Мигренозную головную боль испытывают более 1 млрд человек во всем мире [1]. Это заболевание оказывает крайне негативное влияние на качество жизни, приводит к инвалидизации людей молодого трудоспособного возраста и ведет к большим социально-экономическим и финансовым потерям [2]. Несмотря на большое распространение и социально-экономическое влияние, значение мигрени часто недооценивается, до сих пор имеются диагностические трудности, пациенты получают недостаточное и неадекватное лечение как в России, так и в других странах [3, 4]. Это свидетельствует о нехватке знаний о клинической и патогенетической картине болезни [5]. Поэтому ведутся обширные исследования по выявлению биологических и генетических маркеров, которые помогут в диагностике и лечении мигрени [6].

Одним из перспективных направлений поиска биомаркеров для мигрени на сегодняшний день считается изучение микробиома человека, в частности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Известно о высокой коморбидности мигрени с инфекционно-воспалительными процессами в ЖКТ [7, 8] и носоглотке [9, 10]. Очевидно, что инфекционные заболевания изменяют микробиом полости рта, это, возможно, имеет значение в патогенезе мигрени [11]. Предполагается, что дисбиоз негативно влияет на взаимодействие по оси «кишечник—мозг» и приводит к хроническому нейровоспалению. В предыдущей работе [12] мы показали практически 100% коморбидность мигрени с хроническими заболеваниями ЖКТ и верхних дыхательных путей (ВДП) и характерные для большинства пациентов изменения микробиоты ротоглотки (снижение содержания нормальной флоры и повышение патогенной и условно-патогенной, свойственной для хронических заболеваний ВДП и ЖКТ). Выявленные изменения позволили выдвинуть гипотезу о сложных многоуровневых взаимоотношениях мигрени с заболеваниями ЖКТ и ВДП путем нарушения микробиотического состава.

Большинство работ посвящено исследованию роли кишечной микробиоты в этиологии и патогенезе мигрени [13—16]. Анализ слюны может стать полезным дополнением к микробиологическому анализу кишечника (двенадцатиперстной кишки и кала). Ежедневно мы проглатываем примерно 1 л слюны, которая содержит большое разнообразие видов микроорганизмов [17], заметно отличающихся от сообществ в кишечнике [18, 19], которые могут вносить свой отдельный вклад в развитие болезни.

Недавно китайские ученые [20] сравнили микробиоты полости рта пациентов с мигренью и здоровых субъектов с помощью секвенирования гена 16S рРНК и обнаружили значительные различия в их составе. Они предположили потенциальную связь между микробиотой полости рта и патогенезом мигрени через влияние на мозг посредством воспалительных и метаболических изменений. Слюна достаточно давно изучается на предмет наличия биомаркеров мигрени, оценивались содержание CGRP (кальцитонин-ген-связанный пептид) [21], уровни С-реактивного белка, интерлейкина-1β и -6 [22] и других нейропептидов и медиаторов воспаления [23], связанных с тригемино-ноцицептивной системой, которые могут быть использованы для изучения нейрональных механизмов мигрени [24], однако состав слюны с точки зрения микробных биомаркеров практически не изучен. В этом плане может быть полезным неинвазивное и простое исследование слюны методом масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) [25, 26] которое широко применяется в России [27—29] и за рубежом [30]. Для исследования биомаркеров мигрени в слюне МСММ использован нами впервые в этой работе.

Цель исследования — выявление изменений микробиома слюны и сравнительная оценка с микробиомом ротоглотки пациентов с мигренью.

Материал и методы

В исследование включены 60 пациентов с мигренью: 9 мужчин и 51 женщина в возрасте от 21 года до 56 лет (средний — 39,2±8,6 года). Набор пациентов осуществлялся в «Клинико-диагностическом центре МЕДСИ на Красной Пресне», Москва.

Критерии включения: 18—65 лет на момент включения, мигрень с или без ауры (МКГБ-3) [31], наличие информированного согласия, способность и готовность выполнять процедуры исследования на всем его протяжении.

Критерии невключения: любые другие головные боли, органическая патология головного мозга, острые или обострения хронических заболеваний ЖКТ и/или ВДП, заболевания зубов, полости рта, травмы и операции головы и шеи в анамнезе, беременность и лактация, системные заболевания соединительной ткани, онкологические, психические или другие заболевания, которые, по мнению исследователя, могли помешать исследованию.

Длительность мигрени составила 15—25 лет. В анамнезе у всех пациентов использование комбинированной терапии нестероидными противовоспалительными препаратами и триптанами без достаточной эффективности, профилактической терапии не получали. Согласно анамнестическим данным и осмотру специалистов, у всех пациентов имелись коморбидные хронические заболевания ЖКТ и ВДП вне обострения. Все исследования пациентов проводились в межприступный период.

Клинико-неврологическое обследование включало анализ жалоб и анамнестических данных; дневник головной боли [32] с оценкой частоты, интенсивности головной боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) от 0 до 10 баллов, частоты использования анальгетиков; стандартный неврологический осмотр. Оценка влияния мигрени на повседневную активность и трудоспособность (за последние 3 мес) проводилась с помощью шкалы оценки мигрени (MIDAS-Migraine Disability Assessment) [4]. Все пациенты были консультированы гастроэнтерологом и отоларингологом.

Микробиологическое обследование слюны и мазка с задней стенки ротоглотки с анализом качественного и количественного состава микробиоты (57 микроорганизмов, включая грибы и вирусы) проводилось по методу МСММ, разработанному проф. Г.А. Осиповым и соавт. [33—35]. Метод основан на определении уровней биохимических маркеров (молекул высших жирных кислот, альдегидов, спиртов), обладающих индивидуальной специфичностью для каждого микроорганизма с последующим пересчетом на количество микробных клеток на 1 г биоматериала (10⁵ кл./г образца). Проводилось сравнение показателя пациента с нормативными значениями (повышение значения более чем в 2 раза считается значимым отклонением от нормы). Метод имеет разрешение для диагностического использования с 2010 г. (разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/038 от 24 февраля 2010 г. выдано Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).

Исследование было одобрено локальным независимым Этическим комитетом при образовательном частном учреждении дополнительного профессионального образования «Институт междисциплинарной медицины», протокол №68 от 11.01.22.

Статистическая обработка проводилась в программной среде R (2022) [36]. Для анализа корреляции между показателями использовали расчет критерия Спирмена в пакете pspearman [37]. При сравнении микробиоты слюны и ротоглотки использовали парные варианты статистических тестов. Межгрупповые различия оценивались с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и Уилкоксона в связи с тем, что для большинства показателей характер распределения значений в выборках существенно отличался от нормального распределения. При достижении значения показателя p<0,05 результаты тестов считались статистически значимыми, а различия между группами — достоверными. Графический анализ проводили с использованием функций пакета ggplot2 [38].

Результаты

При анализе дневников головной боли пациентов было получено, что в среднем количество дней мигрени составило 9,35±5,9 в месяц, эпизодическая мигрень (<15 дней в месяц) отмечалась у 45 человек, хроническая (≥15 дней в месяц) — у 15. Количество приемов препаратов, купирующих головную боль, было 10,73 в месяц. Средняя интенсивность боли по шкале ВАШ в общей группе пациентов составила 9,22±1,28 балла, при этом у 54 человек наблюдалась сильная боль (от 7 до 10 баллов), у 6 — умеренная (от 4 до 6 баллов). По шкале MIDAS: сильная боль (значительное снижение повседневной активности) — у 47 (78,3%) человек, сильная боль (выраженное ограничение повседневной активности) — у 8 (13,3%), умеренная/выраженная боль (незначительное снижение повседневной активности) — у 3 (5%), слабая боль (отсутствие/минимальное снижение повседневной активности) — у 2 (3,3%).

У всех больных с мигренью в слюне выявлены маркеры транзиторных, в норме отсутствующих микроорганизмов и резидентных условно-патогенных микроорганизмов (приведен процент пациентов с более чем двукратным отклонением содержания микроорганизмов от нормы):

а) повышение содержания маркеров резидентных (условно-патогенных) микроорганизмов — кокков, свойственных для хронических заболеваний носоглотки: Enterococcus spp. — у 85% пациентов, Staphylococcus aureus — у 77% и Staphylococcus epidermidis — у 27%, Streptococcus spp. — у 40%;

б) появление маркеров транзиторных микроорганизмов, в норме отсутствующих, характерных для кишечной микрофлоры: анаэробных Blautia coccoides — у 85% пациентов, Fusobacterium spp./Haemophilus spp. — у 62%, Peptostreptococcus anaerobius 18623 — у 55%, Bacteroides fragilis — у 48%; анаэробных пропионобактерий Propionibacterium acnes — у 40%, Propionibacterium freudenreichii — у 38%, Propionibacterium jensenii — у 30%; анаэробных клостридий — Cl. difficile — у 35%, Cl. hystolyticum/Str. Pneumonia — у 32%, Cl. perfringens — у 15%, Cl. propionicum — у 38%, Cl. ramosum — у 45%; грамотрицательных палочек — Kingella spp. у 37% и Porphyromonas spp. — у 47%;

в) появление вирусных маркеров: группы герпеса — у 30% пациентов, цитомегаловируса — у 27%, вируса Эпштейна—Барр — у 8%;

д) понижение содержания грибов Aspergillus spp.

Снижения содержания нормальной флоры у большинства пациентов не отмечалось: Bifidobacterium spp. — Me=277,5 [4; 920] (среднее по группе — 328,5±258,8) при норме 225 кл.×10⁵ и Lactobacillus spp. — Me=1040 [13; 2901] (среднее по группе 1188,92±859,16) при норме 659 кл.×10⁵.

Проведенный нами корреляционный анализ зависмости тяжести и частоты головных болей по шкалам MIDAS, ВАШ и дневнику головной боли от состава микробиоты слюны лиц с мигренью не выявил достоверных взаимосвязей.

Сравнительный анализ микробиома (табл. 1, 2) показал значимое снижение в слюне по сравнению с ротоглоткой концентрации: кокковой флоры Enterococcus spp., Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, анаэробных бактерий Clostridium difficile и Clostridium perfringens; энтеробактерии Helicobacter pylori; грамотрицательных палочек Kingella spp., грибов и вируса Эпштейна—Барр. В слюне была значительно повышена в сравнении с ротоглоткой концентрация: Staphylococcus epidermidis, анаэробных Clostridium ramosum и Fusobacterium spp./Haemophilus spp. и грамотрицательных палочек Porphyromonas spp. Не обнаружено значимых различий в концентрации нормальной флоры, вирусов группы герпеса и цитомегаловирусов. Таким образом, в целом значимых изменений микробиома в слюне оказалось меньше, чем в ротоглотке.

Таблица 1. Сравнение концентраций патогенов в слюне и зеве пациентов с мигренью (n=60)

Таблица 2. Сравнение концентраций патогенов в слюне и зеве пациентов с мигренью (пациенты с двукратным отклонением от нормы, %)

Обсуждение

В данной работе у пациентов с мигренью проведена сравнительная оценка микробиоты слюны и мазка из ротоглотки с целью определения более информативного биотопа. Каждый из этих анализов полезен по-своему. Мазок из ротоглотки характеризует «входные ворота инфекции» и показывает наличие у пациентов с мигренью хронического очага воспаления в ВДП — фарингита и/или тонзиллита. В предыдущей работе [12] мы продемонстрировали характерные для пациентов с мигренью нарушения микробиоты ротоглотки (снижение содержания нормальной флоры, повышение уровня ряда условно-патогенной микрофлоры и появление патогенных микроорганизмов), что клинически сочеталось с наличием у всех пациентов хронических заболеваний ВДП. Слюна отражает состояние не только микробиоценоза ротоглотки и полости рта, но и внутренней среды организмы (поскольку на 50% состоит из сыворотки крови), и увеличение в ней других микробных маркеров (по сравнению с ротоглоткой) может быть связано с повышенной проницаемостью кишечника и более тяжелым течением мигрени (наличием заболеваний ЖКТ, системного воспалительного процесса).

Нарушения микробиоценоза слюны и ротоглотки при мигрени приводят в повышению уровня микробных эндотоксинов, увеличению содержания провоспалительных цитокинов, эти факторы негативно влияют на ЦНС, эндотелий сосудов и являются значимыми звеньями патогенеза при мигрени. Связь между нарушением микробиоценоза слюны и ротоглотки при мигрени показана в работе китайских ученых [19] и в нашем предыдущем исследовании микробиоты ротоглотки [12].

Для изучения слюны пациентов с мигренью мы впервые применили метод МСММ. МСММ позволяет легко проводить повторные заборы слюны, что привлекает как альтернатива более сложных диагностических процедур [39, 40], например забора анализа крови, в ряде случаев не только дополняя, но даже заменяя его [41]. Достижения в области масс-спектрометрической протеомики показывают многообещающие результаты использования слюны для изучения биомаркеров в диагностических целях [42—45]. В патофизиологии мигрени все большая роль отводится нейровоспалению и нарушению иммунной системы, в которых микробиологический состав сред организма принимает непосредственное участие [46].

У всех наших пациентов с мигренью анализ микробиома слюны показал наличие нарушений. Характерные изменения микробиоты включали повышение содержания ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, свойственных для хронических заболеваний ВДП и ЖКТ, что соответствовало информации о коморбидных заболеваниях, полученной из анамнеза и при осмотре пациентов отоларингологом и гастроэнтерологом. У большинства пациентов в слюне выявлено повышенное содержание стафилококков и стрептококков, характерных для заболеваний верхних и нижних дыхательных путей и анаэробных микроорганизмов, характерных только для кишечной микрофлоры (большинство лиц с мигренью имели высокие уровни клостридий, блаудиа и фузобактерий, пептострептококков и бактероидов). Достаточно часто встречался высокий уровень вирусных маркеров (вирусы герпеса 1-го и 2-го типов обнаружены у 30% пациентов, цитомегаловирус — у 27%). Уровень бифидо- и лактобактерий был в пределах нормы, что может свидетельствовать о сохранении резервных способностей микрофлоры, иммунитета (бифидо- и лактобактерии — антагонисты патогенной микрофлоры) у обследованных нами пациентов с мигренью.

По сравнению с микробиотой ротоглотки, в слюне отклонений от нормы было меньше, поскольку она в большой степени отражает состояние внутренней среды организма, которую организм эффективно поддерживает в нормальном состоянии. Поэтому в диагностических целях при мигрени мазок с задней стенки ротоглотки более информативен. При наличии у пациентов с мигренью клинических признаков интоксикации, системного воспалительного процесса, более тяжелого течения мигрени мы рекомендуем проводить оценку микробиоценоза методом МСММ как в слюне, так и в мазке из ротоглотки. Таким пациентам также рекомендуется консультация врача — отоларинголога и гастроэнтеролога и лечение сопутствующих заболеваний ЖКТ и ВДП.

Патогенетические механизмы, связывающие мигрень и изменения микробиома, сегодня активно изучаются, предполагается влияние индуцированных иммунных, воспалительных и сосудистых реакций с высвобождением иммунных клеток, воспалительных и вазоактивных агентов в слизистую оболочку, ведущее к гиперчувствительности церебральных структур, связанных с болевым восприятием [15]. Высокое распространение дисбиоза в ротоглотке и слюне при мигрени, а также наличие у 100% таких пациентов хронических заболеваний ЖКТ и ВДП диктует необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Заключение

1. С помощью метода МСММ в слюне пациентов с мигренью обнаружено нарушение микробиоценоза, характерными особенностями которого являются повышение содержания микробных маркеров:

— резидентных (условно-патогенных) микроорганизмов — кокков, свойственных для хронических заболеваний носоглотки;

— транзиторных микроорганизмов, в норме отсутствующих, характерных для кишечной микрофлоры;

— вирусов группы герпеса (1-го и 2-го типов, цитомегаловируса).

2. Сравнительная оценка микробиоты слюны и мазка с задней стенки ротоглотки показала наличие дисбиоза как в слюне, так и в ротоглотке пациентов с мигренью, однако в слюне отклонений от нормы было меньше, поэтому в диагностических целях мазок с задней стенки ротоглотки клинически более значим.

3. Применение метода МСММ расширяет лабораторно-клинические возможности при мигрени и позволяет разработать более эффективные комплексные схемы терапии и междисциплинарный подход к ведению больных с мигренью.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.