Молекула тромбоцитарно-эндотелиальной клеточной адгезии первого типа — platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1), или CD31, представляет собой мембранный гликопротеин, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов. Эти молекулы входят в состав межклеточных контактов эндотелия, содержатся на поверхности тромбоцитов и лейкоцитов циркулирующей крови. PECAM-1 состоит из двух субъединиц — внутриклеточной и внеклеточной. Внеклеточная имеет 6 иммуноглобулиноподобных доменов (IgD1—IgD6). Домены 1 и 2 обеспечивают соединение молекул адгезии на поверхности соседних эндотелиоцитов [1—3]. Прочность этого соединения усиливается, если с доменом IgD6 связываются иммуноглобулины [4]. Внутриклеточная субъединица способна подвергаться альтернативному сплайсингу, который обусловливает различие ее структуры и функции в клетках разного происхождения [5]. Комплекс внутриклеточной субъединицы с тирозинфосфатазой способен ингибировать апоптоз эндотелиальных клеток [6]. PECAM-1 регулирует проницаемость сосудистой стенки и управляет миграцией лейкоцитов в очаг воспаления [7—9].
Экспериментальные данные [10] указывают на участие неэндотелиальных молекул адгезии в отторжении аллотрансплантатов сердца у мышей. Роль PECAM-1 в отторжении пересаженного сердца остается недостаточно изученной, а определение экспрессии CD31 не входит в протокол исследования эндомиокардиальных биоптатов при диагностике формы и степени отторжения.
Цель исследования — выявить вовлеченность молекул тромбоцитарно-эндотелиальной клеточной адгезии PECAM-1 в патогенез отторжения пересаженного сердца и определить значимость маркера CD31 для биопсийной диагностики формы и степени выраженности процесса.
Материал и методы
Пациенты после трансплантации сердца обследованы во время проведения плановых биопсий, а также при экстренной госпитализации с подозрением на отторжение трансплантата. Исследовано 257 эндомиокардиальных биоптатов, полученных от 56 реципиентов (39 мужчин и 17 женщин в возрасте от 29 лет до 61 года), которым произведена трансплантация сердца в ГБУЗ «НИИ — Краевая клиническая больница №1» Краснодара. До пересадки сердца у всех пациентов была диагностирована терминальная стадия сердечной недостаточности вследствие ишемической болезни сердца (60%), дилатационной кардиомиопатии (29%), другой кардиальной патологии (11%). Среди сопутствующих заболеваний преобладали гипертоническая болезнь (46% пациентов, из них у 80% диагностирован риск IV степени), а также сахарный диабет (35%). В исследование включены реципиенты после 1,5 мес, прошедших со дня трансплантации, из-за возможных тяжелых осложнений раннего послеоперационного периода. Из исследования исключены реципиенты с поражением коронарных артерий трансплантата, фибрилляцией сердца, выраженной гипертрофией миокарда по данным эхокардиографии.
При проведении эндомиокардиальной биопсии из миокарда правого желудочка кардиохирурги захватывали до 5 кусочков ткани и фиксировали 10% нейтральным формалином. Характер и степень тяжести отторжения пересаженного сердца определяли в соответствии с критериями Международного общества трансплантации сердца и легких ISHLT [11, 12]. Выраженность патоморфологических изменений оценивали в парафиновых срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Кроме того, иммуногистохимическим (ИГХ) стрептавидин-биотиновым методом определяли экспрессию T-лимфоцитов (CD3), B-лимфоцитов (CD20) и макрофагов (CD68) для характеристики воспалительного клеточного инфильтрата, а также C4d-компонента комплемента в качестве маркера антителоопосредованного отторжения. Дополнительно определяли экспрессию PECAM-1 (CD31).
Отсутствие отторжения трансплантата — нулевая степень (0R) установлена при анализе 92 (35,8%) биопсий (рис. 1). Легкая степень клеточного отторжения (1R) выявлена в 90 (35%) биоптатах. Картина умеренного клеточного отторжения (2R) присутствовала в 41 (16%) биоптате, тяжелого — в 17 (6,6%). Признаки антителоопосредованного отторжения (AMR) обнаружены также в 17 (6,6%) образцах.
Компьютерная морфометрия с применением программного обеспечения ImageJ («US National Institutes of Health», США) включала измерение относительной площади патологических изменений (некроз, кровоизлияния), а также зоны экспрессии ИГХ-маркера CD31 в цифровых изображениях срезов, полученных с помощью микроскопа Axio Scope A1 и камеры AxioCam ERc5s («Karl Zeiss», Германия). Определяли общую площадь среза и суммарную площадь в нем цветного продукта с вычислением коэффициента площади окрашивания (КПО) [13] по формуле: m/s.100%, где m — суммарная площадь (в мм2) цветного продукта в срезе; s — общая площадь среза (в мм2).
Рис. 1. Структура реакций отторжения трансплантированного сердца.
Статистический анализ результатов исследования выполнен с помощью компьютерной программы MedCalc Statistical Software («Ostend», Бельгия). Результаты морфометрических измерений, описанные с использованием медианы, нижнего и верхнего квартилей, представлены в виде Me [Q1; Q3]. Для определения достоверности различий применяли критерий χ2 Пирсона. Нулевую гипотезу отвергали при уровне статистической значимости p<0,05. Для оценки корреляционно-регрессионных отношений использовали критерий Спирмена.
Результаты исследования
В морфологической картине миокарда при остром клеточном отторжении трансплантата отмечалась воспалительная клеточная инфильтрация с присутствием в составе инфильтрата T-лимфоцитов (CD3+), B-лимфоцитов (CD20+) и преобладанием макрофагов (CD68+), что сопровождалось признаками повреждения кардиомиоцитов. Клеточный инфильтрат в трансплантатах с нулевой степенью отторжения отсутствовал или был представлен единичными элементами; признаки повреждения кардиомиоцитов не выявлены. Легкая степень клеточного отторжения отличалась единичными локусами повреждения мышечных клеток, связанными, как правило, с одним очагом мононуклеарного инфильтрата. Для умеренного клеточного отторжения были характерны множественные локусы эндомиокардиального повреждения в ассоциации с очагами лимфомакрофагальной инфильтрации. При тяжелом клеточном отторжении обнаружены диффузная инфильтрация лимфоцитами и макрофагами с появлением нейтрофильных лейкоцитов, а также очаги кровоизлияний. Картина антителоопосредованного отторжения (AMR) характеризовалась выраженным отеком, васкулитом и интравазальным скоплением макрофагов.
Лимфоциты и макрофаги присутствовали в воспалительном инфильтрате всех трансплантатов. В ряде случаев отмечено сочетание CD3- и CD20-позитивных клеток в одних и тех же участках миокарда; это можно считать признаком смешанного клеточно-гуморального отторжения. В мононуклеарном воспалительном инфильтрате сердечного трансплантата T-лимфоциты преобладают при всех степенях тяжести клеточного отторжения, а также при антителоопосредованной форме, которая характеризуется и наиболее выраженной экспрессией маркеров B-лимфоцитов. Максимальное присутствие макрофагов в воспалительном инфильтрате миокарда указывает на тяжелое клеточное отторжение.
Компонент комплемента C4d имеет диффузную экспрессию в очагах воспаления, располагаясь внеклеточно преимущественно под эндокардом и эндотелием сосудов. Выраженность экспрессии умеренно возрастала по мере увеличения тяжести клеточного отторжения, однако при антителоопосредованной форме была существенно выше. При этом депозиты C4d имели диффузный характер и располагались не только периваскулярно, но и между кардиомиоцитами.
Некротические изменения не выявлены в трансплантатах без отторжения и характеризовались минимальной выраженностью в биоптатах реципиентов с легкой степенью клеточного отторжения, при этом морфометрические показатели (КПО) не имели статистически значимых различий (p>0,05). В остальных случаях участки некроза, различные по площади, располагались диффузно почти во всех полях зрения (рис. 2, а).
Рис. 2. Изменения в миокарде пересаженного сердца.
а — некроз; б — кровоизлияние в зоне некроза; в — экспрессия CD31.
а, б — окраска гематоксилином и эозином; в — ИГХ-реакция; а—в — ×40.
По данным компьютерной морфометрии (см. таблицу; рис. 3) суммарная площадь некротических очагов в микропрепаратах возрастала при степени 2R в 163,7 раза, а при 3R в 570,7 раза по сравнению с легкой степенью клеточного отторжения (p<0,05). При антителоопосредованном отторжении участки некроза кардиомиоцитов совпадали с периваскулярным отеком миокарда, а их выраженность была в 2,3 раза меньше таковой при тяжелом клеточном отторжении.
Компьютерная морфометрия изменений в миокарде сердечного трансплантата при отторжении
| Показатель | КПО (Me [Q1; Q3]), % | ||||
| 0R (n=92) | 1R (n=90) | 2R (n=41) | 3R (n=17) | AMR (n=17) | |
| Некроз | 0 | 0,03 [0,01; 0,06] | 4,91* [4,53; 5,35] | 17,12* [16,81; 17,19] | 7,37* [7,09; 7,49] |
| Кровоизлияния | 0,80 [0,71; 0,90] | 1,92* [1,81; 2,10] | 9,93* [9,90; 10,00] | 14,01* [13,92; 14,16] | 3,22* [3,10; 3,34] |
| PECAM-1 (CD31) | 3,51 [3,40; 3,62] | 2,72* [2,70; 2,75] | 2,02* [1,90; 2,15] | 1,41* [1,33; 1,56] | 0,81* [0,65; 0,92] |
Примечание. *— достоверное различие от предшествующей группы; p<0,05.
Рис. 3. Выраженность некроза в миокарде сердечного трансплантата.
Кровоизлияния из мелких сосудов миокарда (рис. 2, б) отмечены главным образом у реципиентов с умеренной и тяжелой степенью клеточного отторжения. В то же время незначительно выражены они и при нулевой степени — менее 1% площади биоптата, что, по-видимому, обусловлено механическим повреждением ткани в ходе проведения биопсии. Однако показатель КПО кровоизлияний (см. таблицу; рис. 4) закономерно возрастает в биоптатах со степенью 1R в 2,4 раза (p<0,05), при степени 2R в 12,4 раза (p<0,05), а при 3R в 17,5 раза (p<0,05). Выраженность кровоизлияний у пациентов с антителоопосредованным отторжением в 4,4 раза меньше по сравнению с тяжелой степенью клеточного отторжения (p<0,05).
Рис. 4. Выраженность кровоизлияний в миокарде сердечного трансплантата.
Экспрессия CD31 (рис. 2, в) определяется в эндотелии сосудов, значительно меньше — в строме миокарда, на поверхности макрофагов и лимфоцитов. Компьютерная морфометрия (см. таблицу; рис. 5) выявила снижение выраженности экспрессии PECAM-1 по мере возрастания интенсивности отторжения трансплантата. В биоптатах пациентов без отторжения занимаемая CD31-позитивными клетками площадь среза составляет 3,51 [3,40; 3,62]%. При легкой степени клеточного отторжения этот показатель уменьшается в 1,3 раза (p<0,05), при умеренном отторжении — в 1,7 раза (p<0,05), а при тяжелом — в 2,5 раза (p<0,05). Гуморальное отторжение (AMR) сопровождается снижением показателя в 4,3 раза (p<0,05) и минимальным его значением 0,81 [0,65; 0,92]% площади биоптата.
Рис. 5. Экспрессия CD31 в миокарде сердечного трансплантата.
Таким образом, наиболее высокие показатели экспрессии PECAM-1 (CD31) обнаружены при отсутствии реакции отторжения сердечного трансплантата (степень 0R). Однако уже при легкой степени клеточного отторжения (1R) экспрессия снижается в 1,3 раза при отсутствии в миокарде сколько-нибудь существенных признаков некроза. Эти признаки тем не менее резко нарастают при степени 2R в 163,7 раза, а при 3R в 570,7 раза по сравнению со степенью 1R. Процесс протекает параллельно с дальнейшим снижением уровня экспрессии CD31 (при степени 3R — в 2,5 раза, а при AMR — в 4,3 раза).
Статистический корреляционно-регрессионный анализ выявил сильную обратную связь между экспрессией CD31 и выраженностью некроза в биоптатах (r= –0,7169, коэффициент детерминации 0,5139; p=0,033). Корреляционное отношение для пары CD31/некроз составило η=0,82, а для пары некроз/CD31 — η=0,14. Следовательно, именно снижение экспрессии CD31 приводит к увеличению выраженности некротических изменений, а не наоборот. Коэффициент детерминации η2=67,24% указывает на то, что 67,24% от общего вклада факторов, вызывающих некроз в сердечной мышце, приходится на снижение экспрессии CD31. Коэффициент эластичности составил 3,1%, т.е. снижение экспрессии CD31 на 1% приводит к нарастанию интенсивности некроза на 3,1% (p=0,033).
Указанные изменения могут свидетельствовать о развитии эндотелиальной дисфункции в сосудистом русле трансплантата, которая возрастает с увеличением тяжести отторжения и сопровождается кровоизлияниями. Их интенсивность увеличивается при тяжелом клеточном отторжении по сравнению с легкой степенью в 7,3 раза, а при гуморальном отторжении — в 1,7 раза. Между экспрессией PECAM-1 и выраженностью кровоизлияний существует слабая обратная связь (r= –0,4979), которая статистически незначима (p=0,143).
Обсуждение
Локализация CD31-позитивных клеток зарегистрирована главным образом в стенках кровеносных сосудов миокарда. Это соответствует существующему представлению о природе PECAM-1, который является одним из главных компонентов межклеточных контактов в эндотелии [1]. Наиболее высокие показатели экспрессии PECAM-1 обнаружены в биоптатах пациентов, у которых отсутствует сколько-нибудь выраженная реакция отторжения трансплантата. Уменьшение экспрессии CD31 отмечается уже на ранней стадии клеточного отторжения, до развития патоморфологических признаков васкулита, что, по-видимому, указывает на дисфункцию эндотелия кровеносных сосудов сердечной мышцы. Участие молекул PECAM-1 в патогенезе отторжения трансплантата можно связать с их способностью обеспечивать взаимодействие эндотелия с лейкоцитами крови и регулировать траффик этих клеток в очаг воспаления [14]. Нарастание процесса клеточного отторжения сопровождается существенным уменьшением площади CD31-позитивной зоны в сердечной мышце и увеличением выраженности в ней некротических изменений. Наименьшее значение экспрессия CD31 имеет при антителоопосредованном отторжении, что объясняется характерным для этого процесса обширным повреждением капилляров.
Активация PECAM-1 ингибирует апоптоз эндотелия, инициируемый как внутренними, так и наружными путями [15]. Повышение выживаемости эндотелиальных клеток имеет критическое значение для функционирования микроциркуляторного русла в условиях гипоксии или воспаления [16]. Развитие эндотелиальной дисфункции со снижением экспрессии CD31 под действием повреждающих факторов в процессе отторжения, по-видимому, вызывает апоптоз эндотелиальных клеток. Угнетение функции PECAM-1 способствует ишемическому повреждению органа [17]. Для пересаженного сердца это может означать развитие болезни коронарных сосудов трансплантата, которая представляет серьезную угрозу его функционированию.
Другим отражением дисфункции эндотелия и повреждения стенки кровеносных сосудов миокарда служат кровоизлияния, интенсивность которых по мере нарастания тяжести клеточного отторжения усиливается наряду со снижением экспрессии CD31. Незначительную выраженность кровоизлияний при антителоопосредованном отторжении можно объяснить хроническим характером повреждения сосудов с преобладанием периваскулярного фиброза миокарда.
Заключение
Отсутствие реакции отторжения трансплантата пересаженного сердца характеризуется максимальным уровнем экспрессии PECAM-1. Наиболее ранний патоморфологический признак отторжения — снижение экспрессии маркера CD31, которое предшествует появлению признаков некроза кардиомиоцитов. Экспрессия CD31 продолжает снижаться с нарастанием тяжести отторжения и сопровождается прогрессирующим развитием кровоизлияний в сердечной мышце трансплантата.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.А. Славинский, А.А. Веревкин
Сбор и обработка материала — А.А. Веревкин
Статистическая обработка данных — А.А. Славинский, А.А. Веревкин
Написание текста — А.А. Славинский, А.А. Веревкин
Редактирование — А.А. Славинский
Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 19-415-230003 и администрации Краснодарского края №47-08-10-10.1.