Клинические и экспериментальные изыскания, направленные на улучшение результатов лечения нозокомиальной инфекции, из года в год увеличиваются. Вопрос преодоления устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам остается актуальным и значимым в медицине. В настоящее время предложено множество способов лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, альтернативных антибактериальной терапии [1—3]. Одним из перспективных является аппликационный метод фотодинамической терапии [4—8].

Метод фотодинамической терапии аппликационным способом основан на том, что патогенные микроорганизмы накапливают в себе краситель — фотосенсибилизатор [9]. В сенсибилизированных бактериях под воздействием энергии света соответствующей длины волны развивается фотохимическая реакция с выделением чужеродных агентов (активная форма кислорода и свободные радикалы), оказывающих повреждающее действие на микроорганизмы, вызывая их гибель [10]. Ограничение практического применения аппликационного способа фотодинамической терапии обусловлено недостаточным количеством экспериментальных исследований в этой области.

По данным М.П. Толстых, результаты изучения антибактериальной активности при облучении не лазерным источником света с длиной волны 600—700 нм без использования фотосенсибилизатора показали снижение жизнеспособности микроорганизмов в 20 раз [11]. Другой исследователь, изучая бактерицидную активность светодиодного излучения без фотосенсибилизатора, значимого эффекта ни в качественном, ни в количественном составе микроорганизмов не получил, диапазон длины волн, использованный автором, — 675 нм [12].

Противоречивость приведенных данных не решает проблему появления высоковирулентных и антибиотикорезистентных штаммов, приводя к росту числа больных с гнойными заболеваниями мягких тканей [13], а только подталкивает исследователей к поиску новых и совершенствованию существующих методов направленных на преодоление сопротивляемости микроорганизмов.

Цель работы — изучить invitro фотохимическое воздействие на сенсибилизированные штаммы микроорганизмов, выделенных из послеоперационных ран, осложнившихся развитием гнойно-воспалительного процесса.

Задачи:1) определить длительность облучения сенсибилизированных Фотосенсом бактерий, достаточную для получения бактерицидного эффекта; 2) изучить в отдельности бактерицидную активность облучения микроорганизмов светодиодной лампой, фотосенсибилизатора и их совместное влияние.

В качестве объекта воздействия использовались наиболее значимые, вызывающие нозокомиальную инфекцию, резистентные к антибиотикам, чистые культуры микроорганизмов. Грамположительные: St. aureus, St. epidermidis; грамотрицательные: Escherichiacoli, Pseudomonas aeruginosa, а также грибы: рода Candida, рода Aspergillus. Штаммы получены при заборе материала во время первичной хирургической обработки гнойно-воспалительного процесса в послеоперационной ране.

В качестве проникающего вещества выступал анионный синтетический фотосенсибилизатор II поколения Фотосенс, концентрат для приготовления раствора 2 мг/мл, разработанный в ГНЦ «НИОПИК». Препарат предварительно разбавляли с физиологическим раствором и применяли в следующих концентрациях: 500 мкг/мл (1:4); 250 мкг/мл (1:8); 200 мкг/мл (1:10); 125 мкг/мл (1:16). Для определения степени накопления Фотосенса в бактериях использовали лазерный электронно-спектральный анализатор ЛЭСА-6. Данная установка регистрирует флюоресценцию вещества.

Для облучения бактерий и активации фотохимической реакции в сенсибилизированных штаммах использовалась светодиодная лампа УФФ-630/675−01 Биоспек с диапазоном длины волн 660—680 нм и мощностью излучения не менее 40 мВт/см².

Суточные агаровые культуры тест-организмов суспендировали в стерильной дистиллированной воде и доводили до плотности 5,0·10⁶ КОЕ/мл. Питательную среду в чашках Петри засевали тест-культурами методом «газона», распределяли суспензию по поверхности питательной среды покачиванием.

Чашки Петри были поделены на 6 групп с разным временем облучения. В каждой группе — по 4 чашки с разной концентрацией фотосенсибилизатора, всего 24 чашки для одного вида бактерий.

Следует отметить, что наличие фотосенсибилизатора в бактериях, даже в небольшом количестве, при воздействии энергии света приводит к активации фотохимической реакции. Однако концентрация образующихся агрессивных элементов (активная форма кислорода и свободные радикалы) может произвести недостаточный антибактериальный эффект, а пролонгированное облучение приводит к выгоранию фотосенсибилизатора (фотобличингу). Поэтому содержание фотосенсибилизатора в бактериях должно достигать той концентрации, при которой реализуется фотодинамическая реакция с антимикробным эффектом.

После регистрации флюоресценции определялось оптимальное время облучения для получения максимального антибактериального эффекта. Для этого сенсибилизированные микроорганизмы подвергались воздействию с помощью лампы УФФ-630/675−01 Биоспек в течение 10, 20, 25, 30, 35 и 40 мин (табл. 1).

Для раздельного изучения антимикробного действия светодиодной лампы, Фотосенса и их совместного влияния, проведено исследование на 4 группах колоний чистой культуры, высеянных из послеоперационных ран, осложненных гноеродной инфекцией.

Непосредственно после облучения чашки Петри инкубировались в течение 18—24 ч, после чего проводилось количественное микробиологическое исследование в динамике.

После облучения грамположительных штаммов антибактериальный эффект в одинаково высокой степени выявлен при концентрациях Фотосенса 500 и 250 мкг/мл и длительности светового воздействия не менее 25 мин, в остальных случаях количественный состав патогенной микрофлоры не изменился (табл. 2).

При облучении грамотрицательных штаммов бактерицидное действие выявлено в 4—6-й группах с аналогичной предыдущему опыту дозой Фотосенса и временем воздействия не менее 30 мин, однако не в такой яркой форме, как у грамположительной флоры (табл. 3). Видимо, это связано с некоторыми принципиальными различиями в строении клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, что требует дальнейшего изучения. В 1—3-й группах, а также в чашках с экспозицией фотосенсибилизатора в концентрациях 125 и 200 мкг/мл количественный состав колоний не изменился.

Таким образом, необходимое время облучения светодиодной лампой с дозой Фотосенса не менее 250 мкг/мл для достижения бактерицидного эффекта фотодинамической реакции: 25 мин — для грамположительных бактерий, 30 мин — для грамотрицательных бактерий.

Нередко грибы входят в ассоциации микроорганизмов инфекционного очага, но могут быть самостоятельной первопричиной развития нозокомиальных инфекций [14], поэтому на данном этапе эксперимента исследовалось действие облучения на грибы. Полученные результаты оказались схожими с таковыми у грамположительных штаммов.

Максимальный антимикотический эффект получен при длительности облучения не менее 25 мин (табл. 4).

Подтверждением точности приведенных данных является диагностика флюоресцентного сигнала грибов. Во всех 6 группах после экспозиции с разведением раствора Фотосенса до 200 мкг/мл и 125 мкг/мл зарегистрирована недостаточная для активации губительной фотохимической реакции концентрация Фотосенса.

При анализе данных первого этапа экспериментального исследования установлено, что независимо от вида микроорганизма максимальный антимикробный эффект получен через 30 мин облучения после экспозиции с Фотосенсом в концентрации 250 мкг/мл. Увеличение концентрации более 250 мкг/мл не приводит к увеличению его накопления в бактериях, которое держится на определенном уровне.

На следующем этапе экспериментальных исследований отдельно изучалось антибактериальное действие светодиодной лампы, Фотосенса и их совместное влияние (табл. 5, 6, 7, 8).

Первая группа — 10 чашек с колониями чистой культуры (грамположительные, грамотрицательные, грибы), предварительно накопившими фотосенсибилизатор, — подвергалась воздействию светового излучения. Длительность облучения, как уже определено, составила 30 мин.

Вторая группа —10 чашек (аналогичных микроорганизмов) — подвергалась непосредственному воздействию светодиодного излучения с длиной волны 676 нм и мощностью излучения 40 мВт/см² в течение 30 мин, без нанесения фотосенсибилизатора на микрофлору.

Третья группа — 10 чашек с микроорганизмами — была необходима для исследования бактерицидного действия самого Фотосенса в концентрации 500 и 250 мкг/мл (без светодиодного воздействия).

Четвертая группа — 10 чашек — с целью контроля устанавливалась в термостат без светодиодного воздействия или добавления Фотосенса.

При изучении бактерицидной активности Фотосенса и светодиодного излучения отдельно друг от друга изменений в количественном составе микроорганизмов ни в том ни в другом случае не выявлено.

Значимые изменения в количественном составе бактерий обнаружены при сочетании облучения и Фотосенса. Существенный губительный эффект зарегистрирован относительно грибов и грамположительных штаммов.

В результате экспериментального исследования, на основании полученных данных об эффективности фотодинамического воздействия на нозокомиальные бактерии обоснован метод лечения гнойных ран. Бактерицидный эффект фотохимического воздействия на грамположительные и грамотрицательные штаммы, а также грибы получен только при сочетанном использовании Фотосенса в концентрации 250 мкг/мл и облучения с длительностью последнего 30 мин. Это позволяет применить аппликационную антимикробную фотодинамическую терапию нагноившихся послеоперационных ран с определенными параметрами, не учитывая видовую принадлежность бактерий и их чувствительность к антибактериальным препаратам.