Введение

В патогенезе многих хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые, особое место занимает эндотелиальная дисфункция, предшествующая развитию клинических проявлений болезни [1]. Среди множества причин развития дисфункции эндотелия особое место занимает хроническое воспаление, в том числе латентное микрососудистое воспаление, при котором клетки эндотелия подвергаются воздействию провоспалительных факторов, нарушающих их функции [2]. Несмотря на то что роль воспаления в развитии дисфункции эндотелия изучается уже достаточно давно, многие вопросы, касающиеся молекулярных механизмов воздействия отдельных цитокинов на клетки эндотелия, остаются открытыми, в частности, особенности воздействия факторов воспаления на ангиогенные свойства эндотелиальных клеток (ЭК), важные для репаративного ангиогенеза — способности организма к формированию новых сосудов в условиях ишемии. Эндотелиальная дисфункция, как правило, сопровождается нарушением ангиогенного потенциала клеток эндотелия, являющегося важной частью регенеративного потенциала ткани, в том числе сердца. На данный момент механизм влияния хронического воспаления на ангиогенез до конца не изучен. Необходимо также подчеркнуть, что хроническое латентное воспаление является причиной развития микрососудистого воспаления в сосудах сердца, приводящего к развитию периваскулярного фиброза через активацию эндотелиально-мезенхимального перехода (ЭнМП) [3]. В сердце ЭнМП был впервые описан в эмбриогенезе как процесс, при котором ЭК эндокардиального слоя приобретают мезенхимальный фенотип и мигрируют в сердечный гель (cardiac jelly) [4]. В ряде работ показана роль ЭнМП в развитии диффузного фиброза сердца, приводящего к диастолической дисфункции и сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса [5—7].

Основными провоспалительными цитокинами, играющими особую роль в развитии хронического воспаления, являются фактор некроза опухоли альфа (TNF-a) и интерлейкин-1b (IL-1b). На разных типах ЭК была показана индукция ЭнМП провоспалительными цитокинами, включая TNF-a и IL-1b [8, 9, 10]. Однако сравнительных исследований воздействия этих цитокинов на ангиогенные свойства, экспрессию генов и внутриклеточную сигнализацию в клетках эндотелия не проводилось.

Материал и методы

Выделение клеток и их культивирование

Иммортализованная линия клеток МСК, полученных из жировой ткани человека (ASC52telo, ATCC SCRC-4,000), была получена от ATCC (США). МСК культивировали в среде DMEM (Servicebio, Китай) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Cytiva, США) и пенициллином/стрептомицином (Панэко, Россия) при 37 °С и 5% CO₂.

Эндотелиальные клетки пупочной вены (HUVEC) были любезно предоставлены О.А. Антоновой из лаборатории клеточной адгезии ФГБУ «НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России. Все процедуры, выполненные с образцами тканей доноров, соответствовали Хельсинкской декларации и были одобрены локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России, протокол 274 от 29.11.21. HUVEC культивировали в среде EGM-2 (Lonza, Швейцария) при 37 °С и 5% CO₂. В экспериментах использовали клетки 3—6-го пассажа. В каждом эксперименте использовали не менее 3 биологических повторов (по 1 донору на повтор).

Воздействие TNF-a и IL-1b на монокультуру HUVEC

Клетки HUVEC культивировали в течение 2 или 4 дней в присутствии 10 нг/мл TNF-a (Elabscience, США) или IL-1b (Elabscience, США). В работе использовались концентрации, превышающие физиологические концентрации цитокинов в кровотоке, что может быть ограничением в прямой экстраполяции результатов на процессы in vivo. Однако мы приняли во внимание, что локальные концентрации IL-1b и TNF-a, высвобождаемые клетками воспаления в клеточное микроокружение, могут значительно превышать физиологические концентрации цитокинов в кровотоке [11]. В контрольные клетки добавляли равное количество буфера, в котором были растворены цитокины. Изображения клеток получали с помощью микроскопа Image Exfluorer (LCI, Корея). Среду меняли на свежую каждые 2 дня. Оценку длины и ширины клеток проводили в программе ImageJ (NIH, США).

Иммунофлюоресцентное окрашивание

Клетки фиксировали в 4% растворе формалина, часть образцов подвергали пермеабилизации в 0,1% Тритоне X-100. Окрашивание проводили с помощью антител на CD31 (BioLegend, США) и фаллоидина (ThermoFisher Scientific, США); ядра окрашивали DAPI (Merck KGaA, Германия). Визуализацию окрашивания проводили на конфокальном микроскопе Stellaris 5 (Leica, Германия).

Модель 2D сокультивирования HUVEC и МСК

Ранее мы показали, что HUVEC способны образовывать капилляроподобные структуры только в присутствие МСК [12]. Сокультивирование проводили, как описано нами ранее [12]. Вкратце, HUVEC и МСК высевали в виде монокультур или совместных культур при общей плотности 6·10⁴ клеток/см² и культивировали в течение 48 ч в среде EGM-2 (Lonza, Швейцария). Перед посевом HUVEC предварительно окрашивали 5 мкМ флюоресцентным красителем CellTracker Green CMFDA (ThermoFisher Scientific, США). Клетки сокультивировали в присутствии или в отсутствие провоспалительных факторов IL-1b или TNF-a. В контрольные клетки добавляли равное количество буфера, в котором были растворены цитокины. Изображения клеток получали с помощью микроскопа Image Exfluorer (LCI, Корея). Оценку длины, сформированной капилляроподобной сети проводили с помощью машинного обучения с применением модуля Segment.ai программного обеспечения NIS-Elements (Nikon, Япония).

Анализ внутриклеточной сигнализации в ответ на TNF-a и IL-1b

HUVEC высаживали в количестве 4 млн на 150 мм чашку Петри в среде EGM-2 (Lonza, Швейцария). На следующий день проводили депривацию заменой среды на бессывороточную EBM-2, содержащую 0,1% человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в течение 4 ч. Затем к клеткам добавляли рекомбинантный IL-1b (Elabscience, США) или TNF-a (Elabscience, США) до конечной концентрации 10 нг/мл на 15 мин. Последующие процедуры проводили на льду. Клетки два раза промывали DPBS и лизировали с помощью лизис-буфера, содержащего ингибиторы протеаз (Servicebio, Китай). Лизаты откручивали 10 мин 13 000 g. Концентрацию сумарного белка в лизате измеряли с помощью Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, США). Внутриклеточную сигнализацию оценивали с помощью набора, который позволяет определить относительные уровни фосфорилирования 36 различных киназ, Human Phospho-Kinase Array Kit (R & D Systems, США) в соответствии с руководством производителя. Мембраны фотографировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL-3500.WL (Франция). Данные обрабаты вали в программе ImageJ (NIH, США) с использованием плагина Protein Array Analyzer (NIH, США).

Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

Клетки из контактных совместных культур разделяли с помощью магнитной селекции на бусах Dynabeads CD31 (ThermoFisher Scientific, США). Чистота выделения составляла 100%. Тотальную РНК выделяли из HUVEC, из монокультур или совместных культур с помощью RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США). Синтез кДНК первой цепи и ПЦР в реальном времени проводили, как описано ранее [13]. В работе использовали последовательность праймеров, указанных ранее [13]. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывали по методу 2-ΔΔCt относительно уровня мРНК ACTB (бета-актин).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость различий между значениями определяли с помощью дисперсионного анализа (One-way ANOVA) с поправкой Tukey’s для множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В данной работе мы оценивали воздействие TNF-a и IL-1b на ЭК, полученные из пуповины человека (HUVEC).

Мы обнаружили, что TNF-a и IL-1b приводят к изменению морфологии клеток в более вытянутый фенотип (рис. 1, а, б, в). При этом TNF-a вызывал формирование более вытянутой формы в 1,39±0,42, а IL-1b в 1,63±0,31 раз в отличие от контроля (без добавления цитокинов) (рис. 1, г). Ширина клеток при этом уменьшалась при действии TNF-a в 1,70±0,13, а при действии IL-1b — в 1,89±0,18 раз (рис. 1, д). Такое изменение морфологии свидетельствует о приобретении клетками мезенхимоподобного фенотипа, причем действие IL-1b было более выражено. Кроме того, флуоресцентное окрашивание показало, что действие TNF-a и IL-1b снижало содержание CD31 (рис 2, а, б, в) и приводило к формированию стресс-фибрилл (рис. 2, г, д, е), что в совокупности говорит о приобретении клетками мезенхимального фенотипа. При исследовании влияния TNF-a и IL-1b на профиль экспрессии генов мы обнаружили, что уже через 2 дня стимуляции IL-1b наблюдалось повышение экспрессии мРНК генов, относящихся к ЭнМП (SNAI1, TWIST1 и TWIST2), в то время как TNF-a повышал экспрессию только TWIST2 (рис. 3). Экспрессия эндотелиальных маркеров PECAM1 (CD31) и VWF (фактор фон Виллебранда) снижалась через 2 дня после воздействия обоих факторов, а экспрессия CDH5 (VE-кадгерин) снижалась только после воздействия IL-1b (см. рис. 3). Таким образом, IL-1b в большей степени способствует мезенхимальной трансформации ЭК за счет более выраженного воздействия на экспрессию генов, контролирующих ЭнМП и фенотип клеток эндотелия.

Рис. 1. Влияние IL-1b и TNF-a на морфологию клеток HUVEC.

HUVEC культивировали 4 дня в присутствии или в отсутствие IL-1b и TNF-a. Репрезентативные световые фотомикрографии монослоя клеток HUVEC в а — контроле и при добавлении б — TNF-a или в — IL-1b; г — гистограмма зависимости длины; д — гистограмма зависимости ширины HUVEC от воздействия IL-1b и TNF-a. *p<0,05, **p<0,005.

Рис. 2. IL-1b и TNF-a запускают ЭнМП в HUVEC.

HUVEC культивировали 4 дня в а, г — отсутствие или присутствие б, д — TNF-a; в, е — IL-1b; а–в — репрезентативные изображения иммунофлюоресцентного окрашивания HUVEC на маркер ЭК (CD31); г–е — иммунофлюоресцентного окрашивания HUVEC на фаллоидин. Ядра окрашены DAPI.

Рис. 3. Изменение экспрессии мРНК в HUVEC в ответ на TNF-a и IL-1b.

Тепловая карта экспрессии мРНК генов, ассоциированных с ЭнМП, через 2 и 4 дней после стимуляции а– TNF-a, б — IL-1b. Данные нормированы на контроль 2 и 4 день соответственно.

Далее мы оценили влияние цитокинов на экспрессию генов, связанных с регуляцией ангиогенеза. Воздействие на экспрессию рецепторов к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) — главному фактору, стимулирующему ангиогенез, — оказалось различным. TNF-a через 2 дня снижал экспрессию рецепторов 1 типа FLT1 (VEGFR1), которая к 4 дню возвращалась к исходному значению, а IL-1b через 4 дня повышал экспрессию FLT1 и рецептора 2 типа KDR (VEGFR2) (см. рис. 3). Оба фактора снижали экспрессию APLN (апелин), белка, ассоциированного с пролиферацией ЭК. Интересно, что оба цитокина повышали через 2 дня экспрессию PDGFB, который отвечает за привлечение муральных клеток [14] к образующемуся сосуду, однако к 4 дню его экспрессия снижалась до исходного уровня. Таким образом, мы наблюдали различное действие TNF-a и IL-1b на экспрессию генов, регулирующих ангиогенные свойства ЭК.

TNF-a и IL-1b опосредуют свое действие через сигнальный путь NF-κB, который считается главным регулятором воспалительного ответа [15]. Однако установленные различия в воздействии цитокинов на экспрессионный профиль ЭК позволяют предположить активацию других факторов транскрипции, участвующих в проведении сигналов от TNF-a и IL-1b.

Для проверки этого предположения мы провели скрининг активации фосфорилирования (фосфоформ) белков и транскрипционных факторов нескольких сигнальных путей в монокульуре HUVEC за 15 минут воздействия TNF-a и IL-1b. Мы обнаружили следующие различия: TNF-a в значительной степени активировал фосфорилирование CREB (cAMP response element binding), c-Jun, HSP27, JNK1/2/3, MSK1/2 и подавлял фосфорилирование p53(S15), в тоже время IL-1b активировал фосфорилирование GSK-3b и p53(S46). Оба фактора активировали фосфорилирование ERK1/2, PLC-y1, WNK1, Yes и b-catenin (рис. 4). На основе полученных данных мы представили схему, суммирующую полученные результаты о различиях в действии TNF-a и IL-1b (см. рис. 4, в). Показано, что TNF-a в большей мере по сравнению с IL-1b и контролем активирует CREB (cyclic AMP response element-binding protein). CREB — транскрипционный фактор, контролирующий множество биологических процессов, таких как клеточный рост, дифференцировка, пролиферация, выживание и апоптоз [16]. Известно, что CREB регулирует экспрессию генов, связанных с ангиогенезом [17].

Рис. 4. Внутриклеточная сигнализация в HUVEC в ответ на TNF-a и IL-1b.

а — протеомный профиль фосфоформ киназ в HUVEC в контроле и при стимуляции TNF-a и Il-1b; б — TNF-a и в — Il-1b — схема предполагаемой сигнализации, запускаемой в эндотелиальных клетках.

Мы проверили, как TNF-a и IL-1b воздействуют на способность ЭК к ангиогенезу. Для это мы использовали 2D in vitro модель ангиогенеза в кокультуре HUVEC и МСК (рис. 5, д). Клетки сокультивировали в течение 2 дней в присутствии или в отсутствие цитокинов. Установлено, что оба фактора подавляли способность ЭК формировать капилляроподобную сеть, однако эффект TNF-a был менее выражен, чем эффект IL-1b (уменьшение суммарной длины капилляроподобной сети в 1,33±0,06 vs 1,97±0,08, p<0,05 раз относительно контроля) (рис. 5, а, б). Таким образом, мы показали, что IL-1b оказывал более негативный эффект на способность ЭК к ангиогенезу по сравнению с TNF-a.

Рис. 5. Влияние IL-1b и TNF-a на способность HUVEC формировать трубочки в ко-культуре с МСК.

HUVEC, предокрашенные CMFDA, и МСК со-культивировали в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие TNF-a или IL-1b. Репрезентативные изображения образовавшихся трубочек в а — контроле и при добавлении б — TNF-a и в — Il-1b; г — график зависимости длины капилляроподобной сети образованной HUVEC от внесенных цитокинов; д — схема эксперимента. *p<0,05, **p<0,005.

Заключение

Действие провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1b приводит к мезенхимальной трансформации ЭК и снижению их ангиогенных свойств при более выраженном воздействии IL-1b. Различие в действии TNF-a и IL-1b, вероятно, обусловлены особенностями активации внутриклеточных сигнальных путей в клетках эндотелия сосудов и последующим влиянием на профиль экспрессии генов, регулирующих ангиогенез и эндотелиально-мезенхимальный переход. Полученные результаты могут быть учтены при выборе антицитокиновой терапии.

Финансовая поддержка. Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России №124020700117-3 «Разработка васкуляризированных тканеинженерных конструкций на основе клеточных пластов для стимуляции регенеративных/репаративных процессов в сердце»

Funding. The research was carried out within the state assignment of Ministry of Health Of the Russian Federation Nr#124020700117-3.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.