введения факторов роста.

Материалы и методы

Животные для исследования in vivo. В качестве моделей использовали самцов половозрелых крыс линии Wistar (220±20 г; возраст 9—10 нед; n=135). Животных содержали в виварии при 12-часовом световом дне, проводили кондиционирование при температуре 23 °C и влажности 40—60%, использовали стандартный рацион питания с водой ad libitum. При этом соблюдали все асептические меры предосторожности. Все манипуляции осуществляли согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ЕЭС, Страсбург, 1986) и Руководству по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS), исследования были также одобрены локальным этическим комитетом.

Дизайн эксперимента. Экспериментальные животные (n=135) были случайным образом поделены на пять групп (условные названия): 1-я — контроль, 2-я — 8IR, 3-я — 8IR+LP-PRP+IGF, 4-я — 8IR+LP-PRP и 5-я — LP-PRP (рис. 1).

Рис. 1. Дизайн эксперимента.

Выведение животных из эксперимента. Животных всех 5 групп выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика (кетамин в дозе 50 мг/кг внутримышечно и ксилазин в дозе 5 мг/кг интраперитонеально) согласно дизайну (см. рис. 1).

Ионизирующее излучение (IR). Животных подвергали прицельному облучению тазового сегмента в дозе 8 Гр (мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля — Ø (диаметр тубуса) 100 мм) с использованием линейного акселератора (NOVAC-11, радиологическое отделение экспериментального корпуса МРНЦ им. А.Ф. Цыба, Обнинск, Россия). Данная установка позволяет получить пучок электронов с энергией 4, 6, 8, 10 МэВ; пучок возможно отколлимировать до Ø 30—100 мм с шагом 10 мм; частоту бенчей в пучке можно регулировать от 1 до 24 Гц с шагом 1 Гц. Мощность дозы была откалибрована с помощью физической дозиметрии группой радиационной безопасности в рамках требований стандартной калибровки в соответствии с рекомендациями Агентства по ядерной энергии (NEA) России. Перед облучением крыс 2—4-й групп анестезировали однократным введением кетамина (50 мг/кг, внутримышечно) и ксилазина (5 мг/кг, внутрибрюшинно). Анестезированных животных помещали на предметный стол по одной крысе в положении лежа на спине с расставленными в стороны лапами таким образом, чтобы в зону облучения попадали семенники, а легкие и сердце оставались в зоне радиационной тени. Тубус подводили к облучаемой области так, чтобы его срез находился не выше 2 мм от кожи, а сам тубус был перпендикулярен плоскости кожи.

Приготовление плазмы, обогащенной тромбоцитами и бедной лейкоцитами (LP-PRP). Кровь (2 мл) забирали из периферической вены хвоста и смешивали с антикоагулянтом из расчета на 2 мл крови 0,2 мл 5% раствора цитрата натрия. LP-PRP получали, используя двухступенчатое центрифугирование цитратной крови при комнатной температуре (20—24 °C): на первой ступени скорость 1800 об/мин (≈543,35 g) в течение 10 мин. Образовавшийся надосадочный слой жидкости в объеме 1 мл отбирали с помощью шприца и переносили в чистую сухую пробирку; на второй ступени проводили центрифугирование со скоростью 3400 об/мин (≈1938,61 g) в течение 10 мин. Надосадочный слой удаляли, а оставшийся на дне тромбоцитарный слой (0,2 мл) активировали хлоридом кальция (около 0,05 мл 10% CaCl₂). Для анализа количества тромбоцитов крови была использована система XT-1600i. Количество тромбоцитов LP-PRP (1 900 000 тромбоцитов в 1 мкл) было примерно в 3 раза больше, чем уровень тромбоцитов крови (61 000 тромбоцитов в 1 мкл). LP-PRP вводили сразу после приготовления.

Инсулиноподобный фактор роста-1 (Insulin-like growth factor-1). Рекомбинантный IGF-1 (rhIGF-1, Sigma Aldrich, США; 2 мг/кг) вводили животным 3-й группы 1 раз в неделю в течение 11 нед.

Измерение уровня гормонов (фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH) и общего тестостерона) проводили с помощью sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) согласно протоколам производителя (E0182Ra, E0179Ra, E0259Ra BT-Labs, Китай) с использованием считывателей микропланшетов (BioTek Epoch, Winooski, VT).

Морфологическое исследование

После извлечения семенники взвешивали (масса абсолютная (в г) и относительная по отношению к массе тела (в %)), рассчитывали их объем, замеряли, оценивали внешний вид, состояние паренхимы на разрезе. Затем нарезали параллельно сагиттальной плоскости каждые 2 мм, фиксировали в растворе Буэна, после проводки (аппарат гистологической проводки тканей Leica Biosystems, Германия) заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы (толщиной 3 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования.

Микроскопический анализ выполняли с помощью системы видеомикроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG), а морфометрические данные получали с использованием программного обеспечения (ПО) для обработки и анализа изображений Leica Application Suite (LAS) Version 4.9.0 (рис. 2). В каждом из полей рассчитывали следующие параметры: высоту сперматогенного эпителия, количество сперматогоний, сперматоцитов, сперматид, а также клеток Сертоли и Лейдига [6].

Рис. 2. Морфометрическое исследование семенников с использованием программного обеспечения для обработки и анализа изображения Leica Application Suite (LAS): сравнительный анализ извитых семенных канальцев.

Western blot-анализ экспрессии белка каспазы-3. Экспрессию белка каспазы-3 и ее активной формы, расщепленной каспазы-3, измеряли с помощью вестерн-блоттинга. Концентрацию белка в гомогенизированных образцах определяли по методу Брэдфорда. Затем 25 мкг белка разделяли на 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GeneTex, clone GTX110543, 1:600). Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (Sigma, 70166) в трис-буферном физиологическом растворе (TBS). В качестве стандарта использовали иммуноокрашивание глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Единица измерения — нмоль pNA/мг белка C. Визуализацию осуществляли с помощью набора для иммунохемилюминесценции Novex ECL Reagents (Invitrogen, США).

Рентгеновская микротомография (микро-КТ). После фиксации семенники помещали на 18 ч в 1% раствор йода в 100% спирте с последующим промыванием в течение 1 ч в 100% спирте и далее переносили в пластиковую емкость, заполненную 100% спиртом для последующего сканирования.

Контрастированные семенники были визуализированы при помощи рентгеновского томографа Bruker Skyscan 1276 (Bruker, Бельгия) с напряжением 65 кВ, силой тока 200 мкА и алюминиевым фильтром толщиной 0,5 мм. Была выполнена 1801 проекция с вокселем 10 мкм. Затем полученные проекции были реконструированы в программе NRecon (Bruker, Бельгия) и экспортированы в виде последовательности изображений в формате tif в программу ORS Dragonfly (The Objects, Канада) для дальнейшего анализа. Для улучшения качества изображения срезы в двухмерных проекциях были суммированы с подбором оптимальных значений электронного окна (рис. 3).

Рис. 3. Микротомограмма семенников с использованием рентгеновского томографа Bruker Skyscan.

Статистический анализ. Полученные в результате подсчета данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12.00 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовали следующие непараметрические критерии: U-критерий Манна—Уитни, H-критерий Краскела—Уоллиса); рассчитывали средние арифметические величины с их предельными отклонениями и среднеквадратичную ошибку. При отсутствии нормального распределения данных использовали непараметрический критерий F. Wilcoxon (Statistical methods for research workers). Сравнение между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p<0,01.

Результаты

Уровни половых гормонов (общий тестостерон, ФСГ, ЛГ) в контрольной и опытных группах на всем протяжении эксперимента не показали достоверных различий и находились в пределах нормы в соответствии с полом и возрастом животных (таблица).

Уровень половых гормонов в контрольной и опытных группах (M±SD)

Примечание. М — значение; SD — стандартное отклонение.

Масса тела животных 2—4-й опытных групп на 7-е сутки после облучения электронами в дозе 8 Гр уменьшилась в среднем на 35% по сравнению с контрольной с последующим незначительным восстановлением в 3-й и 4-й группах к концу эксперимента.

Масса и объем семенников в опытных группах спустя неделю после облучения электронами уменьшились в 2 раза (0,71±0,02 г, p<0,01; 688,7±32,7 мкм³, p<0,01) по сравнению с контрольной (1,5±0,1 г, p<0,01; 1384,5±91,3 мкм³, p<0,01), что составляет в среднем 0,3% потери от общей массы тела. Снижение этих показателей прогрессировало во 2-й группе и к 84-м суткам было в 3,6 раза меньше (0,41±0,01 г, p<0,01; 275,9±14,3 мкм³, p<0,01) по сравнению с группой контроля. На фоне введения LP-PRP + IGF у крыс 3-й группы, начиная с 42-х суток, отмечали увеличение массы и объема семенников (0,91±0,05 г, p<0,01; 997,1±26,8 мкм³, p<0,01). Практически аналогичная картина наблюдалась в 4-й группе (0,81±0,01 г, p<0,01; 837,2±21,0 мкм³, p<0,01). Уменьшение массы и объема семенника в группе облучения электронами в дозе 8 Гр также подтверждено результатами микро-КТ (рис. 4).

Рис. 4. Микротомограмма семенника, облученного электронами в дозе 8 Гр с контрастированием на 84-е сутки.

В периканаликулярном пространстве семенников облученных животных отмечали интерстициальный отек и разрастание волокнистого компонента, а также стаз в просветах кровеносных сосудов мелкого калибра; лимфатические сосуды расширенные, «пустые». Эти изменения визуализировали на микро-КТ (см. рис. 4).

Микроскопическая оценка. При световой микроскопии срезов семенников контрольной группы наблюдали нормальную гистоархитектонику с физиологическим сперматогенезом (рис. 5, а).

Рис. 5. Микроскопическая картина семенников на 84-е сутки эксперимента.

а — контроль; б — после облучения электронами в дозе 8 Гр (8IR); в — после облучения электронами в дозе 8 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами с инсулиноподобным фактором роста-1 (8IR+LP-PRP+IGF); г — после облучения электронами в дозе 8 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (8IR+LP-PRP); д — после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами (LP-PRP). Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

В группе облучения электронами в дозе 8 Гр (2-я группа) уже на 7-е сутки в ¹/₃ семенных канальцев обнаружили появление дегенеративных сперматид и сперматоцитов, объединенных в семенные шары (площадь 0,7 мкм²; диаметр 0,9 мкм; p<0,01), — крупные структуры с множественными пикнотичными ядрами и интенсивно окрашенной оксифильной цитоплазмой (7—8 поврежденных канальцев в поле зрения) (рис. 5, б).

Высота сперматогенного эпителия к концу эксперимента уменьшилась более, чем в 2,5 раза у крыс, облученных электронами, по сравнению с контрольной группой (p<0,01). На фоне введения LP-PRP отмечали незначительное увеличение высоты сперматогенного эпителия уже на 42-е сутки от начала эксперимента, а введение комбинации LP-PRP+IGF-1 (3-я группа) сократило срок восстановления высоты сперматогенного эпителия на 2 нед по сравнению с 4-й группой (рис. 6).

Рис. 6. Показатели высоты сперматогенного эпителия в контрольной и опытных группах.

Количество половых клеток. В опытных 2—4-й группах через неделю после облучения наблюдали резкое снижение количества сперматогоний (более чем на ¹/₂), первичных и вторичных сперматоцитов и сперматозоидов, дистрофические изменения и аутолиз сперматид, появление пикнотических ядер в первичных сперматоцитах; местами гистологическая картина суб- и тотальной герминальной аплазии сохранялась вплоть до окончания эксперимента во 2-й группе (рис. 5, б, рис. 7).

Рис. 7. Количество сперматогоний в контрольной и опытных группах.

В семенниках на фоне введения LP-PRP+IGF (3-я группа) снижение доли половых клеток (гипосперматогенез) было менее выражено по сравнению со 2-й группой облученных животных: разница в количестве сперматогоний составила на 42-е сутки 3,7 раза, а на 84-е сутки — 5 раз (см. рис. 7).

Начиная с 70-х суток эксперимента выраженные дистрофические изменения и герминальная аплазия сперматогенного эпителия во 2— 4-й группах затрудняли дальнейшую дифференцировку половых клеток.

К концу эксперимента количество сперматогоний у животных 2-й и 4-й групп было снижено по сравнению с группой контроля в 29,8 и 7,2 раза соответственно, а другие популяции половых клеток обнаружены не были. В то же время в 3-й группе на фоне LP-PRP+IGF в извитых семенных канальцах имелись сперматогонии и единичные сперматоциты, однако их количество по сравнению с контрольной группой было снижено в 5,8 раза (6,6±0,03, p<0,01) и 78,5 раза (1,2±0,1, p<0,01) соответственно (см. рис. 5, в, г, рис. 7).

Количество клеток Сертоли и Лейдига. Во 2—4-й экспериментальных группах наблюдали незначительное снижение количества клеток Сертоли. Количество клеток Лейдига в группе облучения электронами увеличилось по сравнению с группой контроля в 1,9 раза (14,5±0,02, p<0,01) к концу эксперимента, а в группах 8IR+LP-PRP+IGF и 8IR+LP-PRP — в 1,7 раза (12,7±0,01, p<0,01) и 1,8 раза (13,6±0,01, p<0,01) соответственно.

Western blot. Согласно анализу вестерн-блоттинга, экспрессия каспазы-3 увеличилась в 6 раз в ткани семенников облученных крыс по сравнению с крысами контрольной группы (p<0,001). Экспрессия каспазы-3 снижалась после введения LP-PRP+IGF и LP-PRP по сравнению с группой облученных животных в 2 и 1,8 раза соответственно (p<0,001) (рис. 8).

Рис. 8. Фосфорилирование Cas3 в семенниках контрольной и опытных групп.

Три образца ткани семенника каждой группы объединяли и проводили через вестерн-блоттинг. Экспрессия каспазы-3 в тканях семенников измерялась в нмоль pNA на 1мг белка C: контроль (I); 8IR (II); 8IR+LP-PRP+IGF (III); 8IR+LP-PRP (IV); LP-PRP (V). В качестве стандарта использовали иммуноокрашивание глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Иммунохемилюминесценция.

Необлученные животные 5-й группы, которым вводили LP-PRP, на протяжении эксперимента не показали достоверных отличий по всем изученным параметрам по сравнению с контрольной группой (рис. 5, д).

Обсуждение

Настоящее исследование посвящено изучению состояния сперматогенеза на модели локального β-облучения (линейный акселератор NOVAC-11; доза 8 Гр, мощность дозы 1 Гр/мин, энергия 10 МэВ, частота 9 Гц, размер поля Ø100 мм) и реабилитации вызванных облучением нарушений сперматогенеза экзогенными факторами роста тромбоцитов.

Обнаруженное прогрессирующее снижение массы и объема семенников (по данным микро-КТ) после облучения объясняется уменьшением высоты сперматогенного эпителия и количества половых клеток. Выявленные изменения сопровождались гиперплазией клеток Лейдига компенсаторного генеза, обусловленного отрицательной обратной связью гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси.

Дистрофические поражения половых клеток, появление семенных шаров, а также дезорганизация и аплазия семенных канальцев связаны с токсическим действием ионизирующего излучения прежде всего на сперматогонии вследствие повреждения клеточных мембран и макромолекул, нарушения работы сигнальных путей MAPK, PI3K, NFκB, синтеза белков семейства ErbB и факторов клеточного дыхания из-за быстрой генерации активных форм кислорода (OH^•, O₂^{• –} и H₂O₂), продуктов перекисного окисления липидов и радиолиза воды (H^• и e_aq^–), реактивных форм азота (ONOO^–, ONOOH, NO₂^•, N₂O₃) и др. [4]. Сформировавшийся дисбаланс между активными формами кислорода (и других токсических веществ) и антиоксидантной защитой у облученных крыс приводит к активации каспазного каскада и, как следствие, к апоптотической гибели половых клеток, что подтверждается результатами вестерн-блоттинга в нашем эксперименте.

Многие исследователи доказали высокую способность биологически активных веществ, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов, активировать регенерацию клеток и тканей — положительную роль этих факторов в процессах регуляции дифференцировки, митоза, метаболизма и хемотаксиса [10, 11]. По результатам вестерн-блоттинга обнаружено, что экспрессия проапоптотического белка каспазы-3 достоверно выше в группе облучения, однако значимо снижена в группах, которые получали лечение LP-PRP+IGF-1 и LP-PRP. Это свидетельствует о модуляции факторами роста порога апоптоза и апоптотической активности половых клеток семенника и объясняется лабильностью экстрацеллюлярных сигналов, ответственных за регуляцию клеточного роста.

Известно, что LP-PRP способна стимулировать антиоксидантную защиту, ангиогенез и регенеративные процессы в ответ на облучение, так как некоторые факторы роста положительно влияют на пролиферацию (PDGF, FGF7, EGF, IGF-1), дифференцировку (EGF, IGF-1), восстановление и обновление сперматогенного эпителия (TGF-β, IGF-1) [17]. В связи с глубоким поражением извитых семенных канальцев после облучения электронами в дозе 8 Гр проявление положительных эффектов перечисленных факторов роста в 3-й и 4-й группах оказалось менее манифестным по сравнению с таковым в группе, получившей сочетанное лечение LP-PRP+IGF-1.

Рекомбинантный IGF-1 был выбран в качестве дополнительного репаративного индуктора, так как является мощным стимулятором пролиферации и дифференцировки половых клеток, опосредуя свои эффекты через MAPK- и PI3K-сигнальные пути, которые регулируют клеточный цикл [9, 18]. Инъекции этого фактора роста замедлили процесс апоптоза, запускаемого облучением, что подтверждалось снижением экспрессии каспазы-3, и незначительно стимулировали восстановление стромального компонента семенников.

Заключение

Введение факторов роста и других биологически активных веществ, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов LP-PRP, приводит к заметному улучшению количественных и качественных показателей сперматогенеза, существенно сниженных в результате локального облучения гонад электронами. Дополнительное введение IGF-1 еще более противодействует развитию и проявлению негативных эффектов облучения, усиливая активность регенерации сперматогенеза.

Продолжение исследований патогенеза мужского бесплодия в условиях радиоактивного облучения гонад и роли LP-PRP в его лечении будет способствовать формированию более глубокого понимания механизмов действия факторов роста как в норме, так и в процессе структурно-функциональной реабилитации после такого рода повреждений.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.А. Демяшкин, Т.Г. Боровая, Ю.Ю. Андреева

Сбор и обработка материала — С.Н. Корякин, В.И. Щекин, М.А. Вадюхин

Статистическая обработка — С.Н. Корякин, М.А. Вадюхин

Написание текста — Г.А. Демяшкин, М.А. Вадюхин

Редактирование — Г.А. Демяшкин, Т.Г. Боровая, Ю.Ю. Андреева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.