Введение
Распространенность бесплодия, в последние десятилетия достигающая критических значений в отношении воспроизводства населения, является одним из ключевых демографических вызовов для нашей страны. Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), призванные противостоять данной проблеме, находят все более широкую поддержку государства, что дает мощный импульс в их развитии и способствует росту числа беременностей, наступивших в результате применения программ ВРТ. Так, за последнее десятилетие в России, по данным отчетов РАРЧ, число родов после ВРТ увеличилось в 2,5 раза [1].
В многочисленных научных исследованиях установлено, что беременность, наступившая в результате применения ВРТ, ассоциирована с повышенным риском акушерских и перинатальных осложнений. Осложнения обусловлены, во-первых, состоянием репродуктивного здоровья самих пациенток, нуждающихся в применении методов вспомогательной репродукции и несущих определенный багаж акушерско-гинекологической, а иногда и связанной с возрастом соматической патологии, во-вторых, интенсивным гормональным воздействием на организм при проведении стимуляции суперовуляции, оказывающей влияние на критические моменты развития беременности — имплантацию, ранний эмбриогенез, плацентогенез [2, 3].
Одним из наиболее значимых перинатальных рисков, связанных с применением программ ВРТ, отмеченных в метаанализах S. Maroufizadeh и соавт. (2021), J.K. Bosdou и соавт. (2020), является практически девятикратное повышение частоты развития гестационного сахарного диабета (ГСД) при индуцированной беременности [4, 5].
Это может быть связано, с одной стороны, с факторами, вызывающими бесплодие, в том числе с метаболическими и сосудистыми факторами, усугубляющимися во время индукции суперовуляции и поддержки лютеиновой фазы. С другой стороны, многочисленные крупные исследования, посвященные изучению роли гипергликемии матери, в том числе популяционное исследование HAPO [6], отечественные исследования Э.К. Айламазяна и соавт. (2019), доказывают, что ГСД предопределяет значимо более высокие, чем в популяции, риски формирования акушерских и перинатальных осложнений [7].
Распространенность ГСД продолжает расти во всем мире, что связано с эпидемиологическими факторами, такими как увеличение частоты ожирения у женщин репродуктивного возраста [2, 8].
ГСД является полигенным многофакторным заболеванием, триггером в реализации которого являются эпигенетические влияния при наличии определенных межгенных ассоциаций полиморфизмов генов [2, 8, 9]. В публикациях последних десятилетий появилось много данных об общности генных сетей и молекулярных механизмов, провоцирующих развитие ГСД и его осложнений при беременности [10, 11]. Генетическая предрасположенность к реализации перинатальных осложнений ГСД рассматривается как комбинация функционально неблагоприятных аллелей самых разных групп генов, для многих из которых установлен полиморфизм [12, 13].
Анализ межгенных ассоциаций генов — регуляторов липидного и углеводного обмена, ангиогенеза и эндотелиальной функции может рассматриваться как перспективный подход к выявлению пациентов с высоким риском развития перинатальных осложнений, ассоциированных с ГСД, у беременных после применения программ ВРТ.
Цель исследования — определить роль межгенных ассоциаций генов — регуляторов липидного и углеводного обмена, ангиогенеза и эндотелиальной функции в наследственной предрасположенности к реализации перинатальных осложнений ГСД у пациенток после применения ВРТ.
Материал и методы
В исследовании приняли участие 228 пациенток с бесплодием, беременность которых наступила в результате применения ВРТ. Основную группу исследования составили 123 пациентки с ГСД. Группа разделена две подгруппы: первая подгруппа — беременные с перинатальными осложнениями (n=76), вторая подгруппа — беременные без перинатальных осложнений (n=47). В данном исследовании проанализированы плацента-ассоциированные перинатальные осложнения: умеренная и тяжелая преэклампсия, плацентарная недостаточность, задержка роста плода и малый размер плода для его гестационного возраста. Группа сравнения состояла из 105 пациенток, у которых беременность наступила в результате ВРТ, но не осложнилась развитием ГСД.
Всем пациенткам проведены исследование углеводного обмена, осмотр эндокринолога и расчет индекса массы тела (ИМТ). Диагноз ГСД устанавливали в соответствии с критериями HAPO, которые определяют уровень глюкозы в крови после нагрузки (уровень глюкозы в венозной плазме натощак ≥5,1 ммоль/л, или через 1 ч после нагрузки ≥10,0 ммоль/л и через 2 ч ≥8,5 ммоль/л) [14].
Молекулярно-генетическое типирование полиморфных вариантов генов — регуляторов липидного и углеводного обмена, ангиогенеза и эндотелиальной функции PPARG (Pro12Ala C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), ApoB Pro2739leu G>A, VEGF-A: —634 G>C и eNOS Glu298Asp G894T G>T проводилось с использованием метода аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Результаты ПЦР оценивались с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Межгенные взаимодействия оценивали с использованием биоинформатического метода сокращения многофакторной размерности в модификации Model-Based-MDR (MB-MDR), что позволяет анализировать как качественные, так и количественные признаки, связанные с межгенными взаимодействиями, а также оценивать все модели комбинаций SNP, выбирая наилучшие, характеризующиеся наименьшей ошибкой предсказания и наивысшей воспроизводимостью [15, 16]. Метод MB-MDR проявляет высокую статистическую мощность в присутствии генетической гетерогенности [16, 17] и может обнаруживать сложные взаимодействия между генами, даже если они проявляются только в определенных подгруппах пациентов. Окончательный уровень значимости p для наилучшей n-локусной модели оценивался процедурой Монте-Карло (1 000 симуляций). Статистически значимым считали различия при p<0,05.
Графики и дендрограммы для визуализации результатов MB-MDR построены с использованием Generalized MDR (GMDR) [18].
Статистический анализ выполнен с использованием методов параметрической и непараметрической статистики с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel (2010), StatSoft Statistica 10.0 («StatSoft Inc.», США), SPSS Statistics версия 22.0 («Microsoft Corporation», США). Данные в тексте и таблицах для выборок с нормальным распределением представлены в виде M±σ, где M — среднее, σ — стандартное отклонение; для выборок с распределением, отличающимся от нормального, в виде Me [25; 75], где Me — медиана, цифры в скобках — 25-й и 75-й процентили.
Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное значение и относительную величину в процентах, проверку статистических гипотез осуществляли с использованием критерия хи-квадрат (χ2). Критический уровень значимости различий (p), при котором нулевая гипотеза об отсутствии различий отвергалась и принималась альтернативная, устанавливали равным 0,025 (критерий Краскела—Уоллиса) и p<0,05 (критерий Вилкоксона).
Определение статистической значимости различий между группами пациенток по частотам генотипов и аллелей проводили с помощью критерия χ2. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди—Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ2 с использованием программы Hardy—Weinberg equilibrium.
Результаты и обсуждение
Пациентки, беременность которых наступила в результате применения программ ВРТ и осложнилась развитием ГСД, были сопоставимы по возрасту с пациентками без ГСД (37 [34; 40] года и 34 [30; 36,5] года соответственно; p>0,05). У пациенток основной группы ИМТ был статистически значимо выше, чем у пациенток группы сравнения: 30,3 [26,0; 32,3] кг/м2 и 26,1 [24,3; 30,0] кг/м2 соответственно, p<0,05.
Пациентки были сопоставимы по структуре факторов бесплодия, используемым протоколам и программам ВРТ в группах наблюдения, p>0,05.
У пациенток основной группы чаще, чем у пациенток группы сравнения встречались тяжелая преэклампсия (ОШ 1,038; 1,076—69,592; p=0,048) и умеренная преэклампсия (ОШ 1,083; 1,111—77,515; p=0,044), плацентарная недостаточность, реализующаяся в виде синдрома задержки роста плода (ОШ 1,21; 1,076—42,52; p=0,04). В то же время у пациенток основной группы закономерно чаще наблюдалась макросомия плода по данным УЗИ (OR 6,050; 1,239—29,541; p=0,023). Средний срок родоразрешения у пациенток групп наблюдения статистически значимо не различался и составил у пациенток основной группы 38,29±2,69 нед, у пациенток группы сравнения — 39,54±2,24 нед (p>0,05), что соответствует данным клинических рекомендаций [14].
С целью выявления генетической предрасположенности к развитию ГСД проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов по полиморфным вариантам генов PPARG (Pro12Ala C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), apoB Pro2739leu G>A, VEGF-A: —634 G>C и eNOS Glu298Asp G894T G>T у пациенток исследуемых групп.
Распределение частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов генов у пациенток сравниваемых групп соответствовало равновесию Харди— Вайнберга. При исследовании вариантных аллелей и распределения генотипов по исследуемым локусам генов использовались общая и мультипликативная модели.
Анализ распределения генотипов по полиморфным маркерам исследованных генов выявил роль гомозиготного мажорного варианта гена PPARG P12A СС в риске развития ГСД у пациенток с беременностью после ВРТ (ОШ=2,463 (95% ДИ 1,43; 4,25); p=0,002). Напротив, гомозиготный минорный вариант генотипа PPARG P12 GG статистически чаще обладал протективным эффектом в отношении риска развития ГСД у пациенток после ВРТ (ОШ=0,331 (95% ДИ 0,15; 0,72); p=0,004). Установлено, что гомозиготный минорный вариант генотипа TCF7L2 IVS3 TT статистически значимо чаще встречался у пациенток, беременность которых после ВРТ осложнилась формированием ГСД (ОШ=3,795 (95% ДИ 1,48; 9,72); p=0,004) (табл. 1).
Таблица 1. Распределение частот генотипов по полиморфным маркерам исследуемых генов — регуляторов липидного, углеводного обмена, ангиогенеза и тонуса сосудов в исследуемых группах
| Ген/генотип | Основная группа (n=123) | Группа сравнения (n=105) | χ2 | p | ОШ | 95% ДИ | |||
| n | % | n | % | ||||||
| PPARG P12A CC | 87 | 70,7 | 52 | 49,5 | 10,706 | 0,002 | 2,463 | 1,428 | 4,249 |
| PPARG P12A CG | 25 | 20,3 | 29 | 27,6 | 1,667 | 0,197 | 0,669 | 0,362 | 1,234 |
| PPARG P12A GG | 11 | 9,0 | 24 | 22,9 | 8,439 | 0,004 | 0,331 | 0,154 | 0,715 |
| ApoB Pro2739leu GG | 74 | 60,2 | 69 | 65,7 | 0,747 | 0,388 | 2,762 | 0,927 | 8,225 |
| ApoB Pro2739leu GA | 29 | 23,6 | 22 | 21,0 | 0,225 | 0,636 | 0,135 | 0,016 | 1,142 |
| ApoB Pro2739leu AA | 20 | 16,3 | 14 | 13,3 | 0,382 | 0,537 | 0,684 | 0,316 | 2,571 |
| TCF7L2 IVS3 CC | 74 | 60,2 | 76 | 72,4 | 3,757 | 0,053 | 0,576 | 0,329 | 1,009 |
| TCF7L2 IVS3 CT | 26 | 21,1 | 23 | 21,9 | 0,020 | 0,889 | 0.956 | 0,503 | 1,800 |
| TCF7L2 IVS3 TT | 23 | 18,7 | 6 | 5,7 | 8,603 | 0,004 | 3,795 | 1,482 | 9,720 |
| VEGF-A:—634 GG | 73 | 59,3 | 51 | 48,6 | 2,653 | 0,104 | 1,546 | 0,914 | 2,614 |
| VEGF-A: —634 GC | 32 | 26,1 | 32 | 30,4 | 0,558 | 0,456 | 0,802 | 0,450 | 1,431 |
| VEGF-A: —634 CC | 18 | 14,6 | 22 | 21,0 | 1,563 | 0,212 | 0,647 | 0,326 | 1,258 |
| eNOS G894T GG | 54 | 43,9 | 49 | 46,7 | 0,175 | 0,676 | 0,894 | 0,530 | 1,509 |
| eNOS G894T GT | 38 | 30,9 | 29 | 27,6 | 0,293 | 0,589 | 1,172 | 0,660 | 2,080 |
| eNOS G894T TT | 31 | 25,2 | 27 | 25,7 | 0,008 | 0,930 | 0,973 | 0,535 | 1,770 |
При анализе распределения частот аллелей сравниваемых генов выявлено, что значимо чаще носительство полиморфного аллеля C в локусе P12A гена PPARG ассоциировано с риском развития ГСД у беременных после ВРТ (ОШ=2,451 (95% ДИ 1,604; 3,746); p=0,001). Частота минорного аллеля G в локусе P12A гена PPARG у пациенток группы сравнения была статистически значимо выше, чем у пациенток с беременностью, осложнившейся развитием ГСД (ОШ=0,408 (95% ДИ 0,267; 0,623); p=0,001).
Носительство полиморфного аллеля T в гене TCF7L2 IVS3 выявлено чаще у пациенток основной группы относительно группы сравнения (ОШ=2,069 (95% ДИ 1,312; 3,261); p=0,002), (табл. 2). Полиморфизмы гена фактора транскрипции 7 2 (TCF7L2) влияют на восприимчивость к инсулину, косвенно изменяя экспрессию GLP-1, который в дополнение к инсулину играет критическую роль в гомеостазе глюкозы.
Таблица 2. Распределение частот аллелей по полиморфным маркерам исследуемых генов — регуляторов апоптоза и ангиогенеза в исследуемых группах
| Ген/аллель | Основная группа (n=123) | Группа сравнения (n=105) | χ2 | p | ОШ | 95% ДИ | |||
| n | % | n | % | ||||||
| PPARG P12A: С | 199 | 80,9 | 133 | 63,3 | 17,746 | 0,001 | 2,451 | 1,604 | 3,746 |
| PPARG P12A: G | 47 | 19,1 | 77 | 36,7 | — | — | 0,408 | 0,267 | 0,623 |
| ApoB Pro2739leu: G | 177 | 71,9 | 160 | 76,2 | 1,056 | 0,305 | 0,802 | 0,506 | 1,223 |
| ApoB Pro2739leu :A | 69 | 28,1 | 50 | 23,8 | — | — | 1,247 | 0,818 | 1,303 |
| TCF7L2 IVS3: C | 174 | 70,7 | 175 | 83,3 | 9,711 | 0,002 | 0,483 | 0,307 | 0,762 |
| TCF7L2 IVS3: T | 72 | 29,3 | 35 | 16,7 | — | — | 2,069 | 1,312 | 3,261 |
| VEGF-A: –634 G | 178 | 72,4 | 134 | 63,8 | 2,831 | 0,187 | 1,485 | 0,861 | 2,207 |
| VEGF-A: –634 C | 68 | 27,6 | 76 | 36,2 | — | — | 0,674 | 0,453 | 1, 084 |
| eNOS: 894T G | 146 | 59,3 | 127 | 79,5 | 0,060 | 0,807 | 0,954 | 0,655 | 1,389 |
| eNOS: 894 T | 100 | 40,7 | 83 | 20,5 | — | — | 1,048 | 0,720 | 1,526 |
По мнению многих авторов, наследственная предрасположенность к ГСД связана с комбинацией аллелей нескольких генов, которые влияют на развитие и клинические проявления данного заболевания [7, 10, 11].
Установлена роль межгенной ассоциации полиморфизмов генов PPARG (P12A C/G), eNOS (Glu298Asp G894T G/T) и TCF7L2 (IVS3 C/T) в наследственной предрасположенности к развитию ГСД у беременных после ВРТ.
Наличие в генотипе вариантного аллеля C по полиморфному варианту PPARG увеличивает шансы развития ГСД у беременных после программ ВРТ (χ2=11,62; ОШ=2,56; 95% ДИ 1,48—4,41; p=0,0006). Ген PPARG (P12A C/G) — рецептор γ, активируемый пролифератором пероксисом (PPARG), является членом суперсемейства ядерных гормональных рецепторов, который привлек значительное внимание в качестве гена — кандидата для ГСД на основании его функции в качестве ключевого фактора, участвующего в регуляции дифференцировки адипоцитов, а также метаболизма липидов и глюкозы, чувствительности к инсулину.
Гомозиготный вариант аллеля по полиморфным маркерам eNOS (Glu298Asp G894T GG) × TCF7L2 (IVS3 CC) увеличивает шансы развития ГСД у пациенток после ВРТ (χ2=31,22; ОШ=4,86; 95% ДИ 2,75—8,60 p<0001). Риск развития ГСД возрастает у пациенток после ВРТ при наличии гетерозиготного аллея полиморфных генов eNOS (Glu298Asp G894T G/T) × TCF7L2 (IVS3 C/T) и рецессивной модели генов eNOS (Glu298Asp G894T G/T) × TCF7L2 (IVS3 C/T) (χ2=59,55; ОШ=9,72; 95% ДИ 5,28—17,91; p<0001). Ген eNOS кодирует фермент, ответственный за синтез в сосудистой стенке NO — важнейшего вазодилататора, антиагреганта, антимитогена и антиоксиданта. Снижение активности гена eNOS при наличии патологических аллелей является инициатором нарушения липидного и углеводного обменов и, как следствие, развитие избыточного ГСД.
Однако считается, что отдельные генетические варианты имеют небольшой вклад в формирование патологического фенотипа. Поэтому для более полного понимания патогенеза ГСД необходимо изучать межгенные и генно-средовые взаимодействия, которые играют важную роль в формировании клинического фенотипа.
Межгенные взаимодействия — одна из ключевых областей исследований в биоинформатике, которая помогает нам понять сложные взаимодействия между генами и их влияние на различные фенотипы.
С использованием программы MDR нами построены одно-, дву- и трехлокусные модели ген-генных взаимодействий в зависимости от формирования ГСД при беременности, наступившей в результате использования ВРТ. Исходя из максимальных значений коэффициента перекрестной проверки и точности предсказания, оптимальной является трехлокусная модель прогнозирования риска развития ГСД у пациенток после ВРТ PPARG (P12A C/G) × eNOS (Glu298Asp G894T G/T) × TCF7L2 (IVS3 C/T), характеризующаяся чувствительностью 93% и специфичностью 91% (табл. 3).
Таблица 3. Результаты анализа межгенных взаимодействий у пациенток с гестационным сахарным диабетом, рассчитанные с помощью программы Model-Based-MDR
| Число локусов в модели | Наиболее значимые комбинации локусов в модели | χ2 | p | ОР | ДИ | |
| 1 | PPARG (P12A C/G) | 11,62 | 0,0006 | 2,56 | 1,48 | 4,41 |
| 2 | eNOS (Glu298Asp G894T G/T) × TCF7L2 (IVS3 C/T) | 31,22 | <0,0001 | 4,86 | 2,75 | 8,60 |
| 3 | PPARG (P12A C/G) × eNOS (Glu298Asp G894T G/T) × TCF7L2 (IVS3 C/T) | 59,55 | <0,0001 | 9,72 | 5,28 | 17,91 |
| Точность предсказания модели: 0,89. Чувствительность: 0,93. Специфичность: 0,91 | ||||||
Примечание. ОР — относительный риск; ДИ — доверительный интервал.
Вклад каждого полиморфизма в риск развития нарушений углеводного обмена в будущем представили в виде дендограммы (рис. 1) и графа (рис. 2), демонстрирующих характер этих взаимодействий и их силу воздействия.
Рис. 1. График энтропии, отражающий межгенные взаимодействия в полученной трехлокусной модели (коричневые и красные линии — синергизм действия) у пациенток исследуемых групп.
Рис. 2. Схема Фрюхтерман-Рейнгольда для межгенных взаимодействий у пациенток исследуемых групп.
Длинные линии в дендограмме (см. рис. 1) описывают слабую взаимосвязь между генами. Чем короче линии, соединяющие два предиктора, тем сильнее взаимодействие. Красные линии характеризуют наиболее сильные синергические взаимодействия.
Анализ дендрограммы показывает, что наиболее сильным синергическим взаимодействием обладают локусы TCF7L2 (IVS3 C>T) и eNOS (Glu298Asp G894T G/T). Локус гена PPARG (P12A C>G) выявляет слабое взаимодействие с этими генами с умеренным антагоничным эффектом.
Направленность взаимодействия между генами-кандидатами при формировании фенотипа обозначаются линиями разного цвета: красного — выраженный синергизм, оранжевого — умеренный синергизм, синего — выраженный антагонизм, зеленого — умеренный антагонизм, коричневого — аддитивное взаимодействие. Сила и направленность взаимодействий представлены в% энтропии.
Согласно схеме наибольшим предсказательным потенциалом обладает полиморфизм PPARG (P12A C>G) — 4,42% (см. рис. 2). В то же время оптимальным межгенным взаимодействием является двухлокусная модель TCF7L2 (IVS3 C>T) и eNOS (Glu298Asp G894T G/T) на долю комбинаций которой приходится 3,70% фенотипической энтропии, что демонстрирует выраженный синергический эффект полиморфизмов при формировании предрасположенности к развитию ГСД.
Взаимодействие локусов PPARG (P12A C>G) и TCF7L2 (IVS3 C>T) характеризуются умеренным аддитивным эффектом с низким процентом фетотипической энтропии — 0,78%.
При проведении MB-MDR анализа (рис. 3) выявлено 11 генотипов повышенного риска и 12 генотипов пониженного риска развития ГСД у беременных после ВРТ.
Рис. 3. Межгенные взаимодействия в риске формирования гестационного сахарного диабета.
Квадраты темно-серого цвета — генотипы повышенного риска развития гестационного сахарного диабета. Квадраты светло-серого цвета — генотипы пониженного риска развития гестационного сахарного диабета. Квадраты белые — отсутствие ассоциаций генотипов. Левые столбики — пациентки с гестационным сахарным диабетом; правые столбики — пациентки группы сравнения.
С целью определения у пациенток после ВРТ генетической предрасположенности к формированию перинатальных осложнений ГСД, ассоциированных с дисфункцией плаценты, проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов по полиморфным вариантам генов PPARG (P12A C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), ApoB (Pro2739leu G>A), VEGF-A: —634 G>C, eNOS (Glu298Asp G894T G>T) у женщин двух подгрупп. Частота аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов в обеих группах соответствовала равновесию Харди—Вайнберга.
Анализ распределения генотипов по полиморфным локусам исследованных генов позволяет установить, что полиморфные маркеры eNOS (G894T G>T) и VEGF-A: —634 G>C играют значительную роль в определении риска развития перинатальных осложнений ГСД у пациенток после ВРТ. Исследуя первую подгруппу, состоящую из пациенток с перинатальными осложнениями ГСД после ВРТ, мы выявили, что минорные гомозиготы VEGF-A:—634 CC по полиморфному маркеру VEGF-A: —634 G>C (χ2=4,145; ОШ=3,607; 95% ДИ 1,084—13,218; p=0,042) и минорные гомозиготы eNOS (G894T) TT по полиморфному маркеру eNOS (G894T G>T) (χ2=4,289; ОШ=2,480; 95%ДИ 1,689 — 6,351; p=0,039) наблюдались со статистически значимо большей частотой (табл. 4).
Таблица 4. Распределение частот генотипов по полиморфным маркерам исследуемых генов — регуляторов липидного, углеводного обмена, ангиогенеза и тонуса сосудов в подгруппах наблюдения у пациенток с гестационным сахарным диабетом при беременности после применения вспомогательных репродуктивных технологий
| Ген/генотип | Подгруппа 1 (n=76) | Подгруппа 2 (n=47) | χ2 | p | ОШ | 95% ДИ | |||
| n | % | n | % | ||||||
| PPARG P12A CC | 53 | 69,7 | 34 | 72,3 | 0,095 | 0,758 | 0,881 | 0,394 | 1,971 |
| PPARG P12A CG | 15 | 19,7 | 10 | 21,3 | 0,043 | 0,837 | 0,910 | 0,371 | 2,234 |
| PPARG P12A GG | 8 | 10,6 | 3 | 6,4 | 0,612 | 0,434 | 1,725 | 0,434 | 6,859 |
| ApoB Pro2739leu GG | 49 | 64,5 | 25 | 53,2 | 1,542 | 0,215 | 1,597 | 0,761 | 3,350 |
| ApoB Pro2739leu GA | 17 | 22,4 | 12 | 25,5 | 0,161 | 0,688 | 0,840 | 0,360 | 1,964 |
| ApoB Pro2739leu AA | 10 | 13,1 | 10 | 21,3 | 1,406 | 0,236 | 0,561 | 0,214 | 1,561 |
| VEGF-A: —634 GG | 39 | 51,4 | 34 | 72,3 | 5,321 | 0,022 | 0,403 | 0,184 | 0,881 |
| VEGF-A: —634 GC | 22 | 28,9 | 10 | 21,3 | 0,888 | 0,347 | 0,437 | 0,640 | 3,550 |
| VEGF-A: —634 CC | 15 | 19,7 | 3 | 6,4 | 4,145 | 0,042 | 3,607 | 1,084 | 13,218 |
| TCF7L2 IVS3 CC | 49 | 64,5 | 25 | 53,2 | 0,762 | 0,439 | 1,485 | 0,670 | 2,873 |
| TCF7L2 IVS3 CT | 14 | 18,4 | 12 | 25,5 | 0,234 | 0,629 | 0,795 | 0,434 | 1,854 |
| TCF7L2 IVS3 TT | 13 | 17,1 | 10 | 21,3 | 0,322 | 0,565 | 0,763 | 0,305 | 1,914 |
| eNOS G894T GG | 28 | 36,8 | 26 | 55,3 | 4,026 | 0,045 | 0,471 | 0,225 | 0,898 |
| eNOS G894T GT | 24 | 31,6 | 14 | 29,8 | 0,044 | 0,835 | 1,088 | 0,494 | 1,398 |
| eNOS G894T TT | 24 | 31,6 | 7 | 14,9 | 4,289 | 0,039 | 2,637 | 1,689 | 6,351 |
В подгруппе женщин без перинатальных осложнений ГСД после ВРТ, наоборот, чаще встречались генотипы мажорных гомозигот VEGF-A: –634 GG по полиморфному маркеру VEGF-A: –634 G>C (χ2=5,321; p=0,022) и мажорных гомозигот eNOS (G894T) GG по полиморфному маркеру eNOS (G894T G>T) (χ2=4,026; p=0,045). Эти результаты указывают на связь между генетическими факторами и развитием перинатальных осложнений ГСД после ВРТ (см. табл. 4).
Анализ распределения аллелей исследуемых генов показал, что пациентки с перинатальными осложнениями ГСД после ВРТ имели более высокую частоту выявления вариантного аллеля C полиморфного ДНК-локуса VEGF-A: –634 G>C (χ2=8,058; ОШ=2,535; 95% ДИ 1,345—4,778; p=0,004) и вариантного аллеля Т гена eNOS G894T (χ2=7,411; ОШ=1,121; 95% ДИ 1,230—3,658; p=0,007) (табл. 5).
Таблица 5. Распределение частот аллелей по полиморфным маркерам исследуемых генов — регуляторов липидного, углеводного обмена, ангиогенеза и тонуса сосудов в подгруппах наблюдения у пациенток с гестационным сахарным диабетом при беременности после применения вспомогательных репродуктивных технологий
| Ген/аллель | Подгруппа 1 (n=76) | Подгруппа 2 (n=47) | χ2 | p | ОШ | 95% ДИ | |||
| n | % | n | % | ||||||
| PPARG P12A: С | 121 | 79,6 | 78 | 83,0 | 0,428 | 0,514 | 0,801 | 0,411 | 1,560 |
| PPARG P12A: G | 31 | 20,4 | 16 | 17,0 | 1,249 | 0,641 | 2,434 | ||
| ApoB Pro2739leu: G | 115 | 75,7 | 62 | 66,0 | 2,708 | 0,100 | 1,604 | 0,912 | 2,823 |
| ApoB Pro2739leu :A | 37 | 24,3 | 32 | 34,0 | 0,623 | 0,354 | 1,097 | ||
| VEGF-A: —634 G | 100 | 65,8 | 78 | 83,0 | 8,580 | 0,004 | 0,394 | 0,209 | 0,743 |
| VEGF-A: —634 С | 52 | 34,2 | 16 | 17,0 | 2,535 | 1,345 | 4,778 | ||
| TCF7L2 IVS3: C | 111 | 73,0 | 63 | 67,0 | 1,012 | 0,315 | 1,332 | 0,761 | 2,331 |
| TCF7L2 IVS3: T | 41 | 27,0 | 31 | 33,0 | 0,751 | 0,429 | 1,314 | ||
| eNOS: 894T G | 80 | 52,6 | 66 | 70,2 | 7,441 | 0,007 | 1,121 | 1,230 | 3,658 |
| eNOS: 894 T | 72 | 47,4 | 28 | 29,8 | 0,471 | 0,273 | 0,813 | ||
Не обнаружены другие статистически значимые различия в распределении частот аллелей у исследуемых генов на полиморфных локусах.
С использованием биоинформатического метода сокращения многофакторной размерности сформирована трехлокусная модель прогнозирования риска развития перинатальных осложнений ГСД у пациенток после ВРТ PPARG (P12A C/G) × VEGF-A (–634 G/C) × eNOS (Glu298Asp G894T G/T), характеризующаяся чувствительностью 95% и специфичностью 93% (табл. 6).
Таблица 6. Результаты анализа межгенных взаимодействий у пациенток с гестационным сахарным диабетом и перинатальными осложнениями, рассчитанные с помощью программы Model-Based-MDR
| Число локусов в модели | Наиболее значимые комбинации локусов в модели | χ2 | p | ОР | ДИ | |
| 1 | VEGF-A (–634 G/C) | 20,76 | <0,0001 | 5,97 | 2,69 | 13,27 |
| 2 | PPARG (P12A C/G) × VEGF-A (–634 G/C) | 28,75 | <0,0001 | 8,68 | 3,77 | 19,97 |
| 3 | PPARG (P12A C/G) × VEGF-A (–634 G/C) × eNOS (Glu298Asp G894T G/T) | 33,53 | <0,0001 | 10,64 | 4,53 | 24,96 |
| Точность предсказания модели: 0,92. Чувствительность: 0,95. Специфичность: 0,93. | ||||||
Примечание. ОР — относительный риск; ДИ — доверительный интервал.
На рис. 4, 5 представлены межгенные взаимодействия в полученной трехлокусной модели прогнозирования риска развития перинатальных осложнений ГСД у пациенток после ВРТ.
Рис. 4. График энтропии, отражающий межгенные взаимодействия в полученной трехлокусной модели (коричневые и красные линии — синергизм действия) в исследуемых подгруппах.
Рис. 5. Схема Фрюхтерман-Рейнгольда для межгенных взаимодействий у пациенток исследуемых подгрупп.
Анализ дендрограммы (см. рис. 4) показывает, что наиболее сильным синергическим взаимодействием обладают локусы PPARG (P12A C>G) и eNOS (Glu298Asp G894T G>T). Локус гена VEGF-A (–634 G>C) выявляет умеренное взаимодействие с этими генами с антагонистическим эффектом.
Согласно рис. 5, наибольшим предсказательным потенциалом обладает полиморфизм VEGF-A (–634 G>C) — 12,55%. В то же время оптимальным межгенным взаимодействием является двухлокусная модель eNOS (Glu298Asp G894T G/T) и PPARG (P12A C>G), на долю комбинаций которой приходится 7,61% фенотипической энтропии, что демонстрирует выраженный синергический эффект полиморфизмов при формировании предрасположенности к развитию перинатальных осложнений на фоне ГСД.
Взаимодействие локусов PPARG (P12AC>G) и VEGF-A (–634 G>C) характеризуется умеренным аддитивным эффектом с низким процентом фенотипической энтропии — 2,10%.
Согласно результатам исследования, 11 генотипов являются факторами повышенного риска развития перинатальных осложнений при ГСД после ВРТ, а 7 генотипов являются факторами пониженного риска (рис. 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что генетические факторы могут играть важную роль в развитии перинатальных осложнений при ГСД после ВРТ. Выявление генетических факторов риска может помочь в ранней диагностике и профилактике этих осложнений.
Рис. 6. Межгенные взаимодействия в риске формирования перинатальных осложнений гестационного сахарного диабета.
Квадраты темно-серого цвета — генотипы повышенного риска развития перинатальных осложнений при гестационном сахарном диабете. Квадраты светло-серого цвета — генотипы пониженного риска развития перинатальных осложнений при гестационном сахарном диабете. Квадраты белые — отсутствие ассоциаций генотипов. Левые столбики — пациентки с осложнениями и гестационным сахарным диабетом; правые столбики — пациентки с гестационным сахарным диабетом без осложнений.
Заключение
Проведенный анализ ген-генных взаимодействий показал, что все типированные нами полиморфизмы в генах PPARG (Pro12Ala C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), apoB Pro2739leu G>A, VEGF-A: —634 G>C и eNOS Glu298Asp G894T G>T вносят одинаковый вклад в формирование перинатальных осложнений гестационного сахарного диабета у пациенток после применения вспомогательных репродуктивных технологий.
Оптимальным межгенным взаимодействием является двухлокусная модель TCF7L2 (IVS3 C>T) и eNOS (Glu298Asp G894T G/T), на долю комбинаций которой приходится 3,70% фенотипической энтропии, и эта модель демонстрирует выраженный синергический эффект полиморфизмов при формировании предрасположенности к развитию гестационного сахарного диабета.
Согласно результатам исследования, в патогенезе развития перинатальных осложнений гестационного сахарного диабета у пациенток после вспомогательных репродуктивных технологий имеет значение сочетание однонуклеотидных полиморфизмов генов, регулирующих энергообмен PPARG (P12A C/G), ангиогенез (VEGF-A (–634 G/C) и тонус сосудов eNOS (Glu298Asp G894T G/T). Наличие сочетания однонуклеотидных полиморфизмов указанных генов свидетельствует о высоком риске развития у пациенток перинатальных осложнений гестационного сахарного диабета на фоне вспомогательных репродуктивных технологий.
Важно, что анализ межгенных взаимодействий генов, играющих ключевую роль в регуляции основных патогенетических механизмов формирования гестационного сахарного диабета, преэклампсии, плацентарных нарушений и других перинатальных осложнений, является более перспективным, чем простой анализ частот каждого полиморфизма.
Материнские патогенетические факторы, включающие генетическую предрасположенность к гестационному сахарному диабету и молекулярно-генетические особенности регуляции углеводного и липидного обмена, эпигенетические факторы, включающие метаболический синдром и постпрандиальную гипергликемию, оказывают влияние на процессы пролиферации и дифференцировки клеток трофобласта на преимплантационном этапе. Это приводит к выполнению программы имплантации с ошибками, нарушает процессы стромального сосудистого ремоделирования маточных артерий за счет влияния на биосинтез липопротеидных мембранных комплексов и снижения доступности энергетических ресурсов для внутриклеточного окисления [19, 20].
Нарушение ремоделирования спиральных маточных артерий может приводить к ишемии плаценты и формированию нарушений маточно-плацентарного кровотока, лежащих в основе патогенеза основных плацентарных нарушений и преэклампсии на фоне гестационного сахарного диабета [21—23].
Роль экстракорпорального оплодотворения и раннего эмбриогенеза ex uteri в патогенезе формирования плацентарных нарушений на фоне гестационного сахарного диабета еще только предстоит исследовать, но с определенностью можно утверждать, что в условиях, когда естественное желтое тело не формируется, для обеспечения лютеиновой поддержки раннего эмбриогенеза и развития плаценты требуются более высокие дозы гестагенов. Это, в свою очередь, может повысить риск развития инсулинорезистентности и гестационного сахарного диабета при данной беременности [24]. Вместе с тем в яичнике в «желтом теле беременности», помимо прогестерона, продуцируется значительное количество ингибина B и фактора роста эндотелия сосудов, которые не замещаются препаратами при лютеиновой поддержке цикла, что может оказывать влияние на нарушение процессов инвазии цитотрофобласта [25, 26].
Указанные обстоятельства позволяют получить более полное представление о генетической предрасположенности к развитию гестационного сахарного диабета и формированию перинатальных осложнений после вспомогательных репродуктивных технологий, открыть новые пути для управления этими заболеваниями. Дальнейшие исследования в этой области могут открыть перспективу в разработке персонифицированных подходов к профилактике гестационного сахарного диабета на этапе подготовки к программе вспомогательных репродуктивных технологий для улучшения перинатальных исходов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Жарова Н.В.
Сбор и обработка материала — Мурзин А.В., Семенов А.Ю.
Статистическая обработка — Мурзин А.В., Жарова Н.В.
Написание текста — Мурзин А.В., Третьякова Т.Б.
Редактирование — Мелкозерова О.А., Дерябина Е.Г., Жарова Н.В.
Источник финансирования
Работа выполнена в рамках Государственного задания по научно-исследовательской работе Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.