Введение
Эффективность программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остается на уровне 31—42%, несмотря на многолетнюю историю применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). По данным отчета Российской Ассоциации Репродукции Человека за 2020 г., эффективность в свежем цикле программы ЭКО (количество клинических беременностей/перенос эмбрионов) составила 34,5%, результативность программ переносов размороженных эмбрионов — 41,7% [1]. Наибольшее значение для наступления беременности имеют такие факторы, как морфологическое и генетическое качество эмбриона и состояние эндометрия [2]. Частота выявления патологических изменений эндометрия при неудачных попытках в стимулированных циклах ЭКО составляет более 75% [3]. Наличие внутриматочной патологии и патологии эндометрия является независимым фактором риска развития бесплодия, увеличивающим его вероятность в 4 раза. Рецептивность эндометрия играет важную роль в реализации «диалога» между эндометрием и эмбрионом [4].
Важной причиной репродуктивных неудач в программах ВРТ является нарушение полноценной имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием, занимая в их структуре до 70% [4, 5]. Поэтому в последние годы в фокусе научного интереса находятся исследования гистологических особенностей и рецептивности эндометрия при патологии имплантации, связанной с бесплодием. Очевидна необходимость морфофункциональной оценки эндометрия у женщин с бесплодием и неудачными попытками переноса эмбрионов в анамнезе.
Главная составляющая успешной имплантации — это синхронизация между желтым телом, эндометрием и эмбрионом. В естественном менструальном цикле (28—30 дней) эндометрий женщины становится восприимчивым к имплантации через 6 дней после овуляции и далее в течение 4—5 дней, то есть эндометрий становится рецептивным на 20—24-й день менструального цикла. Сложные реакции и взаимодействие между эндометрием и эмбрионом приводят к прикреплению бластоцисты к люминальному эпителию и последующей инвазии в строму [6, 7].
При повторных неудачах имплантации эмбриона в строме эндометрия определяется нарушение соотношения экспрессии рецепторов к эстрадиолу (ER) и прогестерону (PR). По данным O.M. Conneelly (2012), соотношение стромальной экспрессии рецепторов прогестерона и рецепторов эстрогенов (PR/ER) в диапазоне от 2 до 3 определяет высокую вероятность наступления беременности в программах ВРТ [8]. C.E. Quinn и соавт. (2009) выделили пиноподии в качестве ключевых ультраструктурных образований, участвующих в формировании рецептивности, поскольку на их поверхности в наибольшем количестве экспрессируется LIF (leukemia inhibitory factor) — маркер рецептивности эндометрия [9]. Нарушение регуляции числа натуральных маточных клеток-киллеров uNK и/ или функции этих клеток (цитотоксичность, экспрессия рецепторов, секреция цитокинов или экспрессия генов) связаны с репродуктивными неудачами, такими как бесплодие и привычное невынашивание беременности [10]. Увеличение количества маркера эндотелия сосудов CD34+ в эндометрии может быть маркером успешной имплантации у пациенток с бесплодием и неудачными попытками переноса эмбриона в анамнезе [11].
Современные методы лечения, направленные на увеличение толщины и улучшения рецептивности эндометрия в программах ВРТ, до настоящего времени разрознены и имеют низкую доказательную базу. Хирургические методы лечения являются стратегией первой линии при наличии органической внутриматочной патологии у пациенток с бесплодием маточного происхождения [12]. Имеются данные об эффективном применении препаратов эстрадиола, аспирина и физиотерапевтических методов лечения [13—15].
Коррекция рецептивности эндометрия плазмой, обогащенной тромбоцитами (PRP-терапия), основана на терапевтически-регенеративной функции тромбоцитов и активных компонентов плазы — фактора роста, цитокинов и хемокинов, содержащихся в тромбоцитах, которые запускают в тканях процессы биологического синтеза и регенерации при дегрануляции последних [16]. Высказано предположение, что не только тромбоциты играют роль в клинических реакциях при применении PRP, но и большое значение имеют мононуклеарные клетки периферической крови, участвующие в высвобождении и гуморальных факторов роста [17]. Стандартизация использования PRP остается сложной задачей в связи с множеством переменных, участвующих в процессе приготовления и введения продукта [18, 19].
В клинических наблюдениях показано, что применение PRP при синдроме Ашермана способствует восстановлению нормальной гистологической структуры и функции эндометрия [20]. В исследованиях, посвященных применению внутриматочной инфузии PRP (PRP-терапии) в программах ВРТ, не рассматривается механизм ее влияния на рецептивность эндометрия, оцениваемую по микроскопической и иммуногистохимической картине [18—21]. Необходимы новые исследования, которые позволят расширить представления о влиянии PRP-терапии на эндометрий пациенток, участвующих в программах ВРТ.
Цель исследования — выявить структурные и морфологические особенности эндометрия у пациенток с неудачными попытками переноса эмбриона в анамнезе до и после применения плазмотерапии по сравнению с показателями эндометрия фертильных женщин.
Материал и методы
Исследование проведено в период с 2018 по 2022 г. на базе ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России (протокол №5 от 08.10.19) и выполнено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964). У всех пациенток и/или их законных представителей до момента включения в исследование получено информированное добровольное согласие на участие в исследовании и использование биологического материала.
В исследование включено 57 пациенток. В 1-ю (основную) группу вошли 25 пациенток с неудачными попытками переноса эмбрионов в анамнезе, которым планировался перенос размороженных эмбрионов.
На первом этапе проводилась гистологическая диагностика рецептивности эндометрия. Взятие биоптата эндометрия — пайпель-биопсию — выполняли до начала программы ВРТ на 18—22-й день менструального цикла, что соответствовало 3-м суткам приема препаратов прогестерона с целью поддержки лютеиновой фазы в спонтанном или индуцированном менструальном цикле. С целью подготовки эндометрия пациенткам назначали гормональные препараты: для достижения пролиферативных изменений эндометрия — эстрогены (эстрадиола валерат в дозе 6 мг/сут со 2—4-го дня менструального цикла и до 5—8-й недели беременности), а для формирования секреторной трансформации и децидуализации эндометрия — препараты прогестерона 600 мг/сут вагинально при достижении толщины эндометрия выше 7 мм и до 12 недель беременности.
На втором этапе пациенткам проведена пайпель-биопсия эндометрия во время программы подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов в цикле заместительной гормональной терапии за 48 ч до переноса эмбрионов, что соответствовало второму введению плазмы, обогащенной тромбоцитами. В 28% случаев проводили перенос одного эмбриона, в остальных случаях — двух эмбрионов. Пациенткам основной группы выполняли перенос эмбрионов хорошего качества (AB, BA, BB) в 80% случаев, отличного качества (AA) — в 20%.
Во 2-ю (контрольную) группу вошли 32 женщины без гинекологической патологии, которым проведены пайпель-биопсия и гистологическое исследование эндометрия на 18—22-й день менструального цикла, что соответствовало 3-м суткам приема препаратов прогестерона с целью поддержки лютеиновой фазы в менструальном цикле. Данные пациентки обратились по вопросам планирования беременности, у них в анамнезе были естественные беременности без отклонения от физиологического течения со срочными родами через естественные родовые пути, закончившиеся рождением здоровых детей.
Критерии включения:
1) репродуктивный возраст (возраст женщин 18—45 лет);
2) индекс массы тела (ИМТ) 19—30 кг/м2;
3) регулярный менструальный цикл;
4) нормальный уровень гормонов гипоталамо-гипофизарной системы, стероидных гормонов яичников, гормонов надпочечников и щитовидной железы в сыворотке крови;
5) уровень антимюллерова гормона (АМГ) выше 1 нг/мл;
6) письменное информированное добровольное согласие пациентки на участие в исследовании.
Критерии исключения:
1) наличие тяжелой экстрагенитальной патологии;
2) ВИЧ-инфекция, гепатит B, C;
3) ИМТ менее 19 кг/м2, более 30 кг/м2;
4) злокачественные опухоли любой локализации;
5) прием противомикробных, иммуномодулирующих препаратов в течение последних 4 мес.
Критерии исключения пациенток 2-й группы:
1) применение методов вспомогательных репродуктивных технологий;
2) невынашивание беременности в анамнезе.
Обследование пациенток проводили в соответствии со следующими нормативными документами: приказ Минздрава России №572н от 1 ноября 2012 г. «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)»; приказ Минздрава России №107н от 30 августа 2012 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению»; приказ Минздрава России №803н от 31 июля 2020 г. «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению»; приказ Минздрава России №556н от 30 октября 2012 г. «Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий».
Пациенткам 1-й (основной) группы выполнена процедура внутриматочного введения PRP по запатентованной методике [22]. Внутривенный забор крови проводили натощак в день процедуры внутриматочного введения PRP с соблюдением норм асептики и антисептики. Кровь набирали в вакуумную пробирку 4 мл с цитратом натрия 3,8% (пробирка для коагулогических исследований). Пробирку с кровью подвергали центрифугированию при 1500 об/мин в течение 5 мин для отделения эритроцитов. По окончании центрифугирования содержимое пробирки разделялось на две части: верхняя — желтого цвета (плазма), нижняя — красного цвета (конгломерат форменных элементов, в том числе эритроцитов). Плазму набирали шприцом в катетер для внутриматочных инсеминаций (переноса эмбрионов) в объеме 0,8—1 мл и в пробирку без наполнителя в объеме 0,3—0,5 мл для проверки количества вводимых тромбоцитов. Внутриматочное введение проводили за 120 и 48 ч до предполагаемого переноса эмбрионов.
Образцы плазмы женщин для внутриматочной аппликации исследовали на автоматических гематологических анализаторах BC-5300 и BC-5150 («Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.», КНР) унифицированными методами для определения количества элементов крови, вводимых в полость матки. В образцах плазмы определяли количественное содержание компонентов крови: тромбоцитов, лейкоцитов.
Выполнена световая (обзорная) микроскопия биоптатов эндометрия, полученных при биопсии эндометрия у пациенток 2-й группы на 18—22-й день менструального цикла, у пациенток 1-й группы — на 18—22-й день менструального цикла, предшествующего программе ВРТ, что соответствовало 3-м суткам приема препаратов прогестерона с целью поддержки лютеиновой фазы в спонтанном или индуцированном менструальном цикле, и на 3-и сутки применения препаратов прогестерона (за 48 ч до переноса эмбрионов) в цикле переноса эмбрионов. Материалы биоптатов эндометрия для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином Карацци и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону (ООО «БиоВитрум», Россия).
На гистологических препаратах оценивали структуру эндометрия (состояние стромы, железистого аппарата, соответствие эндометрия фазе менструального цикла, развитие сосудов стромы эндометрия). Особое внимание уделялось оценке наличия пиноподий, плотности их распространения, степени их развития в соответствии с фазой менструального цикла, акселерации или гипоплазии пиноподий. Определяли воспалительные изменения, острые нарушения кровообращения и дистрофические изменения в исследуемых структурах.
Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли при оптимальном увеличении на микроскопах Axioplan 2 Imaging («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия) и LiecaDM 2500 («LeicaMicrosystems CMS GmbH», Германия), с использованием цифровой фотокамеры Lieca DFC295 («LeicaMicrosystems CMS GmbH», Германия). Для объективизации суждений о характере структурных перестроек слизистой оболочки матки проводили стереометрический и морфометрический анализ образцов эндометрия. Для оценки фазовых изменений эндометрия использовали критерии, соответствующие ранней и средней фазам секреции: форму желез, наличие базальных вакуолей в клетках желез, компактизацию и усиление отека стромы. При оценке наличия секреторной трансформации желез использовали морфометрическую оценку срезов желез на поле зрения при увеличении ×400 с использованием программы «LASV 4.13».
Состояние рецептивности эндометрия оценивали по количеству и высоте пиноподий различной степени зрелости в поверхностном эпителии на микроскопе Axioplan 2 Imaging («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия), фотографирование микропрепаратов выполняли с помощью цифровой фотокамеры Lieca DFC295 («LeicaMicrosystems CMS GmbH», Германия). При микроскопии выделяли низкие пиноподии, имеющие вид низких куполообразных выпячиваний и реснитчатых цитоплазматических образований на апикальной поверхности эпителиоцитов; высокие пиноподии, которые выглядели как цилиндрические или булавовидные выпячивания апикальной поверхности эпителиоцитов. При микроскопии контур цитоплазматической мембраны у таких клеток был четкий, в цитоплазме визуализировались мелкие вакуоли. Измерение высоты пиноподий проводили от апикальной поверхности эпителиоцита до верхушки пиноподии не менее чем в 10 полях зрения и выводили среднее значение. В зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризовались как изобилующие (более 50%), умеренные (от 20 до 50%) и невыраженные (менее 20%).
При оценке иммуногистохимических показателей использовали «двухэтапный стрептавидин-биотин-пероксидазный метод с демаскировкой антигена» с помощью стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител («Bond RTU Primary», США) с использованием иммуногистостейнера закрытого типа Bond-MAX («Leica Biosystems Newcastle Ltd.», Великобритания). Проявление реакции «антиген-антитело» осуществлялось системой визуализации («Dako Cytomation», Дания). Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System («BioGenex Laboratories Inc», США).
В эндометрии определяли выраженность экспрессии рецепторов к ER (клон 6F11, «Bond RTU Primary», США), PR (клон 16, «Bond RTU Primary», США), LIF, «Invitrogen Corporation», США, разведение 1:100). В биоптатах слизистой оболочки матки исследованы показатели ангиогенеза — маркер эндотелия сосудов (CD34+; клон QBEnd/10, в стандартном разведении 1:25, «Bond RTU Primary», США), маркер пролиферации Ki67 (клон ММ1, «Bond RTU Primary», США).
Для иммуногистохимического исследования использовали серийные парафиновые срезы. Результаты реакции рецепторов к эстрогенам и прогестеронам идентифицировали по ядерному окрашиванию клеток в коричневый цвет для соответствующих маркеров с оценкой доли (%) окрашенных клеток и интенсивности их окраски. Экспрессию рецепторов к эстрогену, прогестерону оценивали по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная) и по количеству клеток.
Для оценки уровня экспрессии антигенов Ki67 в железах применяли индекс пролиферации, который рассчитывали как отношение количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер (при подсчете не менее 400 ядер) и выражали в процентах; экспрессию в ядрах стромальных клеток оценивали путем подсчета количества окрашенных ядер в поле зрения при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения.
Экспрессию CD34+ отмечали в виде темно-коричневого окрашивания только в эндотелиальных клетках и оценивали путем подсчета сосудистых щелей в поле зрения при увеличении ×400 при оценке не менее 10 полей зрения.
Экспрессию LIF определяли на мембранах клеток поверхностного эпителия, эпителия желез и клеток стромы эндометрия путем подсчета доли (%) окрашенных ядер в поле зрения при увеличении ×400, при этом изучали не менее 10 полей зрения. Реакция считалась положительной, когда клетки были окрашены в коричневый цвет. Долю (%) положительно окрашенных клеток измеряли в каждом фрагменте. Интенсивность окрашивания оценивали с использованием балльной шкалы от 0 до 3: оценка 0 — нет окрашивания; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3 — интенсивное окрашивание. H-score определяли как Σxi (i+1), где х — положительно окрашенные клетки (%), i — интенсивность окрашивания [23].
Для анализа результатов иммуногистохимических реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле:
HS=1а+2b+3c,
где a — слабо окрашенные клетки (%); b — умеренно окрашенные клетки (%); c — сильно окрашенные клетки (%); 1, 2, 3 — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Исследование проведено в соответствии с принципами доказательной медицины. Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируются на достаточном числе наблюдений, широком спектре методов исследования с использованием рекомендуемых статистических методик и прикладных статистических пакетов программ IBM SPSS 26.0 и Statistica 10.
В случае подчинения распределения признака закону нормального распределения данные представляли в виде средней величины (M) и стандартной ошибки средней (m). При отклонении распределения признака от закона нормального распределения данные представляли в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей) — Me (P25; P75).
Сравнение непрерывных количественных данных проведено с использованием t-критерия Стьюдента. Для сравнения бинарных данных применяли либо точный критерий Фишера (F-критерий), либо критерий Пирсона (χ2) с поправкой Йетса (если абсолютные частоты были меньше 10). Нулевая гипотеза отклонялась при p<0,05.
Качественные признаки представляли в виде абсолютного значения и относительной величины в процентах, оценку статистической значимости осуществляли с использованием критерия хи-квадрат (χ2). Критический уровень значимости различий p устанавливали равным 0,05 (критерий Краскела—Уоллиса) и p<0,05 (критерий Вилкоксона). Силу ассоциации полученных величин оценивали в значениях показателя соотношения шансов (ОШ). Значение ОШ и 95% доверительный интервал (ДИ 95%) вычисляли с помощью программы «Calculator for confidence intervals or odds ratio». Уровень статистической значимости принимали за p<0,05.
Результаты
В результате исследования выявлена клинико-анамнестическая характеристика пациенток обеих групп (табл. 1). Большинство женщин относились к среднему возрастному периоду (25—34 года), в том числе 56% пациенток 1-й группы и 56,3% пациенток 2-й группы. Статистически значимых различий по возрасту женщин не было (p1—2=0,963). Все обследованные женщины имели нормостенический (пропорциональный) тип телосложения и хорошо выраженные вторичные половые признаки (p1—2=0,172).
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток
| Характеристики | 1-я (основная) группа (n=25) | 2-я (контрольная) группа (n=32) | p |
| Возраст, годы | 33,56±4,69 | 34,6±5,7 | 0,963 |
| Количество пациенток с нормальной массой тела | 17 | 16 | 0,172 |
| Количество пациенток с избыточной массой тела | 8 | 16 | |
| Менархе, лет | 13,0±0,2 | 13,0±2,3 | 0,562 |
| Продолжительность цикла, дни | 29,1±0,3 | 28,0±0,0 | 0,845 |
| Длительность менструации, дни | 3,80±0,3 | 5,04±0,2 | 0,067 |
| Лютеинизирующий гормон, МЕ/л | 5,75 (4,5; 5,75) | 4,86 (3,89; 6,43) | 0,082 |
| Фолликулостимулирующий гормон, МЕ/л | 5,7 (4,83; 6,63) | 6,49 (5,81; 8,0) | 0,567 |
| Эстрадиол, пмоль/л | 103,68 (47,09; 153) | 67,0 (35,9; 84,51) | 0,832 |
| Антимюллеров гормон, нг/мл | 3,26 (2,11; 6,12) | 2,21 (1,2; 3,59) | 0,562 |
Примечание. Данные представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней — M±m, в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей — Me (P25; P75).
Гирсутизм, гипертрихоз и другие признаки гиперандрогении отсутствовали. Половые органы сформированы по женскому типу. Нормальную массу тела имели 68%пациенток основной группы и 50% — контрольной группы, статистически значимых различий не было. При оценке характера сопутствующей соматической патологии выявлен ряд особенностей (табл. 2).
Таблица 2. Структура соматической патологии
| Название и код заболевания (МКБ 10) | 1-я группа (n=25) | 2-я группа (n=32) | χ2 | p | ||
| абс | % | абс | % | |||
| Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ (E00-E90) | 9 | 36 | 1 | 3,125 | 8,336 | 0,004 |
| Болезни системы кровообращения (I00-I99) | 3 | 12 | 2 | 6,25 | 0,084 | 0,773 |
| Нарушения рефракции и аккомодации (H52) | 3 | 12 | 2 | 6,25 | 0,084 | 0,773 |
| Болезни молочной железы (N60-N64) | 10 | 40 | 5 | 15,63 | 3,135 | 0,077 |
| Болезни желудочно-кишечного тракта (K29) | 1 | 4 | 2 | 6,25 | 0,048 | 0,826 |
| Патология мочевыводящих путей (N2-N30) | 2 | 8 | 0 | 0 | 0,816 | 0,367 |
У пациенток основной группы статистически значимо чаще регистрировались заболевания эндокринной системы (за счет гипотиреоза, аутоиммунного тиреоидита), чем у женщин контрольной группы (p=0,004). Эти данные указывают на связь эндокринной соматической патологии (в том числе гипотиреоза) с репродуктивной функцией женщины и бесплодием [24]. У женщин основной группы, проходящих программу ВРТ, в анамнезе были неудачные попытки переноса эмбрионов хорошего и отличного качества. Среднее количество неудачных переносов составило 2,52±1,00.
В структуре гинекологических заболеваний у пациенток, проходящих программу ВРТ, отмечены гормонозависимые заболевания: наружный генитальный эндометриоз (8%), миома матки (8%), синдром поликистозных яичников (12%).
Гормональный статус пациенток обеих групп исследован с определением содержания следующих гормонов: лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола (Э), АМГ. Статистически значимые различия в уровне гормонов, характеризующих репродуктивную функцию, не выявлены.
Пациенткам основной группы проводили перенос эмбрионов хорошего качества (AB, BA, BB) в 80% случаев, отличного качества (AA) — в 20%. Частота наступления клинической беременности у пациенток составила 48% (n=12).
Для определения изменений гистологической картины эндометрия проведено исследование биопсийного материала пациенток в предыдущем цикле на 18—22-й день менструального цикла, что соответствовало 3-м суткам приема препаратов прогестерона, и в цикле переноса эмбриона с применением плазмотерапии (после первой процедуры внутриматочной аппликации).
Применение PRP при подготовке эндометрия к переносу эмбрионов меняет гистологическую картину эндометрия. Статистически значимыми изменениями в микроскопической картине эндометрия после первого введения PRP являются: уменьшение округлой формы желез (до проведения плазмотерапии p=0,019; после первого сеанса плазмотерапии p=0,254); увеличение частоты предецидуальной реакции стромы (до проведения плазмотерапии p=0,001; после первого сеанса плазмотерапии p=0,847); увеличение частоты отека стромы (до проведения плазмотерапии p=0,036; после первого сеанса плазмотерапии p=0,257); снижение частоты выявления лимфоцитов в строме (до проведения плазмотерапии p=0,000; после первого сеанса плазмотерапии p=0,117); увеличение числа толстостенных сосудов (до проведения плазмотерапии p=0,031; после первого сеанса плазмотерапии p=0,217) (рис. 1).
Рис. 1. Основные параметры микроскопической характеристики эндометрия до и после плазмотерапии и у фертильных женщин.
При сопоставлении гистологической и иммуногистохимической картин биоптата эндометрия у 25 пациенток с бесплодием (1-я группа) выявлены маркеры нерецептивного эндометрия, те показатели, которые статистически значимо отличались от показателей у 32 фертильных женщин (2-я группа). Ассоциации данных маркеров и наступления беременности у пациенток 1-й группы представлены в виде ОШ: недостаточная извитость желез в 1,2 раза уменьшает шанс наступления беременности — ОШ=0,840 (95% ДИ 0,708—0,997); отсутствие предецидуальной реакции стромы в 6,7 раза снижает шанс наступления беременности — ОШ=0,149 (95% ДИ 0,044—0,505); наличие субнуклеарной вакуолизации в железистом эпителии в 10 раз уменьшает шанс наступления беременности — ОШ=0,098 (95% ДИ 0,028—0,340); отсутствие секреторной трансформации в 3,6 раза уменьшает шанс наступления беременности — ОШ=0,280 (95% ДИ 0,149—0,525). Наличие лимфоцитов стромы в образцах биоптата эндометрия является признаком хронического эндометрита, который приводит к снижению шанса наступления беременности в 26 раз — ОШ=0,038 (95% ДИ 0,007—0,195). Отсутствие толстостенных и тонкостенных сосудов уменьшает шанс наступления беременности в 8 раз — ОШ=0,214 (95% ДИ 0,014—1,08) и в 2,3 раза ОШ=0,44 (95% ДИ 0,283—0,685) соответственно; нарушение кровоснабжения эндометрия, выражающееся в отсутствии полнокровных сосудов в гистологической картине, уменьшает шанс наступления беременности в 33 раза — ОШ=0,029 (95% ДИ 0,003—0,253), а также в отсутствии отека стромы, что в 3,9 раза уменьшает шанс имплантации — ОШ=0,256 (95% ДИ 0,067—0,958). Выявлена сниженная высота пиноподий при измерении от апикальной поверхности эпителиоцита до верхушки пиноподии у пациенток с бесплодием (p<0,05); снижены показатели H-scoreER и LIF в строме и железах (p<0,05); повышены показатели Ki67 в строме (p<0,05) (табл. 3).
Таблица 3. Характеристика экспрессии в эндометрии рецепторов эстрогена, прогестерона, LIF, Ki67 до плазмотерапии у пациенток с бесплодием и у фертильных женщин
| Показатель | Группа | Выраженность экспрессии | p |
| H-score PR железы | 1-я (до PRP) | 269 (150; 300) | 0,080 |
| 2-я | 215 (186,5; 221,25) | ||
| H-score PR строма | 1-я (до PRP) | 169 (140; 267) | 0,096 |
| 2-я | 220 (210; 225) | ||
| H-score ER железы | 1-я (до PRP) | 85 (16; 211) | 0,001* |
| 2-я | 210 (180; 250) | ||
| H-score ER строма | 1-я (до PRP) | 44 (5; 123) | 0,001* |
| 2-я | 110 (90; 162,5) | ||
| H-score LIF железы | 1-я (до PRP) | 75 (0; 100) | 0,000* |
| 2-я | 300(127,5; 300) | ||
| H-score LIF строма | 1-я (до PRP) | 0 (0; 0) | 0,000* |
| 2-я | 300(0; 300) | ||
| Ki67 строма | 1-я (до PRP) | 17 (9; 23) | 0,007* |
| 2-я | 7,5 (0; 16,25) | ||
| Ki67 железы | 1-я (до PRP) | 4 (1; 25) | 0,083 |
| 2-я | 1 (0; 11,25) |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей — Me (P25; P75). * — p<0,05 — уровень статистической значимости различий.
Одним из важнейших маркеров рецептивности эндометрия являются пиноподии — выросты на апикальной части поверхности мембран желез эндометрия в середине лютеиновой фазы менструального цикла. При применении плазмотерапии выявлена динамика увеличения высоты и площади распределения пиноподий, однако статистических различий не было (p>0,05) (рис. 2 и далее на цв. вклейке). Полученные сравнительные гистологические данные показывают, что внутриматочное введение плазмы, обогащенной тромбоцитами в сроках «окна» имплантации способствует формированию адекватной секреторной трансформации эндометрия, что приводит к наступлению клинической беременности у пациенток с неудачными попытками переноса эмбрионов в анамнезе.
Рис. 2. Гистологическая картина эндометрия.
а — зрелые пиноподии, занимающие большую часть апикальной поверхности эпителиоцитов в эндометрии женщины 2-й группы; б — поверхностный эпителий с редкими невысокими пиноподиями до плазмотерапии. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.
Роль экспрессии рецепторов в формировании «окна имплантации» описана во многих работах [8, 25, 26]. При повторных неудачах имплантации в строме эндометрия определяется дисбаланс ER и PR (снижение стероидной рецепции или гиперэкспрессия ER). По результатам иммуногистохимического анализа в эндометрии пациенток, у которых наступила беременность после плазмотерапии, показатели H-score ER (p=0,006) (рис. 3) и H-score PR (p=0,003) (рис. 4) в строме ниже по сравнению с показателями в эндометрии фертильных женщин контрольной группы. Проведена оценка зависимости иммуногистологических изменений эндометрия и наступления клинической беременности в циклах криопереноса эмбрионов.
Рис. 3. Экспрессия ER у пациентки.
а — сниженная экспрессия до плазмотерапии; б — нормальная экспрессия после плазмотерапии. Иммуногистохимическое исследование, ×200.
Рис. 4. Экспрессия PR у пациентки.
а — сниженная экспрессия до плазмотерапии; б — нормальная экспрессия после плазмотерапии. Иммуногистохимическое исследование, ×200.
Зафиксирована клиническая беременность у пациенток с особенностями иммуногистологической картины после первого сеанса плазмотерапии: снижение интенсивности экспрессии PR в строме (p=0,002) и ER в железах (p=0,01). Приближается к статистически значимым различиям отношение рецепторов прогестерона к рецепторам эстрогенов в строме. У пациенток с показателем соотношения H-score ER/PR выше 3 частота наступления беременности снижается (p=0,063).
В результате плазмотерапии увеличивается экспрессия рецепторов эстрогена в железах (p=0,002) (табл. 4).
Таблица 4. Характеристика экспрессии иммуногистохимических маркеров в эндометрии до и после плазмотерапии
| Показатель | Выраженность экспрессии | Значение критерия | p |
| H-score PR железы | 104 | 0,717 | |
| до PRP | 269 (150; 300) | ||
| после PRP | 206 (202; 300) | ||
| H-score PR строма | 148,5 | 0,706 | |
| до PRP | 169 (140; 267) | ||
| после PRP | 182 (126; 280) | ||
| H-score ER железы | 50 | 0,002* | |
| до PRP | 85 (16; 211) | ||
| после PRP | 215 (143; 300) | ||
| H-score ER строма | 168 | 0,882 | |
| до PRP | 44 (5; 123) | ||
| после PRP | 47 (22; 106) | ||
| H-score LIF железы | 220 | 0,000* | |
| до PRP | 75(0; 100) | ||
| после PRP | 100 (0; 400) | ||
| H-score LIF строма | 80 | 0,077 | |
| до PRP | 0 (0; 0) | ||
| после PRP | 54 (13; 302) | ||
| CD 34+ | 37,5 | 0,346 | |
| до PRP | 16 (12; 26) | ||
| после PRP | 14,5 (11,25; 19,25) | ||
| Ki67 строма | 54,5 | 0,9 | |
| до PRP | 17 (9; 23) | ||
| после PRP | 10 (4; 40) | ||
| Ki67 железы | 69,5 | 0,285 | |
| до PRP | 4 (1; 25) | ||
| после PRP | 7,5 (2,25; 28,75) |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей — Me (P25; P75). * — p<0,05 — уровень статистической значимости различий.
При сравнении показателей H-score LIF наблюдается повышение экспрессии после плазмотерапии в железах (p<0,001), однако статистически значимых различий исхода программы ВРТ не было. После плазмотерапии наблюдается снижение экспрессии Ki67 в строме и повышение экспрессии Ki67 в железах, однако статистически значимых различий не было (p=0,285).
В обзорах литературы нарушение регуляции числа клеток натуральных киллеров и или функции клеток (цитотоксичность, экспрессия рецепторов, секреция цитокинов или экспрессия генов) связаны с неудачами имплантации эмбрионов, приводящими к бесплодию и привычному невынашиванию беременности. Увеличение количества CD34+ в эндометрии указано как маркер успешной имплантации [25]. Однако в нашем исследовании статистически значимые изменения экспрессии CD 34+ в эндометрии до и после плазмотерапии не выявлены (p=0,346).
Выводы
При внутриматочном использовании плазмы, обогащенной тромбоцитами, у пациенток с повторными неудачами имплантации происходит восстановление морфофункционального состояния эндометрия и показателей его рецептивности до уровня, сопоставимого с данными параметрами у фертильных здоровых женщин. При этом отмечены статистически значимые изменения: снижение частоты выявления лимфоцитов в строме и периваскуляного склероза; увеличение частоты отека стромы; формирование секреторной трансформации, предецидуальной реакции стромы, а также наличие желез извитой формы. При оценке исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий и изменений иммуногистохимических показателей после внутриматочной терапии PRP выявлены наиболее значимые факторы, которые повышают шанс наступления беременности — это снижение экспрессии рецепторов прогестерона в строме, а также повышение экспрессии рецепторов эстрогенов в железах и строме.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.