Введение

Трансплантация сердца (ТС) — радикальный высокотехнологичный метод лечения терминальной стадии сердечной недостаточности, количество выполнения которого растет с каждым годом, как в Российской Федерации, так и в мире в целом [6]. По данным Международного общества по трансплантации сердца и легких (ISHLT), ежегодно в мире выполняется около 6000 ТС [7]. Выживаемость пациентов, с учетом научных достижений в вопросах пересадки сердца, на сегодняшний день составляет 14 лет [8]. Одной из ведущих причин в структуре смертности пациентов, перенесших ТС, является отторжение трансплантированного органа, что обуславливает необходимость грамотной пожизненной поддерживающей иммуносупрессивной терапии [9]. С этой целью используется комбинация глюкокортикостероидов, ингибиторов кальциневрина (циклоспорин или такролимус), и препаратов микофенолата мофетила или микофенолата натрия [10]. Хорошо известно, что ингибиторы кальциневрина, являясь важным звеном схемы иммуносупрессивной терапии, обладают серьезными побочными эффектами, ограничивающими продолжительность жизни пациентов после ТС и снижающими качество жизни, а именно нефротоксическим действием, способствующим развитию хронической почечная недостаточности [11]. Важным фактом также является то, что иммуносупрессивная терапия повышает риски возникновения злокачественных новообразований, выступающими наряду с отторжением трансплантата, одной из ведущих причин смерти в данной группе пациентов [12]. Новым этапом в развитии иммуносупрессивной терапии у пациентов после ТС стало использование ингибиторов пролиферативного сигнала, а именно эверолимуса. Препарат использовался первоначально для лечения злокачественных опухолей, а также как иммуносупрессант у пациентов после пересадки почек и печени. Сравнительно недавно препарат начал использоваться и в трансплантационной кардиологии.

Эверолимус — препарат с выраженным иммуносупрессивным эффектом, не уступающим по эффективности другим ранее используемым иммуносупрессантам у пациентов после ТС. Кроме сопоставимой эффективности, эверолимус продемонстрировал ряд преимуществ, среди которых отсутствие нефротоксического действия, значительно лучший прогноз по развитию болезни коронарных артерий пересаженного сердца и цитомегаловирусной инфекции, противоопухолевая активность препарата [11].

Понимание физико-химических свойств эверолимуса крайне важно, так как именно эти свойства определяют параметры хроматографического анализа и выбор настроек масс-спектрометра [16].

Эверолимус — макролидный иммуносупрессант с молекулярной массой 957,6 Da (С53H83NO14). Структурная формула представлена на рис. 1.

Рис. 1. Эверолимус (структурная формула).

Вещество растворимо в спирте и органических растворителях, практически нерастворимо в воде. Триеновая группа эверолимуса обусловливает максимальное поглощение ультрафиолета при 276 нм. Препарат чувствителен к свету. Стоковый раствор эверолимуса стабилен 6 мес при температуре –80 °C. В холодильнике (+4 °C) стоковые растворы эверолимуса теряют около 14% своей концентрации в течение 14 дней. В пробах цельной крови эверолимус выдерживает 3 цикла замораживание/размораживание. Пробы крови с препаратом при температуре (–80 °C) стабильны до 8 мес [8].

Эверолимус доступен только в таблетированной форме для перорального приема и характеризуется относительно низкой и вариабельной биодоступностью (16%) и быстрой всасываемостью (через 30 мин после приема). Препарат метаболизируется при помощи P450(CYP)3A4, P450(CYP)3A5, P450(CYP)2С8 в печени и P-гликопротеина в тонком кишечнике. Полный метаболический профиль эверолимуса, описанный в литературе, включает в себя 11 метаболитов, которые определяются в крови через 1,2—2,0 ч после введения и не имеют существенной иммуносупрессивной активности (A.I. Sanchez-Fructuoso и соавт., 2008). Равновесная концентрация препарата в крови достигается через 5—7 дней после изменения дозировки. Экскреция эверолимуса осуществляется с желчью в форме метаболитов (98%) и с мочой (2%), периодом полураспада — 18—35 ч [8, 9].

Препарат характеризуется узким терапевтическим интервалом (3—8 нг/мл для пациентов, перенесших пересадку сердца) и выраженной межиндивидуальной вариабельностью фармакокинетики, что создает предпосылки для побочных эффектов терапии (инфекционные осложнения; метаболические нарушения: гипергликемия, нарушение липидного обмена; гематологические осложнения: анемия, лейкопения, тромбоцитопения; стоматит; осложнения заживления ран) и недостаточной эффективности с повышением рисков отторжения трансплантата. Для проведения успешной терапии эверолимусом рекомендовано проведение терапевтического лекарственного мониторинга в процессе лечения с индивидуальным подбором дозы препарата [10].

На сегодняшний день в клинико-диагностических лабораториях существует два основных подхода к выполнению мониторинга концентраций эверолимуса: иммунохимический метод и высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-селективным детектированием [11].

Иммунохимический метод количественного определения веществ, основанный на образовании и регистрации комплекса антител с определяемым антигеном (аналитом), нашел широкое применение в лабораторной практике трансплантологических центров. Метод характеризуется возможностью быстрого выполнения исследования и удовлетворительной точностью. Метод реализуется на рутинном иммунохимическом оборудовании, широко используемом в лабораториях для различных исследований, не требует особой подготовки специалистов и доступен для выполнения среднему медицинскому персоналу. На ряду с вышеперечисленными достоинствами иммунохимический метод обладает значительным недостатком — перекрестной реактивностью метаболитов, которая приводит к смещению результатов и демонстрации более высоких концентраций, что в свою очередь влияет на принятие клинического решения в отношении корректировки дозы [9, 13, 14].

Высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) является аналитическим методом, основанном на разделении анализируемой смеси на хроматографической колонке и детекции конкретной уникальной пары матричного и дочернего ионов аналита (эверолимуса). Принцип метода обусловливает высокую точность, чувствительность, специфичность, воспроизводимость, а также исключает главный недостаток иммунохимического метода — перекрестную реактивность метаболитов. В научных исследованиях неоднократно упоминается несопоставимость результатов ВЭЖХ-МС/МС и иммунохимического метода со смещением результатов в большую сторону для последнего, что влияет на принятие клинического решения по корректировке дозы препарата [13, 14].

Однако, несмотря на аналитическую привлекательность, внедрение метода терапевтического лекарственного мониторинга с помощью ВЭЖХ-МС/МС сопряжено с определенными трудностями: необходимость разработки протокола исследования и его валидации в конкретной лаборатории на определенном виде оборудования в соответствии с требованиями к валидации биоаналитических методик, регламентированными как в общемировой практике, так и в ЕАЭС в частности, так как полный перенос протоколов исследования между клинико-диагностическими базами не возможен [15, 16], дополнительное обучение персонала, высокая стоимость оборудования.

Таким образом, проблема выбора метода терапевтического лекарственного мониторинга эверолимуса окончательно не решена, а с клинической точки зрения являются критичной.

Цель исследования — оптимизировать аналитическую методику количественного определения эверолимуса в цельной крови пациентов после трансплантации сердца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием, удовлетворяющую требованиям, предъявляемым к методикам для проведения терапевтического лекарственного мониторинга.

Материал и методы

Для подбора оптимальных аналитических условий и приготовления градуировочных растворов использовали аналитический стандарт эверолимуса чистотой более 98,5% эверолимуса (Fluka, 07741).

В качестве внутреннего стандарта выбран изотопно-меченный аналог эверолимуса — эверолимус-d4 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21845). Дейтерированный внутренний стандарт вносится в пробу в заданном количестве на самом первом этапе пробоподготовки непосредственно в аликвоту цельной крови, что позволяет исключить влияние пробоподготовки. Тщательно перемешивается и выдерживается 10 мин. В ходе предварительных экспериментов установлено, что увеличение времени экспозиции образцов с внутренним стандартом не приводило к изменению результатов.

Методика количественного определения эверолимуса в цельной крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием была разработана для лабораторно-инструментального комплекса, включающего высокоэффективный жидкостный хроматограф «LC 1260 Infinity» (Agilent, США) с масс-спектрометрическим детектором «TripleQuard 6460» с системой ионизации «Agilen Jet Stream-электроспрей» (AJS ESI). Данная модель позволяет работать при давлении в хроматографической системе до 600 бар, имеет автоматический пробоотборник на 100 образцов с термостатом, позволяющим обеспечить необходимую стабильность проб.

В качестве базисной методики была взята методика, разработанная в ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России на аналогичном оборудований, созданная согласно техническому заданию, составленному совместно с ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России для лабораторного комплекса «высокоэффективный жидкостный хроматограф «LC 1200 Infinity» (Agilent, США) с масс-спектрометрическим детектором «TripleQuard 6440» с системой ионизации «ESI», отличающегося источником ионизации масс-спектрометра. Источник ионизации «Agilent Jet Stream — электроспрей» обладает технологией термической фокусировки, что позволяет пятикратно увеличить чувствительность.

Для хроматографического разделения была выбрана обращено-фазовая хроматографическая колонка Poroshell 120 EC-C18 50´3,0 мм, 2,7 мкм. Для сокращения времени анализа был выбран изократический режим элюирования со скоростью потока 0,4 мл/мин и составом подвижной фазы: A — 100 мМ раствор формиата аммония в воде, содержащей 0,1% муравьиной кислоты (5%); B — 100 мМ раствор формиата аммония в метаноле, содержащем 0,1% муравьиной кислоты (95%). Оптимальный объем ввода пробы составил 5 мкл, температура аналитической колонки колонки — 60 °C. Время удерживания эверолимуса при заданных параметрах составило 0,848 (+/–0,001) мин, а время анализа — 1,5 мин.

Качественные масс-хроматограммы были получены при работе ионного источника в режиме регистрации положительных ионов, при температуре газа — 325 °C, скорости потока газа — 9 л/мин, давлении на небулайзере — 20 psi. Был выбран режим сканирования масс-детектора — мониторинг реакций заданных ионов, при этом для эверолимуса прекурсор-ионом выступил 975,6 ион, для внутреннего стандарта — 979,6. В качестве иона фрагмента для эверолимуса регистрировался 908,5 ион, для внутреннего стандарта — 912,5. Регистрация ионов осуществлялась при напряжении на фрагменторе и энергии в ячейке соударения для эверолимуса и внутреннего стандарта — 185/170 и 15/12 соответственно.

Пробоподготовка цельной крови включала следующие этапы: к 100 мкл крови добавляли 200 мкл осаждающего раствора (1% сульфат цинка в 80% метаноле), перемешивали 10 мин с помощью шейкера со скоростью 2400 об/мин, центрифугировали 10 мин со скоростью 6000 об/мин при 4 °C, отбирали 100 мкл супернатанта, к которому добавляли 100 мкл метанола, перемешивали 0,5 мин на шейкере со скоростью 2400 об/мин, после чего центрифугировали 10 мин со скоростью 6000 об/мин при 4 °C и отбирали 120 мкл супернатанта в хроматографическую виалу для анализа. По сравнению с базисной методикой, образцы не требовали дополнительного концентрирования, что позволило опустить этап жидкостно-жидкостной экстракции и значительно сократить время анализа [7]. Важно отметить, что так как эверолимус на 74% связывается с белками плазмы крови, а также неравномерно распределяется между эритроцитами и плазмой, процесс пробоподготовки включил в себя и гемолиз, и денатурация белков. Учитывая, что варибаельность гематокрита значительная у разных пациентов, что может повлиять на результат исследования, то осадительный агент был взят с избытком, чтобы гемолиз эритроцитов и денатурация белков прошли полностью.

Калибровочные и контрольные образцы в диапазоне концентраций от 1 до 20 нг/мл были приготовлены на основе цельной крови здоровых доноров путем добавления эверолимуса в заданных концентрациях. Во все калибровочные растворы вносился рабочий раствор внутреннего стандарта в заданной концентрации. Растворы готовили непосредственно перед проведением измерений. Далее все калибровочные и контрольные образцы подвергались предварительной подготовке проб, описанной выше.

Обработка данных проводилась с использованием программ качественного и количественного анализа Mass Hunter B 07.00 (Agilent Technologies, США).

Тестирование аналитической методики на пригодность к использованию в клинической практике проводили согласно международным требованиям к валидации биоаналитических методик [15—17].

Для апробации методики использовали образцы цельной крови 16 пациентов после трансплантации сердца (средний срок после трансплантации — 4,5 года) в возрасте от 25 до 67 лет (средний возраст больных — 55,5 года), принимающих эверолимус ежедневно 2 раза в сутки в дозе от 1,25 мг/сут до 5,4 мг/сут (средняя суточная доза эверолимуса — 2,5 мг/сут). Забор крови осуществлялся перед приемом следующей дозы в вакуумные пробирки с ЭДТА для предотвращения свертывания крови, так как препарат в крови распределяется преимущественно в форменных элементах, а не в плазме. Исследование проводилось сразу после забора образцов крови.

Результаты и обсуждение

Контроль пригодности условий хроматографического разделения проводился путем расчета числа теоретических тарелок (ЧТТ) и оценки асимметрии пика. ЧТТ составило (4100+/–500), коэффициент асимметрии пика — (1.66+/–0,14), что соответствует предъявляемым требованиям к биоаналитическим методикам (более 2000 и не больше 2,0 соответственно).

Аналитическая чувствительность методики составила 1 нг/мл, что удовлетворяет клиническим требованиям. Эверолимус в данной концентрации регистрируется в виде симметричного пика с отношением сигнал/шум — 10/1. Данный показатель отвечает требованиям, предъявляемым к качеству хроматограммы на уровне нижнего предела количественного обнаружения.

Селективность методики оценивали путем сопоставления данных масс-хроматограммы эверолимуса на нижней границе количественного определения с масс-хроматограммой интактной донорской крови, не содержащей эверолимус (рис. 2). Селективность методики признана приемлемой, так как на хроматограмме интактной крови отсутствовали пики при заданных параметрах сканирования ионов с отношением сигнал: шум, превышающим 3:1. Было подтверждено отсутствие потенциально мешающих веществ в матрице, поскольку площади пиков данных веществ не превышали 20% от значения площади пика стандартного образца, соответствующего нижнему пределу количественного обнаружения.

Рис. 2. Масс-хроматограммы при контроле селективности методики.

Линия 1 — интактная кровь, линия 2 — интактная кровь с добавлением стандартного образца эверолимуса в концентрации, соответствующей нижнему пределу количественного обнаружения (аналитическая чувствительность).

Калибровочная кривая была построена на 9 калибровочных стандартных образцах (рис. 3), при минимально необходимых 6. Коэффициент детерминации составил (R²) — 0,999. Результаты измерения калибровочных образцов отображены в табл. 1.

Рис. 3. Калибровочная зависимость для эверолимуса в диапазоне концентраций от 1 до 20 нг/мл.

Таблица 1. Результаты измерения калибровочных образцов

Данные тестирования методики продемонстрировали линейность калибровочной зависимости в диапазоне концентраций от 1 до 20 нг/мл. Полученная линейность удовлетворяет клиническим требованиям, так как терапевтическая широта составляет от 3 до 8 нг/мл.

Контроль воспроизводимости методики проводили путем анализа цельной донорской крови, содержащей разные массовые концентрации эверолимуса. Результаты контроля воспроизводимости признаны приемлемыми, так как полученные значения концентраций контрольных образцов не превышают 15% от теоретической величины концентрации, а значения контрольных образцов, соответствующих нижнему пределу количественного обнаружения, не превышают 20% (табл. 2).

Таблица 2. Оценка воспроизводимости измерения концентрации эверолимуса в контрольных образцах

Путем расчета коэффициента вариации результатов пятикратного измерения контрольных образцов на пяти уровнях концентраций (1 нг/мл, 2 нг/мл, 5 нг/мл, 7,5 нг/мл, 20 нг/мл) оценивали прецизионность методики (табл. 3). Контроль прецизионности методики признан удовлетворительным, так как коэффициент вариации каждого образца контроля качества не превышал 15%, что соответствует нормативам (коэффициент вариации концентраций каждого образца контроля качества не должен превышать 15% за исключением значений нижнего предела количественного определения, где он не должен превышать 20%).

Таблица 3. Прецизионность измерения эверолимуса в контрольных образцах в течение дня

Следующий этап оценки пригодности методики заключался в межлабораторном сличении проб пациентов, принимающих эверолимус с использованием оптимизированной и валидированной методики количественного обнаружения эверолимуса методом ВЭЖХ-МС/МС в лаборатории токсикологии и лекар ственного мониторинга ФГБУ «ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова» МЧС России, которое было выполнено на 20 образцах крови пациентов обследованной группы. Расхождение результатов исследований, полученных двумя лабораториями, не превышало 14% на всех уровнях концентраций, что отвечает требования межлабораторного контроля качества для данного метода.

Методика успешно внедрена в клиническую и лабораторную практику ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России и применена на 348 образцах цельной крови пациентов, принимающих эверолимус в составе комбинированной иммуносупрессивной терапии после трансплантации сердца, с удовлетворительным клиническим эффектом. Методика продемонстрировала хорошие результаты внешней оценки качества на основании межлабораторных сличений.

Выводы

Оптимизированная и внедренная в клиническую практику методика количественного определения эверолимуса в цельной крови пациентов после трансплантации сердца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием отвечает международным требованиям к валидации биоаналитических методик, демонстрируя высокую чувствительность, специфичность, воспроизводимость и точность.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.