Число больных с заболеваниями органов гепатопанкреатодуоденальной зоны, сопровождающимися развитием механической желтухи (МЖ) и печеночно-клеточной недостаточностью, продолжает увеличиваться. По данным литературы, при заболеваниях гепатопанкреатодуоденальной зоны обтурационная желтуха возникает в 12,0—25,2% наблюдений. Причиной возникновения МЖ в 50% наблюдений являются камни желчных протоков, в 40% — новообразования протоков, большого сосочка двенадцатиперстной кишки, поджелудочной железы, желчного пузыря, в 10% — стеноз большого сосочка двенадцатиперстной кишки, стриктура протоков желчевыводящих путей или их атрезия, холангит, панкреатит, опухоли печени [1, 3, 7].

На современном этапе развития гепатологии диагностика печеночной недостаточности при МЖ основана на комплексных данных клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования. В клинической практике чаще всего в качестве маркеров используют активность ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), γ-глутамилтрансферазы (ГГТ). Однако общепринятые показатели не всегда отражают глубину поражения печеночной паренхимы и время возникновения патологического процесса [1, 3, 8, 9].

Многообразие классификаций печеночно-клеточной недостаточности, предложенных на основе патофизиологического, анатомического, патоморфологического, биохимического и клинического принципов, не позволяет получить адекватную объективную картину тяжести процесса, затрудняет интерпретацию результатов лечения.

Эритроциты составляют около 25% всех клеток человеческого организма, около половины объема крови взрослого человека приходится на эритроциты. Недооценить роль этих красных клеток сложно, ведь в их составе содержится гемоглобин — белок, ответственный за транспорт кислорода и углекислого газа в организме. Форма эритроцитов, состояние мембраны, давление в клетке, определенные в нативном состоянии, отражают степень поражения организма на клеточном уровне на ранних стадиях заболевания [2, 4, 5]. На современном этапе развития медицины во всем мире для оценки состояния организма используют нанотехнологии. В качестве анализатора «живых» поверхностей к наиболее перспективным относится метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), позволяющий определить не только структуру эритроцита, но и его физико-химические свойства. Результаты научных исследований последних лет убедительно свидетельствуют, что характер изменений липидного бислоя, модификация цитоскелета эритроцита, изменения его физико-химических свойств зависят от вида патологического процесса [2, 6].

Это явилось основой для изучения возможности использования данных АСМ эритроцита в диагностике и прогнозировании развития печеночной недостаточности у больных МЖ.

Цель исследования — разработка модели прогнозирования печеночно-клеточной недостаточности при МЖ разной степени тяжести.

С целью изучения адаптационных реакций организма в зависимости от степени тяжести МЖ нами был проведен эксперимент на 48 минипигах массой 7,05±0,3 кг. Все животные содержались в виварии на стандартном питании со свободным доступом к пище и воде. Манипуляции на животных осуществляли в одно и то же время суток с соблюдением научно-практических рекомендаций по содержанию лабораторных животных и работе с ними, а также в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.).

Регулируемую МЖ моделировали по авторской методике [4]. Оценку степени тяжести МЖ проводили по состоянию животного и биохимическим показателям: уровню билирубина, активности ГГТ, АсАТ, АлАТ.

Корреляцию степени тяжести МЖ человека и животного определяли по соотношению биохимических показателей. Соотношение уровня билирубина у человека и экспериментального животного составило 4:1, ГГТ — 2:1. Соответственно этому корреляционному индексу экспериментальных животных распределили на классы в зависимости от степени тяжести механической желтухи по классификации Э.И. Гальперина [1] и степени печеночной недостаточности по классификации В.А. Вишневского [3].

Экспериментальные животные были разделены на 4 группы. В 1-ю группу вошли 12 животных без оперативного вмешательства, служивших контролем, во 2-ю группу — животные со степенью тяжести МЖ класса А, в 3-ю — класса В и в 4-ю класса С (табл. 1).

Изучение микропрепаратов и их микрофотографирование проводили на микроскопе Olympus ВХ 41. В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, изучали степень выраженности дистрофических, некробиотических, гемодинамических, воспалительных и атрофических изменений.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью компьютерной программы IBM SPSS, версии 22.0.

Описательная статистика результатов исследования для качественных признаков представлена в виде абсолютных значений и процентных долей c ошибками репрезентативности, для количественных — в виде средних арифметических (М) и стандартных ошибок средних (m). Уровень утверждения нулевой гипотезы во всех случаях составлял р<0,05.

Для прогнозирования развития печеночной недостаточности был применен метод дискриминантного анализа. Использовали метод принудительного включения информативных признаков на обучающей выборке с получением решающих правил в виде канонических дискриминантных и линейных классификационных функций. Для проверки гипотезы об однородности ковариационных матриц сопоставляемых групп использовали многомерный М-критерий Бокса. Статистическую значимость мощности дискриминантной функции оценивали c помощью критерия лямбда Уилкса. Для исследуемых групп были вычислены классифицирующие функции Фишера, представляющие собой линейные комбинации дискриминантных переменных.

Линейная модель дискриминантного анализа может быть представлена в следующем виде:

D_j=a_j0+b_ji x_i+…+b_jpx_p ,

где D_j — линейная дискриминантная функция; j — индикатор группы, j=1…, k (k — количество групп); х_i — дискриминантные переменные; i — индикатор переменной, i=1…, р (р — количество дискриминантных переменных); a_j0 — константа; b_ji — коэффициент i-й дискриминантной переменной для j-й группы.

Для классификации единиц наблюдения по признакам одного животного производили расчет линейных дискриминантных функций с коэффициентами каждой из групп. Прогнозируемый случай относили к той группе, для которой дискриминантная функция принимала максимальное значение.

Чувствительность и специфичность модели оценивали с помощью ROC-анализа. Количественную интерпретацию результатов проводили с помощью построения ROC-кривых с оценкой показателя AUC (Area under ROC curve — площадь под ROC-кривой).

У животных со степенью тяжести МЖ класса, А на фоне повышения уровня билирубина и активности ферментов цитоскелет эритроцита имел форму двояковогнутого дискоцита в 80—90% случаев, причем статистически значимых изменений морфологии клетки не выявлено (рис. 1).

У животных с МЖ класса В средние значения билирубина и активность ферментов, отражающих цитолиз, продолжали увеличиваться. Статистически значимо менялась форма эритроцита, он приобретал горизонтальную ориентацию, уменьшалась глубина впадины, появлялись шиповидные выросты на билипидном слое мембраны.

На фоне увеличения степени тяжести МЖ трансформация эритроцита нарастала. У животных со степенью тяжести МЖ класса С прогиб мембраны в центре исчезал, эритроцит приобретал куполообразную форму, увеличивался объем эритроцита, при этом площадь эритроцита практически не менялась.

Во всех группах на основании клинических данных с учетом уровня общего билирубина, показателей цитолиза и альбумин/глобулинового коэффициента были выделены животные с печеночно-клеточной недостаточностью.

Распределение животных с явлениями печеночной недостаточности с учетом степени тяжести МЖ представлено в табл. 2, из

Коэффициенты линейных моделей дискриминантной функции, включающие классификационные признаки, которые характеризуют принадлежность исследуемых животных к группе с наличием или отсутствием печеночной недостаточности, представлены в табл. 3.

D₁=–99,647+0,034x₁ – 0,075x₂+10,320x₃+20,814x₄ – 5,108x₅+0,150x₆+7,053x₇,

D₂=–99,849+0,040x₁ – 0,075x₂+14,558x₃+17,770x₄ – 4,556x₅+0,140x₆+6,742x₇,

где D₁ и D₂— классифицирующие линейные дискриминантные функции; х₁—x₇ — значения предикторов (см. табл. 2).

Чувствительность этой модели составила 94,1%, специфичность — 74,2%. Общее количество корректных предсказаний 81,3%. На основании применения этой модели была построена ROC-кривая (рис. 2).

При оценке абсолютного значения нормированных коэффициентов канонической дискриминантной функции было установлено, что наибольший вклад в результат классификации из оцениваемых признаков вносили значения АлАТ (мкмоль/л), АсАТ (мкмоль/л) и объема эритроцитов (мкм³). Корреляция, описывающая меру связи между дискриминирующей функцией и группами наблюдений, составила 0,699, что объясняет 69,9% дисперсии исходных переменных (р<0,001).

Для подтверждения прогноза у экспериментальных животных с разными классами МЖ выполняли биопсию печени и сопоставляли данные биохимического и гистологического исследований с данными АСМ. В качестве примера может быть приведен следующий случай.

Животное 1. Длительность М.Ж. 7 дней, билирубин 20 мкмоль/л, ГГТ 302 ЕД/л, АлАТ 2,73 мкмоль/л, АсАТ 2,5 мкмоль/л, площадь эритроцита 27,12 мкм², глубина впадины 10 нм, объем эритроцита 10,94 мкм³.

При расчете значений линейных дискриминантных функций D₁=92,4; D₂=94. Поскольку D₂>D₁, в данном случае у животного прогнозируется печеночная недостаточность.

Данные гистологического исследования печени (рис. 3).

Следовательно, гистологическое исследование печени иллюстрирует точность предсказания печеночной недостаточности по дискриминантной модели.

Мы считаем, что комплексная оценка функционального состояния печени и АСМ эритроцитов крови позволяют определить глубину поражения печеночной ткани без инвазивных методов исследования, выявить пациентов с риском развития острой печеночной недостаточности, своевременно назначить персонализированную профилактическую терапию.

Таким образом, предложенный метод атомно-силовой микроскопии эритроцитов в совокупности с биохимическими показателями позволяет с высокой точностью прогнозировать развитие печеночной недостаточности при механической желтухе разной степени тяжести. Эритроцитарным мембранам присущи общие принципы организации биологических мембран, поэтому эритроциты удобно использовать в качестве теста, отражающего морфогенез развития острой печеночной недостаточности на ранних ее стадиях, и теста эффективности используемых методов лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

e-mail: gs7@mail.ru