Введение

Ангиогенез — это отрастание новых сосудистых отростков от уже существующих кровеносных сосудов. В ответ на повышение в ишемизированном микроокружении факторов роста, прежде всего VEGF, эндотелиальные клетки (ЭК) мигрируют по градиенту хемоаттрактанта, где формируют новые сосудистые отростки посредством взаимодействия с окружающими муральными клетками [1]. Муральные клетки являются предшественниками гладкомышечных клеток и перицитов. Среди муральных клеток особая роль в регуляции ангиогенеза принадлежит мезенхимным стромальным клеткам (МСК), которые проявляют перицитарные свойства и участвуют как в стимуляции роста первичных эндотелиальных отростков, так и в их стабилизации и формировании зрелой сосудистой сети. В моделях сокультивирования in vitro было показано, что ЭК способны образовывать капилляроподобные структуры в совместной культуре с МСК. Мы обнаружили, что формирование капилляроподобных структур начинается через 14 ч со значительным ускорением через 25 ч, что совпадает по времени с формированием внеклеточного матрикса (ВМ) [2].

Помимо ВМ, за регуляцию ангиогенеза отвечают межклеточные взаимодействия. Сигнальный путь Notch является одним из таких регуляторов. У млекопитающих он включает лиганды Notch: Delta-подобные (Dll1, Dll3 и Dll4), Serrate-подобные (Jagged1 и Jagged2) и рецепторы (Notch 1—4). Гены-мишени Notch — Hairy/Enhancer семейства split — Hes и Hey [3]. Важная роль Notch в развитии сердца показана на основе анализа мутаций в лигандах и рецепторах Notch, которые приводят к аномалиям развития сердца [4].

Помимо классической Notch-сигнализации, существует и неканоническая, которая включает взаимодействие компонентов Notch с элементами ВМ. Предполагается, что ВМ регулирует Notch-сигнализацию на нескольких уровнях, в том числе прямое взаимодействие между ВМ и Notch-рецепторами/лигандами и транскрипционный контроль Notch-рецепторов/лигандов через активацию ВМ других сигнальных путей, в частности активируемых интегринами. Кроме того, во ВМ происходит депонирование секретирующихся клетками факторов роста, которые также играют важную роль в неканонической Notch-сигнализации [5]. Ранее мы обнаружили, что сокультивирование ЭК и МСК в присутствии синтезированного клетками ВМ в сравнении с сокультививрованием на непокрытом пластике приводит к активации экспрессии DLL1 в ЭК [6]. Это указывает на вклад неканонической Notch-сигнализации во взаимодействия между клетками. Данные, полученные другими авторами, основывались на изучении межклеточных взаимодействий ЭК и муральных клеток либо в присутствии ВМ, либо после 48—72 ч сокультивирования, когда матрикс полностью синтезирован [7].

Цель работы — изучение роли Notch-сигнализации в коммуникации ЭК и МСК на этапе инициации формирования капилляроподобных структур и до сборки ВМ — 19 ч сокультивирования.

Материал и методы

Выделение клеток и их культивирование

МСК, выделенные из подкожной жировой ткани, были получены из коллекции биоматериала человека Института регенеративной медицины (МГУ им. Ломоносова, идентификатор коллекции: MSU_MSC_AD; каталог репозитория www.human.depo.msu.ru). Все процедуры, выполненные с образцами тканей доноров, соответствовали Хельсинкской декларации и были одобрены Комитетом по этике МГУ им. М.В. Ломоносова (IRB00010587), протокол №4 (2018). МСК культивировали в среде DMEM-GlutaMAX™ («ThermoFisher Scientific», США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) («Cytiva», США) и пенициллином/стрептомицином («ThermoFisher Scientific», США) при 37 °С и 5% CO₂.

Эндотелиальные клетки пупочной вены (HUVEC) были любезно предоставлены О.А. Антоновой из лаборатории клеточной адгезии ФГБУ «НМИЦК им. акад. Чазова» Минздрава России. Все процедуры, выполненные с образцами тканей доноров, соответствовали Хельсинкской декларации и были одобрены локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦК им. акад. Чазова» Минздрава России, протокол 274 от 29.11.21. HUVEC культивировали в среде EGM-2 («Lonza», Швейцария) при 37 °С и 5% CO₂.

В экспериментах использовали клетки 3—6-го пассажа. В каждом эксперименте использовали не менее 3 биологических повторов (по 1 донору на повтор).

Модель формирования КПС на Матригеле

Анализ образования капилляроподобных структур (КПС) эндотелиоцитами in vitro проводили и количественно оценивали, как описано нами ранее [6]. Вкратце, 35·10³ HUVEC высевали на лунку в 48-луночный планшет, покрытый толстым слоем Matrigel («Corning», Нью-Йорк, США), и культивировали в течение 19 ч в среде EGM-2 («Lonza», Швейцария). Изображения получали с помощью Image Exfluorer A1 (LSI). Для количественной оценки образования КПС общую длину образованных структур измеряли в программе Image J с помощью плагина Angiogenesis Analyzer (NIH, США). Эксперименты проводили в 3 повторах с клетками от разных доноров.

Сокультивирование HUVEC и МСК

Сокультивирование проводили, как описано нами ранее [2]. Вкратце, HUVEC и МСК высевали в виде монокультур или совместных культур при общей плотности 6·10⁴ клеток/см² и культивировали в течение 19 ч в среде EGM-2 («Lonza», Швейцария) для оценки экспрессии мРНК. При контактном сокультивировании использовали смесь HUVEC:MSC в соотношении 1:1. Перед посевом HUVEC предварительно окрашивали 5 мкМ флюоресцентным красителем CellTracker Green CMFDA («ThermoFisher Scientific», США). Клетки сокультивировали в присутствии или в отсутствие ингибитора γ-секретазы XXI (Compound E), 10 мкг/мл («Merck KGaA», Германия). К контрольной группе было добавлено такое же количество диметилсульфоксида (ДМСО), что и в растворе ингибитора. При непрямом сокультивировании HUVEC высевали в лунки 6-луночного планшета, а МСК добавляли во вставки Transwells (0,4 мкм) («Corning», США).

Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

Клетки из контактных совместных культур разделяли с помощью магнитной селекции на бусах Dynabeads CD31 («ThermoFisher Scientific», США). Загрязнение МСК эндотелиоцитами составляло <0,1%. Тотальную РНК выделяли из МСК и HUVEC, из монокультур или совместных культур с помощью RNeasy Mini Kit («QIAGEN», США). кДНК первой цепи синтезировали со случайными гексамерными праймерами с использованием набора для синтеза кДНК первой цепи RevertAidTM («ThermoFisher Scientific», США). ПЦР в реальном времени выполняли с интеркалирующим красителем SYBR Green в составе готовых реакционных смесей («Eurogene», Россия) с использованием амплификатора StepOnePlus («ThermoFisher Scientific», США); в работе использовали праймеры, опубликованные ранее [6] и дополнительные: HES2: cagcttaaggggctcatcct, ggacgtctgccttctctagc; HEY2: aaggcgtcgggatcggataa, agagcgtgtgcgtcaaagtag; FGF2: aagcggctgtactgcaaaaac, tgagggtcgctcttctccc; TGFB2: ccccggaggtgatttccatc, gggcggcatgtctattttgtaaa; TGFB3: acttgcaccaccttggacttc, ggtcatcaccgttggctca; PDGFRA: ttgaaggcaggcacatttaca, gcgacaaggtataatggcagaat; PDGFRB: ctgaacgtggtcaacctgtt, gactcgtccttgctcatgtc; TGFBR1: acggcgttacagtgtttctg, gcacatacaaacggcctatctc; TGFBR2: gtagctctgatgagtgcaatgac, cagatatggcaactcccagtg. После денатурации (95 °С, 10 мин) для всех пар праймеров было проведено 40 циклов амплификации с отжигом/элонгацией при 60 °С в течение 60 с. Специфичность амплификации анализировали по стадии плавления после завершения ПЦР. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывали по методу 2-ΔΔCt относительно мРНК ACTB (бета-актин).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость различий между значениями определяли с помощью дисперсионного анализа (One-way ANOVA) с поправкой Tukey’s для множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Ранее мы показали на 2D-модели контактного сокультивирования на непокрытом пластике (в отсутствие какого-либо матрикса), что HUVEC формируют КПС за 48 ч коммуникации с МСК, причем КПС не образовывались в монокультуре или при бесконтактном сокультивировании с МСК в системе Transwell с полупроницаемой мембраной. А добавление ингибитора γ-секретазы подавляло образование КПС более чем в 2 раза [2]. В данной работе мы оценили влияние Notch-сигнализации на способность ЭК формировать КПС в классической in vitro модели ангиогенеза на Матригеле [8]. В этой модели инициирование образования КПС обусловлено составом Матригеля, который гомологичен базальной мембране. Данная модель отражает каноническую и в большей степени неканоническую Notch-сигнализацию на формирование КПС без участия МСК. Мы обнаружили, что ингибитор γ-секретазы подавляет образование КПС более чем в 2,5 раза (рис. 1). Таким образом, мы показали, что γ-секретаза ингибирует в равной степени образование КПС и в одномерной модели формирования капилляроподобных структур на Матригеле (см. рис. 1), т.е. в присутствии ВМ, и в 2D-совместной культуре с МСК на непокрытом пластике [2]. Это говорит о том, что вклад неканонической Notch-сигнализации достаточно существен.

Рис. 1. Модель ангиогенеза на Матригеле. Репрезентативные изображения образования КПС HUVEC, культивированных в контрольных условиях (в присутствии ДМСО) (а) и в присутствии ингибитора γ-секретазы (б).

Изображения были получены с помощью Image Exfluorer A1 (LSI). Количественная оценка изменений общей длины КПС, образованных HUVEC за 19 ч в присутствии ДМСО или ингибитора γ-секретазы (в). ** — p<0,005.

На начальном этапе сокультивирования клетки взаимодействуют преимущественно через межклеточные контакты, а уже позже к взаимодействую подключаются элементы синтезированного матрикса. Поэтому мы решили оценить вклад межклеточного взаимодействия через Notch на этапе начала образования КПС (19 ч), но до формирования полноценного ВМ (48 ч). Тем самым исключая «шум», вносимый матриксом через неканоническую Notch-сигнализацию.

Для этого мы изучили влияние ингибитора Notch-сигнализации (ингибитора γ-секретазы) на изменение профиля экспрессии основных участников сигнальных путей, ответственных за формирование КПС с помощью ПЦР в реальном времени. Изменение уровней мРНК в HUVEC и МСК в совместных культурах мы нормализовали относительно соответствующих монокультур. Мы считали, что экспрессия мРНК регулируется Notch, если наблюдались значительные изменения (увеличение или снижение экспрессии) при контактном сокультивировании, и это изменение отсутствовало одновременно при непрямом сокультивировании (здесь вклад только паракринной коммуникации) и сокультивировании в присутствии ингибитора γ-секретазы. Мы обнаружили Notch-зависимое увеличение экспрессии мРНК JAG1, Notch1, Notch3, HES1, HEY1 в МСК (рис. 2, а). При этом HES2 в МСК экспрессировался на едва определяемом уровне. В HUVEC наблюдалось Notch-зависимое повышение экспрессии Notch4 и HES2 (рис. 2, б). Для Notch-сигнализации характерна линейная передача сигнала без усиления [3]. Стоит отметить, что активация Notch-сигнализации в МСК была намного более выражена, чем в HUVEC. Это указывает на то, что межклеточные взаимодействия HUVEC и МСК приводят к преимущественной активации Notch-сигнализации именно в МСК.

Рис. 2. Оценка влияния Notch-сигнализации на экспрессию генов при сокультивировании HUVEC и МСК.

Клетки МСК (а, в, д) и HUVEC (б, г) культивировали в виде монокультур, совместных контактных культур (ко-культура), совместных контактных культур с ингибитором γ-секретазы (ко-культура + γ-секр.инг.) и совместных бесконтактных культур в Transwell (Tw) в течение 19 ч. Разделение совместных контактных культур проводили на магнитных бусах. С помощью ПЦР в реальном времени проводили анализ экспрессии компонентов Notch-системы (а, б), эфриновой системы (в, г) и генов, ассоциированных с ангиогенезом (д). Данные нормированы на монокультуру без воздействия ингибитора γ-секретазы. * — p<0,05; ** — p<0,005.

Известно, что взаимодействие сигнальных путей Notch и Eph/ephrin играет определяющую роль в артериовенозной спецификации образующихся сосудов и в целом в ангиогенезе [9]. Мы обнаружили, что экспрессия эфринового лиганда EFNB2 активируется Notch-зависимо в МСК (рис. 2, в). Экспрессия мРНК рецептора EPHA4 подавлялась в МСК при прямом контактном сокультивировании по сравнению с бесконтактным сокультивированием в Transwell (рис. 2, в). В литературе на данный момент отсутствует информация об этом рецепторе, касающаяся коммуникации ЭК и муральных клеток, однако есть данные о том, что этот рецептор может регулировать сократимость гладкомышечных клеток [10].

Мы обнаружили снижение уровня экспрессии EFNA3 в HUVEC в ко-культуре (рис. 2, г), который, как известно, подавляет миграцию ЭК, являющуюся важной частью активации ангиогенеза [11]. Что объясняет повышенную подвижность ЭК при сокультивировании с МСК [2].

При анализе изменений экспрессии ряда ключевых генов в МСК при сокультивировании с ЭК, участвующих в ангиогенезе, мы обнаружили, что экспрессия ANGPT1 была снижена при контактном сокультивировании по сравнению с бесконтактным, а экспрессия ANGPT2 возрастала только в ко-культуре (рис. 2, д). Оба фактора являются важными регуляторами роста и стабилизации сосудов. Ангиопоэтин-1 экспрессируется муральными клетками и считается, что он стабилизирует сосуд за счет регуляции «покоя» ЭК. Ангиопоэтин-2 в основном секретируется ЭК в местах активного ремоделирования сосудов и может проявлять про- или анти-ангиогенную активность в зависимости от концентрации VEGFA: в присутствии VEGFA ангиопоэтин-2 нарушает стабильность сосудов и стимулирует открепление перицитов, способствуя тем самым ангиогенезу; при низких концентрациях VEGFA он активирует апоптоз и дегенерацию сосудов [9]. Мы впервые показали, что экспрессия ANGPT2 активируется Notch-зависимо в МСК во время сокультивирования с HUVEC. Возможно, это дополнительный механизм увеличения ангиопоэтина-2 при активации ангиогенеза, что требует дальнейшего исследования.

При анализе вклада системы Notch в регуляцию экспрессии участников неканонической сигнализации мы обнаружили, что при контактном сокультивировании в МСК происходило Notch-зависимое увеличение экспрессии субъединицы интегрина b3 в совместной культуре, который является структурной единицей интегринов avb3 и avb5 — важных участников ремоделирования ВМ. Мы также наблюдали увеличение экспрессии SDC2 (синдекана-2) в МСК в ко-культуре. Благодаря наличию углеводных групп гепаринсульфата синдекан-2 действует как сигнальный узел, связываясь с фибронектином, цепями ламинина α4 и α5, интегринами, факторами роста [12], TGF-b [13] и Notch3 [14], тем самым запуская неканоническую Notch-сигнализацию.

Взаимосвязь между интегринами и TGF-b при ремоделировании тканей хорошо известна. Данные литературы позволяют предположить, что TGF-b и Notch также могут участвовать в перекрестных взаимодействиях [5]. Мы обнаружили повышение экспрессии TGFB1 и TGFB3 в МСК Notch-зависимым образом (см. рис. 2, д).

Далее мы обнаружили Notch-зависимое повышение экспрессии PDGFRB в МСК в ко-культуре, в то время как экспрессия PDGFRA повышалась только при непрямом бесконтактном сокультивировании (см. рис. 2, д). Повышение PDGFRB указывает на перестройку клеточного фенотипа МСК в сторону усиления сигнала от ростового фактора PDGF-BB, секретируемого HUVEC. Стоит отметить, что экспрессия VEGFA в ко-культуре достоверно падала в 0,61±0,14 раза. А повышение экспрессии VEGFA в МСК при бесконтактном сокультивировании, вероятно, отражает стимуляцию хемотаксиса HUVEC к МСК посредством паракринных взаимодействий — самой начальной стадии ангиогенеза непосредственно перед тем, как клетки вступают в физический контакт.

Суммируя все приведенные выше данные о Notch-зависимой регуляции ангиогенез-ассоциированных белков и наши предыдущие данные [2, 6, 15], мы можем заключить, что эндотелиальные клетки посредством активации Notch-сигнализации в МСК модулируют их проангиогенные свойства, что в перспективе может способствовать не только инициации ангиогенеза, но и последующей стабилизации образованного сосуда.

Заключение

Уникальность нашей работы заключается в исследовании более ранних этапов межклеточных взаимодействий, исключающих вклад внеклеточного матрикса, тогда как другие исследователи изучали межклеточную Notch-коммуникацию в присутствии матрикса (более поздние этапы сокультивирования, или добавление матрикса извне).

Исходя из полученных данных, мы можем предположить следующий механизм инициации ангиогенеза при взаимодействии ЭК и МСК: взаимодействие ЭК с МСК начинается через Jagged1 на ЭК (рис. 3), согласно данным, полученным R. Breikaa и соавт. на модели мышей с выключенным геном JAG1 в эндотелиальных клетках [16]. Далее происходит запуск передачи сигналов Notch в МСК, на что указывает активация генов-мишеней Notch — HES1, HEY1, HEY2. Это в свою очередь приводит к повышению экспрессии элементов Notch JAG1, Notch1 и Notch3 в МСК, тем самым перестраивая МСК под фенотип, способствующий ангиогенезу и последующей стабилизации формируемого сосуда. Кроме того, в МСК Notch запускает экспрессию факторов, способствующих инициации ангиогенеза, — ANGPT2, TGFB1 и TGFB3, стабилизирующих отрастающие сосуды — интегрина b3 и эфринового лиганда ephrin-B2, а также SDC2, являющегося связывающим сигнальным узлом, объединяющим элементы Notch, интегрины, ростовые факторы и ВМ.

Рис. 3. Предлагаемое схематическое изображение взаимодействия ЭК и МСК на начальной стадии ангиогенеза.

Взаимодействие ЭК с МСК начинается через Jagged1 на ЭК, запускающего передачу сигналов Notch в МСК, это приводит к повышению экспрессии Jagged1, Notch1, Notch3, ephrin B2 в МСК, тем самым перестраивая МСК под проангиогенный фенотип. Запуск ангиогенеза схематически изображен в виде приобретения ЭК фенотипа лидирующей клетки сосудистого отростка.

Наши результаты имеют перспективы трансляции в клинику для разработки метода повышения локального ангиогенеза посредством генной модификации МСК, повышающей экспрессию внутриклеточного сигнального домена Notch-рецептора NICD в тканеинженерных конструкциях на основе МСК. Гиперэкспрессия NICD приведет к конститутивно активной Notch-сигнализации и гипотетическому переключению фенотипа МСК в проангиогенный.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект №21-15-00327.

Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation №21-15-00327.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.