Безопасность и успешность восстановления печени донора является первоочередной задачей при трансплантации этого органа [1], в данных случаях у живого донора забирают долю или сегмент печени с учетом кровообращения и тока желчи. Кроме того, печень резецируют в пределах здоровых тканей при ее обширном травматическом повреждении [2, 3], при онкологических процессах [4, 5] и развитии метастазов [6], при обнаружении значительных доброкачественных опухолей [7, 8] и для элиминации некоторых паразитарных инвазий, таких как эхинококкоз [9] и альвеококкоз [10].

Считается, что по месту резекции в печени формируется соединительнотканный или фиброзный рубец, а восстановление объема органа происходит за счет гипертрофии оставшейся паренхимы, причем до 80—90% объема печени восстанавливаются в самые ближайшие сроки после резекции [1, 11]. В качестве осложнений резекции обычно рассматривают именно осложнения самого хирургического вмешательства [1, 4—6] и рецидив основного заболевания [5, 6]. О неблагоприятных реакциях оставшейся части органа сообщений очень мало. Особо отмечают, что очень редко встречающаяся послеоперационная утечка желчи не оказывает никакого значительного эффекта на регенерацию печени после удаления ее части с целью трансплантации [11]. Вместе с тем в качестве единичных случаев описаны постепенная атрофия сегмента печени, подвергшегося резекции [11], и случаи стеноза желчного протока [1].

Некоторые обнаруженные морфологические особенности формирования послеоперационного рубца печени крыс после удаления ее части в эксперименте, зависящие от повреждения сосудов, послужили основанием для этой работы.

Цель исследования — изучить возможные связанные с сосудами осложнения регенерации печени после резекции края ее доли в эксперименте.

Работа основана на результатах морфологического исследования репарации печени крыс-самцов инбредной линии Wag в разные сроки после резекции края этого органа.

Эксперименты проводили на животных массой тела 180—200 г возрастом 6 мес. Все манипуляции с крысами осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77; Приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.84). На проведение исследования получено разрешение Локального комитета по медицинской этике отдела «Центр новых медицинских технологий» ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН (заседание Этического комитета протокол № 18 от 24.10.14).

Под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики, после обработки кожи спиртом скальпелем производили срединную лапаротомию длиной 1,5—2 см. Ножницами резецировали каудальный край левой доли печени (lobus hepatis sinistra), масса удаленной ткани составляла 0,7—1,0 г (около 10% от веса всего органа). Гемостаз не применяли, сразу после резекции послойно ушивали переднюю брюшную стенку викрилом и обрабатывали швы 5% спиртовым раствором йода. Гибели животных от операции не было, крысы с признаками гнойно-воспалительных осложнений из эксперимента выбраковывались и в дальнейших исследованиях не участвовали. В качестве контроля использовали ложнооперированных (только лапаротомия) и интактных животных. На каждую точку исследования было использовано не менее 10 крыс (от 10 до 12 особей, всего 140 крыс).

Спустя 1—5 нед после резекции поврежденную долю печени вместе с припаянными органами (сальник, поджелудочная железа, кишечник) фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Axioimager M1 («Zeiss», Германия) при увеличении до 1200 раз. Состояние печени было исследовано вблизи и вдали (не менее 5 полей зрения при использовании объектива Х 10) от места хирургического вмешательства.

После резекции масса печени статистически достоверно не различалась (p>0,05) между группами крыс в указанные сроки исследования и соответствовала интактному контролю (9,31±1,6 г).

Через 1 нед после резекции рядом с печенью были расположены свежие и старые геморрагии, содержащие сидерофаги и разделенные на разные по размерам фрагменты фибрином или тонкими соединительнотканными структурами (рис. 1, а).

У 9 из 12 крыс на краю органа по месту повреждения присутствовала рыхлая волокнистая соединительная ткань (толщиной в некоторых случаях до 300 мкм) с очень большим количеством клеточных элементов, среди которых, кроме фибробластов, было много лимфоцитов и макрофагов. В этой соединительной ткани было найдено много сосудов: от мелких тонкостенных, видимо, являющихся грануляциями, до крупных, с широкими оболочками, состоящими из нескольких слоев клеток (см. рис. 1, а, б).

У остальных 3 животных в паренхиме печени, рядом с формирующимся рубцом, были найдены фрагменты бесструктурного детрита размером до 9 мм², отграниченные по краям лейкоцитарным валом из макрофагов и фибробластов с небольшим объемом межклеточного волокнистого компонента. Вглубь органа от таких участков с детритом отходили длинные соединительнотканные прослойки, постепенно уменьшающиеся по толщине по мере удаления от основного очага (см. рис. 1, в). В этих соединительнотканных структурах были обнаружены разрушающиеся остатки желчных протоков, состоящие из одного ряда крупных клеток с признаками деструкции клеточных ядер (кариопикноз, кариорексис, кариолизис). Макрофаги, инфильтрирующие в большом количестве ткани на границе с детритом и соединительнотканные прослойки в печени, были очень крупными, часто с пенящейся цитоплазмой (большое количество прозрачных лизосом) или содержащей коричневый пигмент, по-видимому, гемосидерин или компоненты желчи (см. рис. 1, в, г).

Через 2 нед после операции в большинстве случаев (7 из 12) обширные геморрагии в области резекции найдены не были, но небольшие кровоизлияния были обнаружены несколько глубже, непосредственно в паренхиме. По месту резекции на поверхности печени присутствовал соединительнотканный рубец, на отдельных участках похожий по строению на глиссонову капсулу, но с несколько большим процентом межклеточного компонента и высоким содержанием макрофагов, среди которых было много клеток с интенсивным окрашиванием цитоплазмы коричневым цветом. Часто к рубцу печени были подпаяны органы брюшной полости: сальники, петли кишечника и поджелудочная железа. В самой паренхиме вблизи от места резекции было много соединительнотканных структур, также там были расположены крупные кровеносные сосуды с толстыми склерозированными стенками (см. рис. 1, д, е).

В оставшихся наблюдениях поврежденная доля печени в значительной степени была деформирована соединительнотканными перетяжками до 200 мкм шириной, которые на значительном протяжении были представлены плотной волокнистой соединительной тканью (см. рис. 1, ж). В этих структурах на отдельных участках было много сосудов со склерозированными оболочками, лимфоцитов и макрофагов, также в большом количестве содержались клеточные элементы с коричневой окраской цитоплазмы (см. рис. 1, ж, з).

Через 3 нед макроскопически место операции только у некоторых животных можно было определить по подпаянным органам брюшной полости. Глиссонова капсула к этому времени практически восстановилась и на участке после хирургического вмешательства была только несколько толще, чем на остальной поверхности. От этой капсулы вглубь органа отходили соединительнотканные прослойки с сосудами. Вместе с тем в структурах капсулы все еще присутствовали крупные клеточные элементы с коричневой окраской цитоплазмы (рис. 2, а).

Кроме того, недалеко от места хирургического вмешательства в паренхиме органа у 2 из 12 крыс были найдены достаточно крупные кровоизлияния (до 0,8 мм в поперечнике). Большое количество фибрина по краю геморрагий и наличие сидерофагов свидетельствовало, что эти кровоизлияния были образованы не в результате выделения и забора печени для гистологического изучения, а за какое-то время до этого (см. рис. 2, б).

К 4-й неделе у 6 из 10 крыс и у 8 из 10 животных на 5-й неделе на участке повреждения печени были восстановлены структуры глиссоновой капсулы, которая на таких местах была несколько толще и состояла и из фиброзной, и из плотной волокнистой соединительной ткани, часто с большим числом крупных макрофагов. В паренхиме органа была отмечена только диффузная лимфоцитарная и макрофагальная инфильтрация.

В оставшихся случаях от места резекции вглубь органа отходили грубые толстые прослойки плотной волокнистой соединительной ткани, в которых присутствовали гигантские клетки инородных тел и крупные клеточные элементы с коричневым пигментом в цитоплазме. Также там были найдены структуры практически без клеток, но с очень плотным межклеточным веществом, имеющие свою собственную тонкую капсулу, похожие на облитерированные сосуды или желчные протоки. Рядом с такими соединительнотканными образованиями были расположены группы тонкостенных сосудов и небольших желчных капилляров. От широких прослоек соединительной ткани в паренхиму отходили более мелкие, постепенно истончающиеся прослойки, также с большим объемом коричневого пигмента, расположенного внеклеточно и внутри крупных клеток с эксцентрично расположенным ядром (см. рис. 2, в—е).

Отсутствие статистически значимых отличий массы печени после резекции ее края может быть связано с разными причинами. Во-первых, дефект массы после удаления фрагмента органа был небольшим — около 10%. Во-вторых, на месте резекции присутствовали геморрагии, а резекция органа сопровождается изменениями микроциркуляции и ускорением кровотока как реакцией на повреждение. В ранние сроки это может нивелировать изменение массы органа. Масса паренхимы за счет гипертрофии оставшейся ткани при небольшом повреждении восстанавливается к 2—3-й неделе, далее идет реорганизация гипертрофированных участков, но на массу печени это в значительной мере уже не влияет. В тех случаях, когда в оперированной доле идут активные, но постепенные процессы склероза и фиброза, скорее всего, в других долях продолжаются параллельные гипертрофические компенсаторные изменения, что также приводит к отсутствию изменений массы всей печени.

Сразу после повреждения ткани печени место разреза сначала прикрывается кровью, излившейся из поврежденных сосудов и синусоидов органа. Этот кровяной сгусток постепенно уплотняется, эритроцитарные массы разделяются фибриновыми перетяжками, по ним мигрируют лейкоциты, которые, экскретируя протеолитические ферменты [12], лизируют фибрин и эритроциты. Кровяной сгусток становится похожим на сеть, по ее нитям мигрируют фибробласты и начинают синтез компонентов соединительной ткани [13, 14]. Постепенно образуется соединительнотканный рубец, который сначала содержит много клеточных элементов, и мало волокон. Не исключено, что такие соединительнотканные структуры, формирующиеся по краю разреза печени уже в течение 1-й недели, являются первыми этапами восстановления глиссоновой капсулы. В результате констрикции этой соединительной ткани припаянные к рубцу органы брюшной полости подтягиваются ближе к печени и начиная со 2—3-й недели наблюдения попадают в площадь гистологического среза.

По-видимому, не все сосуды к этому времени плотно тромбированы, из некоторых возможно кровотечение, например при движениях животного. Постепенно эритроциты фагоцитируются и лизируются макрофагами (сидерофагами), накапливающими соединения железа, которые окрашивают цитоплазму фагоцитов в бурый цвет. Но постоянно образуются свежие кровоизлияния, повторяющие этот путь, вследствие этого рядом с поврежденным краем печени одновременно расположены и свежие, и старые геморрагии и всегда много сидерофагов.

Постепенно тромбированные сосуды склерозируются, что проявляется в виде соединительнотканных перетяжек в органе, начинающихся в области резекции: т. е. уходящие в паренхиму прослойки из соединительной ткани представляют собой нефункционирующие в результате пересечения, тромбоза и склероза крупные сосуды. Также не исключены облитерация и склероз поврежденных желчных протоков. Начиная со 2-й недели эта соединительная ткань сокращается, и печень деформируется указанными перетяжками.

Скорее всего, коричневый пигмент в цитоплазме крупных фагоцитов является гемосидерином. Вместе с этим нельзя исключить, что коричневое окрашивание макрофаги приобретают вследствие фагоцитоза желчи. Желчь может оказаться в паренхиме печени в результате пересечения при резекции желчных протоков. Желчь также может попасть в ткани при невозможности ее транспорта от гепатоцитов, вследствие блокады или пережатия желчных протоков воспалительным инфильтратом, геморрагиями, тромбом по краю резекции при констрикции фибрина, формирующимся рубцом и тому подобными причинами. Поэтому являются возможными фагоцитоз желчи из паренхимы органа макрофагами и миграция в другие органы этих фагоцитов с желчью для ее утилизации или элиминации [15]. Желчь в тканях из-за постепенной абсорбции ее жидкой части может уплотняться, вследствие этого становится вероятным слияние макрофагов с образованием многоядерных форм для лизиса таких конкрементоподобных скоплений сгущенной желчи.

Сосуды при резекции печени повреждаются не только на краю органа, возможны геморрагии и непосредственно в паренхиму, разумеется, недалеко от края. Кроме того, пересечение сосудов при разрезе и последующее тромбирование может нарушить кровоснабжение отдельных участков печени с последующим их некротизированием и деструкцией. Не исключено, что найденные обширные фрагменты детрита с лейкоцитарной реакцией вокруг представляют собой или уже организованные геморрагии, или, что более вероятно, нежизнеспособные участки печеночной паренхимы.

Детрит сначала отграничивается лейкоцитами и формирующейся соединительной тканью, малое содержание нейтрофилов указывает на асептический характер воспалительного процесса, инициируемого антигенами из поврежденных тканей. Наличие крупных макрофагов с пенистой цитоплазмой вокруг детрита свидетельствует об активном участии этих клеточных элементов в фагоцитозе и лизисе, резорбции дебриса. Далее должны произойти или полная лейкоцитарная инфильтрация дебриса с его фрагментированием, рассасыванием и замещением рубцом, или постепенное осумковывание плотной волокнистой соединительной или фиброзной тканью. Возможно, что таких участков с детритом сразу после операции было больше, но в течение 1 нед большинство более мелких рассосалось и было замещено соединительной тканью, а остались только самые крупные, не до конца резорбированные фагоцитами к этому моменту.

К 3-й неделе толстый рубец из плотной волокнистой соединительной ткани на месте повреждения полностью сменился характерной для капсулы печени фиброзной тканью. Однако спайки брюшной полости не исчезли, а только сократились и склерозировались, на что указывают плотно подпаянные к печени органы брюшной полости и склерозированные структуры сальников непосредственно вблизи места операции.

Вместе с этим сохраняются, по крайней мере, частично сосудистые нарушения в печени, о чем свидетельствуют обнаруженные геморрагии в паренхиме и сидерофаги в структурах капсулы. Возможно, что восстановленные сосуды еще не имеют хорошо сформированных оболочек и повреждаются при резких изменениях кровотока, например при некоторых изменениях питания или резких движениях животных. Также существует вероятность, что толстые соединительнотканные перетяжки, сформировавшиеся в печени, пережимают отдельные сосуды и также являются причиной кровоизлияний.

У большинства крыс процессы регенерации печени после резекции части ее доли практически завершились к 4-й неделе.

Однако на основании обнаружения широких прослоек соединительной ткани, формирования гигантских клеток инородных тел, присутствия значительного количества макрофагов с коричневым пигментом можно сделать заключение, что у некоторых животных, примерно 1/3 от общего числа, и на этот срок, и на 5 нед, и, видимо, позже продолжаются процессы повреждения и восстановления печени.

Не исключено, что пересечение при резекции крупного кровеносного сосуда или желчного протока влечет за собой его облитерацию и замещение соединительной тканью. При этом также склерозируются и паренхиматозные ветви таких сосудов и протоков. В результате гипоксии и нарушения оттока желчи погибают и разрушаются группы гепатоцитов, расположенные рядом с такими прослойками соединительной ткани. Процесс повторяется и постепенно приводит к формированию очень широких соединительнотканных структур.

Кроме того, такие широкие полоски плотной соединительной ткани препятствуют прорастанию через них новых кровеносных сосудов и желчных протоков. В пользу такого предположения свидетельствуют группы молодых желчных капилляров с пустым просветом, обнаруженные рядом с прослойками соединительной ткани (см. рис. 2, в).

Возможно, что найденные многоядерные макрофаги со слившейся цитоплазмой (см. рис. 2, в) формируются для лизиса нежизнеспособных больших фрагментов печеночной паренхимы, сосудов, желчных протоков, а также, по-видимому, желчных конкрементов, образующихся в протоках и ткани при длительном нарушении оттока и даже движения желчи. В процессе всего этого гепатоциты продолжают секретировать компоненты желчи, которые в итоге также оказываются в паренхиме органа и между клетками соединительной ткани, откуда и фагоцитируются макрофагами, приобретающими коричневую окраску. Так как желчь является продуктом утилизации эритроцитов, существует вероятность, что макрофаги, фагоцитирующие желчь из тканей печени, сходны с сидерофагами, также имеющими коричневую окраску цитоплазмы.

Можно предположить, что такое прогрессирующее формирование соединительной ткани на месте поврежденных сосудов и желчных протоков постепенно приведет к значительному или даже полному замещению всей доли печени вследствие простой резекции ее части соединительной тканью, атрофии, склерозу и фиброзу [11]. Однако остальные доли органа повреждены не были и, следовательно, можно ожидать быстрой гипертрофии и компенсации ими функций утраченных структур [1, 11]. При проведении резекции печени по любым показаниям по возможности следует избегать пересечения крупных сосудов и желчных протоков. Также целесообразным является проведение мероприятий, направленных на поддержание и сохранение функций оставшейся печеночной паренхимы до полной ее компенсационной гипертрофии.

Таким образом, через 1 нед после резекции печени у крыс на краю органа по месту разреза была расположена рыхлая волокнистая соединительная ткань. В паренхиме печени, рядом с формирующимся рубцом, иногда были расположены фрагменты бесструктурного детрита, отграниченные лейкоцитарным валом из лимфоцитов, макрофагов и фибробластов. Вглубь органа от таких участков с детритом отходили длинные и толстые соединительнотканные прослойки, образованные на месте пересеченных и нефункционирующих сосудов и желчных протоков. Спустя 2 нед после операции на поверхности органа присутствовал соединительнотканный рубец с высоким содержанием макрофагов, среди которых было много клеток с интенсивным коричневым окрашиванием цитоплазмы, по-видимому, сидерофагов или содержащих компоненты желчи. В некоторых случаях печень была деформирована соединительнотканными перетяжками до 200 мкм шириной, скорее всего, сформированными из сосудов. В последующие сроки структура органа практически восстановилась у большинства крыс. Однако примерно у 1/3 животных от места резекции в паренхиму уходили грубые толстые тяжи плотной волокнистой соединительной ткани, в структуре которой было много лейкоцитов, сосудов со склерозированными оболочками и групп крупных клеточных элементов с эксцентрично расположенным ядром и коричневой цитоплазмой, что может являться свидетельством продолжающихся вследствие сосудистых расстройств процессов повреждения оперированной доли печени, которые в итоге завершатся ее атрофией или фиброзом.

Работа выполнена при финансовой поддержке ПФНИ ГАН на 2017—2020 гг. (VI.62.2.1, 0309−2016−0006) «Разработка технологий получения материалов для регенеративной медицины и развитие методов восстановления репродуктивного здоровья».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.М., А.Ш., В.М.

Сбор и обработка материала — И.М., Н.Ф., В.М., Р.М., Т.М., В.М., О.Ф., А.К., А.Ш.

Написание текста — И.М., А.Ш., В.М.

Редактирование — И.М., А.Ш., В.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no potential conflicts of interest.

Сведения об авторах

Майбородин Игорь Валентинович — д.м.н., проф., главный научный сотрудник лаборатории стволовой клетки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Центр новых медицинских технологий; Е-mail: imai@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-8182-5084

Фигуренко Николай Федорович — к.м.н., докторант лаборатории стволовой клетки ИХБФМ СО РАН; https://orcid.org/0000-0002-0430-8673

Морозов Виталий Валерьевич — д.м.н., проф., заведующий лабораторией инвазивных медицинских технологий ИХБФМ СО РАН, https://orcid.org/0000-0002-9810-5593

Маслов Роман Владимирович — к.м.н., докторант лаборатории стволовой клетки ИХБФМ СО РАН; https://orcid.org/0000-0003-4472-859х

Михеева Татьяна Владимировна — к.м.н., докторант лаборатории стволовой клетки ИХБФМ СО РАН; https://orcid.org/0000-0002-5763-1773

Майбородина Виталина Игоревна — д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории ультраструктурных основ патологии ИМППМ, ул. акад. Тимакова, 2, 630117, Новосибирск, Россия, https://orcid.org/0000-0002-5169-6373

Филипович Ольга Николаевна — к.м.н., докторант лаборатории стволовой клетки ИХБФМ СО РАН;

Кадырова Алия Ишенбековна — к.м.н., докторант лаборатории стволовой клетки ИХБФМ СО РАН;

Шевела Андрей Иванович — д.м.н., проф., заведующий отделом «Центр новых медицинских технологий» ИХБФМ СО РАН: https://orcid.org/0000-0002-3164-9377