Введение
Сифилис является важной проблемой здравоохранения мирового масштаба. Несмотря на принимаемые профилактические противоэпидемические меры, сифилитическая инфекция остается причиной большого числа серьезных нарушений здоровья, вплоть до стойкой инвалидизации и летальных исходов.
Однако понимание механизмов патогенеза сифилиса значительно отстает от других распространенных бактериальных заболеваний, что связано с особенностями возбудителя, не позволяющими применять традиционные методы изучения бактерий [1, 2]. Развитие представлений об особенностях взаимодействия организма инфицированного человека и патогена, особенно предрасполагающих к возникновению серьезных осложнений, необходимо для разработки лечебных и диагностических стратегий.
Ранее в исследованиях мы установили участие В1-клеток в иммунном ответе при сифилисе, сопровождающееся синтезом антител к окисленным липопротеинам низкой плотности (анти-окЛПН) [3]. Анти-окЛПН активно изучали при различных неинфекционных заболеваниях, особенно при атеросклерозе и непосредственно связанных с ним патологиях, таких как болезнь коронарных артерий, ишемический инсульт, кальцифицирующий стеноз аортального клапана. Показана также их вовлеченность в патогенез при заболеваниях, связанных с гипертензией, сахарном диабете, неалкогольной жировой болезни печени, отдельных видах болезней почек, крови, онкологических и аутоиммунных заболеваний [4—7].
Присутствие в циркуляции этих антител отражает происходящие в организме процессы окислительной модификации липопротеинов низкой плотности с превращением их в иммунологически активную форму, распознаваемую иммунокомпетентными клетками, что считается центральным звеном патогенеза атеросклероза. Известно о наличии ассоциации атеросклероза с различными инфекционными агентами (Chlamydia pneumonia, Porphyromonas gingivalis, Helicobacter pylori, influenza A virus, hepatitis C virus) [8]. Однако нет публикаций, освещающих работы по изучению анти-окЛНП на разных стадиях инфекционной болезни и в динамике терапии. Связь анти-окЛНП с сифилитической инфекцией установлена лишь недавно [3], и их клиническая значимость неизвестна.
Цель исследования — изучение закономерностей продукции анти-окЛНП при сифилитической инфекции, их клинических и лабораторных ассоциаций и изменения под влиянием терапии сифилиса.
Материал и методы
В исследование включены 154 пациента, получавшие терапию по поводу сифилиса в Уральском НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии (Екатеринбург) в 2008—2022 гг., из них 57 больных находились под динамическим наблюдением.
Критерии включения в исследование: наличие полноценных анамнестических данных об основном заболевании; для ранних форм — манифестная форма заболевания; для поздних форм — выполнение диагностической пункции при установлении диагноза, наличие заключений кардиолога, невролога, офтальмолога, данных эхокардиографического исследования; для динамического наблюдения — отсутствие данных, свидетельствующих о реинфекции.
После выполнения стандартных тестов, утвержденных приказами Министерства здравоохранения РФ для диагностики сифилиса, остатки биологических образцов аликвотировались и хранились при температуре –80°C. После завершения процесса набора образцы подвергли исследованию.
Для исследования содержания анти-окЛНП в крови были использованы коммерческие наборы IMTEC-oxLDL-Antibodies Ig(GM) производства Human GmbH (Германия). Контрольную группу составили 14 человек из числа серонегативных по сифилису лиц. Верхний предел референтного интервала, установленный производителями (30 Ед/мл), был скорректирован с учетом максимального значения, полученного у лиц контрольной группы (37 Ед/мл).
Материалом для исследования также являлись клинико-анамнестические и серологические данные, результаты обследования и консультаций специалистов, взятые из первичной медицинской документации. Помимо стандартных тестов ликвородиагностики (подсчета числа лейкоцитов, исследования уровня белка, нетрепонемных и трепонемных тестов) в качестве дополнительных использовали показатели концентрации CXCL13 (Merck Millipore, Cusabio, США) и интратекального синтеза иммуноглобулинов (BN Prospec, Siemens, Германия).
Сравнения качественных признаков проводили с помощью критериев χ2 или Фишера, количественных — с помощью t-критерия или U-критерия Манна—Уитни с корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Бонферрони. Для сравнения связанных выборок использовали парный t-критерий или критерий Уилкоксона. Для оценки взаимосвязей применяли логистическую регрессию. Для всех статистических критериев ошибку первого рода устанавливали равной 0,05. Нулевую гипотезу (отсутствие различий) отвергали, если вероятность (p) не превышала ошибку первого рода.
Результаты
На рис. 1 представлены сравнительные данные по содержанию анти-окЛНП в крови у больных различными формами сифилиса.
Рис. 1. Антитела к окисленным липопротеинам низкой плотности (GM) в крови у больных различными формами сифилиса.
Слева: уровень антител, Ед/мл, красная линия — верхний предел референтного интервала значений. Справа: частота положительных результатов. ПС — первичный сифилис (n=24), ВС — вторичный сифилис (n=37), ПСС — поздний скрытый сифилис, включая неуточненный сифилис (n=14), ПСС` — поздний скрытый сифилис с кардиоваскулярными проявлениями (n=8), НС — нейросифилис (n=30), СР-Л — серорезистентный латентный сифилис (n=24), СР-НС — нейросифилис у пациентов с серорезистентностью (n=17).
Пациенты с ранними формами отличались наиболее высокими величинами данного показателя. Уже на стадии первичного сифилиса у значительной части пациентов наблюдалось увеличение содержания анти-окЛНП, при этом каких-либо ассоциаций с особенностями клинических проявлений (таких как вид, локализация, количество шанкров, наличие регионального склераденита, реакции обострения) не обнаружено. Значения у больных вторичным сифилисом даже при множественном сравнении отличались от таковых при всех других формах более высокой частотой повышенных значений и большей интенсивностью синтеза анти-окЛНП (p<0,0023). Только у 3 пациентов показатели не превышали нормальных значений: у 1 пациента с широкими кондиломами и лейкодермой (35 Ед/мл), у 1 пациента с ранним менинговаскулярным нейросифилисом (34 Ед/мл), у 1 пациента с асимптомным нейросифилисом с проявлениями в виде симптома Пинкуса (15 Ед/мл). У 3 других пациентов ранним нейросифилисом отмечены повышенные значения анти-окЛНП: у 1 пациента с психиатрической симптоматикой (168 Ед/мл), у 1 пациента с офтальмологической симптоматикой (увеит) (67 Ед/мл), у 1 пациента без симптомов (67 Ед/мл).
У пациентов с впервые выявленными поздними формами наблюдалось снижение как частоты, так и выраженности продукции анти-окЛНП. При этом не получено достоверных отличий показателя в зависимости от наличия признаков поражения центральной нервной системы и сердечно-сосудистой системы.
Еще более низкие и преимущественно нормальные значения анти-окЛНП наблюдали у больных поздними формами сифилиса с наличием терапии по поводу ранних форм сифилиса в анамнезе. Показатели у пациентов с серорезистентностью также не различались в зависимости от выявления у них нейросифилиса.
У 86 пациентов с поздними формами изучена связь между уровнем анти-окЛНП в крови, наличием клинической симптоматики, согласующейся с нейросифилисом и лабораторным подтверждением нейросифилиса (из расчета исключены 7 больных с выраженными сердечно-сосудистыми проявлениями и состоянием после оперативных вмешательств на сердце, которым не выполняли диагностическую пункцию). Клинические проявления наблюдались у 35 пациентов, в том числе головная боль — у 3 пациентов, головокружение — у 3 пациентов, атрофия зрительного нерва — у 1 пациента, потеря слуха — у 3 пациентов, поражение лицевого нерва — у 1 пациента, цереброваскулярные инциденты — у 16 пациентов, когнитивные/эмоционально-личностные/психотические расстройства — у 13 пациентов, нарушение речи — у 3 пациентов, нарушение походки — у 3 пациентов, расстройство чувствительности — у 2 пациентов, расстройство тазовых функций — у 2 пациентов. Патологические изменения в ликворе установлены у 48 пациентов, которые в 23 случаях удовлетворяли критериям подтвержденного нейросифилиса, в 16 случаях — критериям возможного нейросифилиса и в 9 случаях — только дополнительным критериям.
У пациентов с лабораторно установленным нейросифилисом наблюдалась ассоциация клинических проявлений с более высоким уровнем анти-окЛНП, отсутствующая у пациентов с нормальным ликвором (рис. 2).
Рис. 2. Взаимосвязь уровня антител к окисленным липопротеинам низкой плотности (GM) в крови и клинических и лабораторных проявлений, согласующихся с нейросифилисом, у больных поздними формами сифилиса (n=86).
С учетом возможного влияния на возникновение клинических симптомов других вмешивающихся факторов методом логистической регрессии выполнена оценка связи не только с анти-окЛНП, но и с другими клиническими и лабораторными характеристиками пациента. Результаты представлены в таблице. При одновариантном анализе для проявления клинических симптомов оказались значимыми следующие факторы: повышенный уровень анти-окЛНП, наличие патологических изменений ликвора, отсутствие специфической терапии в анамнезе, возраст мужчин более 40 лет, возраст женщин более 50 лет. При многовариантном анализе фактор анти-окЛНП сохранил свою значимость наряду с факторами терапии и состояния ликвора.
Оценка связи между анти-окЛНП в крови и клиническими симптомами, согласующимися с нейросифилисом, с контролем влияния сопутствующих факторов у 99 больных поздними формами сифилиса
| Переменная | Анализ | |||
| одновариантный | многовариантный* | |||
| ОШ (95% ДИ) | p | ОШ (95% ДИ) | p | |
| Анти-окЛНП, GM (уровень) | 1,0 (1,0—1,1) | 0,00 | # | |
| Анти-окЛНП, GM (повышен против норма) | 3,9 (1,7−9,3) | 0,00 | 3,8 (1,2—12,0) | 0,02 |
| Патология ликвора (да против нет)§ | 8,1 (2,9—23,2) | 0,00 | 8,1 (2,4—26,9) | 0,00 |
| Терапия сифилиса в анамнезе (нет против да) | 4,9 (1,9—12,7) | 0,00 | 4,9 (1,6—15,3) | 0,01 |
| РМП/RMP (>1:4 против ≤1:4) | 2,1 (0,9—4,9) | 0,08 | # | |
| РМП/RMP (>1:16 против ≤1:16) | 1,2 (0,4—3,4) | 0,76 | # | |
| Возраст, годы (муж.: >40 против ≤40; жен.: >50 против ≤50) | 2,5 (1,1—5,9) | 0,03 | # | |
| Пол (мужской против женский) | 1,9 (0,7—4,6) | 0,19 | # | |
| ВИЧ-инфекция (положит. против отриц.) | 1,8 (0,3—9,5) | 0,48 | # | |
Примечание. ОШ — отношение шансов, ДИ — доверительный интервал, РМП — реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном, * — пошаговый метод, # — переменные, не включенные в многовариантный анализ, § — информация была доступна только для 86 пациентов.
Изучена связь между анти-окЛНП и результатами реакции микропреципитации (РМП) в крови при ранних и поздних формах сифилиса (рис. 3). При ранних формах сифилиса отмечено статистически значимое увеличение содержания анти-окЛНП при переходе от серонегативности к позитивации (низким титрам) и от низких (2+ — 1:4) титров РМП к высоким (≥1:32), Me (Q1; Q3): 1:34 (22; 38) против 1:70 (35; 102) (p=0,027) и 1:70 (35; 102) против 1:131 (75; 188) (p=0,003), тогда как при поздних формах такое нарастание отсутствовало и значения анти-окЛНП существенно не различались.
Рис. 3. Взаимосвязь уровня антител к окисленным липопротеинам низкой плотности (GM) и титров РМП в крови у больных ранними и поздними формами сифилиса.
Красная линия — верхний предел референтного интервала значений, РМП — реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном.
При динамическом наблюдении у пациентов с ранними формами сифилиса выраженное снижение уровня анти-окЛНП наблюдалось уже к окончанию курса терапии (p=0,006) (рис. 4), при этом у 2 пациентов снизились значения, исходно расцениваемые как нормальные. К моменту последнего из наблюдений только у 2 из 16 пациентов наблюдались высокие значения уровня анти-окЛНП: у одного пациента с симптомной формой раннего нейросифилиса, у которого через 1 год в ликворе, несмотря на значительное снижение, сохранялись высокие уровни цитоза и белка, и у другого пациента, больного вторичным свежим сифилисом с замедленной негативацией РМП.
Рис. 4. Изменение уровня антител к окисленным липопротеинам низкой плотности в крови после лечения у больных ранними формами сифилиса, n=16 (первичный сифилис — 5, вторичный сифилис — 9, вторичный сифилис с нейросифилисом — 2).
Красная линия — верхний предел референтного интервала значений.
У пациентов с поздними формами сифилиса, несмотря на статистически доказанную тенденцию к снижению уровня анти-окЛНП через 1 год и более после окончания полноценных курсов терапии (рис. 5), изменения не были значительными, у 16 больных продолжали сохраняться повышенные значения. В 6 случаях даже отмечен значимый рост показателя (у 2 больных мениговаскулярным нейросифилисом, у 1 больного поздним скрытым сифилисом с инсультом в анамнезе, у 3 пациентов с серорезистентностью).
Рис. 5. Изменение уровня антител к окисленным липопротеинам низкой плотности в крови после лечения у больных поздними формами сифилиса, n=41 (поздний скрытый сифилис — 4, нейросифилис — 25, серорезистентный сифилис — 12).
Красная линия — верхний предел референтного интервала значений.
Обсуждение
В результате проведенного исследования выявлены следующие закономерности:
— при ранних формах сифилитической инфекции активация синтеза анти-окЛНП является неотъемлемой частью иммунного ответа, ассоциирована с процессом диссеминации и быстро прекращается при элиминации возбудителя в ходе специфической терапии;
— при поздних формах сифилитической инфекции активация продукции анти-окЛНП встречается реже, характеризуется меньшей интенсивностью и отсутствием значимого влияния специфической терапии;
— клиническая манифестация специфического воспалительного процесса в центральной нервной системе при поздних формах сифилитической инфекции ассоциирована с более выраженной продукцией анти-окЛНП;
— анти-окЛНП демонстрируют общность антигенных стимулов с антителами, участвующими в РМП, с кардиолипиновым антигеном на ранних стадиях инфекции и различие — на поздних стадиях инфекции.
Индукция синтеза анти-окЛНП является свидетельством наличия значительного числа соответствующих антигенов, а значит, появления в организме больного условий для окислительной модификации липопротеинов низкой плотности. Опубликовано исследование, демонстрирующее, что начиная с первичной стадии сифилитическая инфекция сопровождается значительным окислительным и нитрозативным стрессом [9]. С учетом того, что в иммунной защите против бледной трепонемы основную роль играет реакция гиперчувствительности замедленного типа, реализуемая при поддержке лимфоцитов активированными макрофагами [10, 11], которые используют повреждающие эффекты окислителей с защитной целью, можно предположить связь данного стресса с иммунными процессами. В эксперименте на животных моделях также было продемонстрировано, что имитация острого инфекционного системного воспаления стимулирует синтез окЛНП [12]. Кроме того, известны работы, свидетельствующие о нарушении липидного метаболизма у больных нейросифилисом [13, 14]. Липопротеины могут напрямую участвовать в реализации сосудистого повреждения, так как являются факторами врожденной резистентности, связывая и инактивируя микроорганизмы посредством образования циркулирующих комплексов. При этом связывание с анти-окЛНП может приводить к формированию агрегатов большого размера, способных блокировать vasa vasorum крупных сосудов и приводить к ишемии сосудистой стенки [15].
Анти-окЛНП также были представлены в качестве одного из независимых факторов эндотелий-зависимой сосудистой дисфункции [16]. Биологические причины обусловливают обязательность контакта бледной трепонемы с сосудистым эндотелием, что приводит к его повреждению вследствие как прямого воздействия, так и воздействия, опосредованного иммунными реакциями [17, 18]. Происходящие изменения создают условия для эндотелиальной дисфункции, наблюдаемой у больных сифилисом на ранних стадиях сифилитической инфекции [19].
Повреждение эндотелия и сопутствующее отложение окЛНП в интиме сосудов стимулирует дополнительный приток макрофагов и других иммунокомпетентных клеток. Макрофаги (и относящаяся к ним микроглия центральной нервной системы) имеют большой репертуар рецепторов, распознающих различные виды модифицированных форм ЛНП. И далее в зависимости от соотношения различных факторов реализуется либо провоспалительное, либо противовоспалительное взаимодействие [20].
Участие окЛНП и антител к ним отмечено в патогенезе больших, средних и малых сосудов. Авторы, установившие ассоциацию сифилитической инфекции с более высокой частотой стеноза интракраниальных артерий при ишемическом инсульте, выдвинули предположение, что обусловленные сифилисом воспалительные изменения усугубляют процесс атеросклеротического стеноза [21]. Опубликованы клинические случаи заболеваний с сифилитическим поражением сосудов и ускоренным развитием атеросклероза [22—24].
При изучении патогенеза болезней малых сосудов головного мозга на примере лакунарных инсультов и гипертонической болезни продемонстрирована их связь с анти-окЛНП [25]. Показано, что при развитии микроинсультов пациенты с диагностированным нейросифилисом имели значительно более выраженные признаки болезней малых сосудов головного мозга, ассоциированные с более значительными острыми когнитивными нарушениями, чем аналогичные пациенты, серонегативные по сифилису [26].
Механизмы естественного/врожденного иммунитета, к которым относятся В1-клетки, синтезирующие естественные антитела, в том числе анти-окЛНП, характеризуются быстрым развертыванием в ответ на соответствующие стимулы и быстрым угасанием при исчезновении антигенной стимуляции. Ранее считалось, что факторы врожденной резистентности не обладают феноменом иммунологической памяти и не способны к усилению ответа при повторных воздействиях. Однако в последние годы публикуются доказательства возможности «тренировки» данных механизмов, приводящей к более быстрой и сильной реакции, которая приводит к улучшенной защите при повторных инфекциях, но может сыграть патологическую роль при хронических патологических процессах вследствие длительной стимуляции [27]. Возможно, этим обусловливаются особенности анти-окЛНП при поздних стадиях сифилитической инфекции.
В нетрепонемных тестах, применяемых для диагностики, оценки активности и контроля эффективности терапии при сифилисе, для реакции используется липидная смесь (кардиолипин, холестерин, фосфатидилхолин). Считается, что в этих тестах в основном выявляются антитела к продуктам разрушения клеток организма больного и в меньшей степени к антигенам возбудителя [28]. Согласованность продукции анти-окЛНП и реагиновых антител на ранних стадиях и отсутствие согласованности на поздних стадиях свидетельствуют о том, что антигенная специфичность антител, выявляемых в РМП, может существенно различаться при ранних и поздних формах сифилиса.
Наше исследование имеет ограничения. Во-первых, примененная референтная норма является условной, не учитывающей индивидуальные вариации. Во-вторых, определялись суммарные антитела, тогда как есть данные, свидетельствующие о различной роли антител классов М и G [29]. В-третьих, связь ВИЧ-инфекции с клинической манифестацией поздних форм не была установлена, несмотря на факт наличия окислительного стресса при ВИЧ [30], возможно, это обусловлено небольшой (9%) долей ВИЧ-положительных лиц в анализируемой выборке. Однако эти ограничения не могли существенно повлиять на установленные закономерности и могут быть устранены в дальнейших уточняющих исследованиях.
Заключение
В целом проведенное исследование свидетельствует о значимой роли процессов окислительной модификации липопротеинов низкой плотности в патогенезе сифилитической инфекции, о формировании осложненных форм заболевания и о потенциальной возможности использования показателя анти-окЛНП в качестве биомаркера для оценки ближайших результатов специфического лечения ранних форм сифилиса.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.К. Левчик
Сбор и обработка материала: Н.К. Левчик, В.И. Сурганова, М.В. Пономарева
Статистическая обработка: Н.К. Левчик, М.В. Пономарева
Написание текста: Н.К. Левчик
Редактирование: Н.В. Зильберберг
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.