Введение

Рак шейки матки (РШМ) занимает пятое место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями у женщин в России [1]. Данные по выявляемости РШМ не имеют тенденции к снижению, несмотря на то что данная нозология должна подлежать высокоэффективному и экономически целесообразному скринингу с возможностью ранней диагностики [2]. Главной задачей является обнаружение предопухолевого процесса — цервикальной интраэпителиальной дисплазии (CIN). Легкая дисплазия (CIN1) относится к интраэпителиальным изменениям низкой степени (LSIL) с высокой вероятность регрессии. Истинным предопухолевым состоянием считаются интраэпителиальные изменения высокой степени (CIN2—3, HSIL). Они предшествуют РШМ на протяжении многих лет и даже десятилетий и обладают высокой вероятностью прогрессии в инвазивный процесс [3—5]. В последние годы во всем мире произошел сдвиг в подходе к программам скрининга РШМ от первичного цитологического исследования с окраской по Папаниколау (Пап-теста) к тестированию на ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) с помощью молекулярных методов исследования [6, 32]. Согласно рекомендациям Американского общества по кольпоскопии и патологии шейки матки, а также клиническим рекомендациям, в России наилучшим вариантом скрининга для женщин в возрасте 30—65 лет является совместное использование этих методов, которое позволяет повысить их чувствительность и специфичность в диагностике заболевания [7, 36]. В последнее десятилетие обсуждается внедрение иммуноцитохимического двойного окрашивания p16/Ki-67 в качестве метода стратификации ВПЧ-положительных женщин, а также пациенток с результатами цитологии ASCUS и LSIL [8—10]. Использование данного метода предполагает оптимизацию баланса между чувствительностью и специфичностью клинического скрининга, а также уменьшение количества направлений на кольпоскопию с последующим гистологическим исследованием [11, 12].

Цель настоящего обзора — изучение показателей эффективности иммуноцитохимического исследования p16/Ki-67 в диагностике интраэпителиальных поражений разной степени по сравнению с цитологическим методом и ВПЧ-тестированием.

Принцип метода двойного окрашивания p16/Ki-67. P16INK4a (p16) — ингибитор циклинзависимой киназы 2A (CDKN2A), кодируемый геномом на хромосоме 9p21, является регулятором пути клеточного цикла cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F [12—14]. Он может связываться с CDK4 и CDK6, образующими белковый комплекс с циклином D для фосфорилирования pRB (белка ретинобластомы), в результате чего pRB отделяется от фактора транскрипции E2F1, что ведет к транслокации E2F1 в ядро, где индуцируется транскрипция генов-мишеней, способствующих переходу клетки из фазы G1 в фазу S. Таким образом, p16 является ингибитором CDK и тормозит клеточный цикл [13, 15]. Экспрессия p16 снижается при многих формах рака из-за мутации, делеции гена или гиперметилирования его промотора [16, 17]. Однако в случаях плоскоклеточного интраэпителиального поражения шейки матки высокой степени и карцином, вызванных инфекцией ВПЧ высокого риска, которая способствует неопластической прогрессии за счет действия вирусных онкопротеинов E6 и E7, p16 сверхэкспрессируется. Это обусловлено конкуренцией с протеином Е7 за связывание с белком pRb. Утрата функций pRb ведет к накоплению p16 в клетках через петлю отрицательной обратной связи [18]. Таким образом, экспрессия p16 может использоваться в качестве сурогатного биомаркера ВПЧ-инфекции. Однако окрашивание лишь на p16 в цитологическом препарате ограниченно, поскольку p16 экспрессируется и в нормальных клетках шейки матки.

Ki-67 является ядерным антигеном, который кодируется геном MKI67 на 10-й хромосоме и экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы G0 [19, 20]. В нормальных физиологических условиях его экспрессия ограничена базальным слоем плоского эпителия шейки матки [26]. Соответственно, он служит маркером пролиферации клеток и надежным предиктором прогрессирования ранних интраэпителиальных поражений, поскольку регулирует транскрипцию [21]. Обнаружение Ki-67 широко используется в дополнительной диагностике предрака и рака шейки матки [22].

Коэкспрессия p16/Ki-67 диагностируется с помощью антител против соответствующих антигенов. Положительный контроль на p16 в нормальных клетках определяется как коричневое окрашивание цитоплазмы, а на Ki-67 — как красная ядерная окраска. Коэкспрессия характеризуется отображением обоих сигналов в одной и той же клетке. В нормальном эпителии шейки матки коэкспрессия p16/Ki-67 не регистрируется, так как эти белки имеют обратные функции. Таким образом, совместное присутствие обоих маркеров в одной и той же клетке можно интерпретировать как показатель нарушения регуляции клеточного цикла, вызванного в подавляющем большинстве случаев онкопротеинами ВПЧ высокого онкогенного риска [23—25]. Положительный и отрицательный результаты двойного окрашивания представлены на рисунке.

Рис. а, б — клетки эпителия, негативные в отношении коэкспресии р16/Ki-67; в, г — положительная коэкспрессия р16/Ki-67. CINtec PLUS Cytology, ×20.

Показатели эффективности оценки экспресии p16/Ki-67 у пациенток с ASCUS и LSIL. Согласно исследованию H.A. Katki и совт., пациентки с результатом цитологического исследования ASCUS и LSIL имеют 5-летний риск развития CIN3+, который составляет 2,6% и 5,2% соответственно [27]. Таким образом, важно идентифицировать потенциальный риск формирования HSIL у таких женщин. Предыдущие исследования показали, что p16/Ki-67 может быть использован как инструмент для стратификации риска ВПЧ-позитивных пациенток с поражениями шейки матки низкой степени, они сообщают о высоких значениях чувствительности, аналогичных значениям теста детекции ВПЧ [28—30]. Исследование M. Gothwal и соавт. [31] проводилось с участием 46 женщин. Результат последующей гистологии CIN2 и более тяжелых поражений у пациенток с ASCUS составил 21,42%. При этом вероятность CIN2+-положительных поражений у больных с цитологическим диагнозом LSIL была выше и достигала 33,3%. Чувствительность (Se) и специфичность (Sp) двойного окрашивания составили 100% и 87,5% соответственно. В своей работе D. Das и соавт. проводили последующую стратификацию пациенток с результатами цитологического исследования ASCUS и LSIL с помощью оценки экспрессии p16/Ki-67. Чувствительность и специфичность метода составили 100% и 70% (для результата ASCUS), тогда как для LSIL значения составили 87,5% и 100% соответственно. В данном исследовании распространенность CIN2+ у пациенток с ASCUS и LSIL составила 53% и 58,3% [32].

Напротив, исследование, проведенное S. Aromseree и соавт., показало низкую чувствительность иммуноцитохимического метода [33]. У пациенток с результатом ASCUS (n=21) Se и Sp различных методов составили: тест на ДНК ВПЧ 21 типа — 87,5% и 46,2%, тест на ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) — 50% и 69,2%, p16/Ki-67 — 36,9% и 84,6% соответственно. При комбинации методов показатели остались идентичны. Для случаев LSIL (n=26) Se и Sp различных методов составили: тест на ДНК ВПЧ 21 типа — 87,5% и 84,2%, тест на ДНК ВПЧ ВКР — 50% и 100%, p16/Ki-67 — 29,2% и 100% соответственно. При комбинации методов: тест на ДНК ВПЧ 21 типа совместно с p16/Ki-67 — 25,0% и 100%, тест на ДНК ВПЧ ВКР совместно с p16/Ki-67 — 16,7% и 100%.

Исследование, проведенное в Греции с участием 200 женщин, показало, что среди пациенток с ASCUS и LSIL чувствительность двойного окрашивания p16/Ki-67 составила 90,4% и 95,0% соответственно, что выше по сравнению с тестом детекции ВПЧ ВКР (52,3% и 65,5%). При этом чувствительность метода оказалась выше и в сравнении с кольпоскопическим исследованием. Однако не было статистически значимых различий в специфичности [34].

В своей работе J. Yu и соавт. отобрали 420 случаев ASCUS (n=318) и LSIL (n=102) по результатам цитологического исследования шейки матки. При последующем обследовании у пациенток с ASCUS чувствительность двойного иммуноокрашивания p16/Ki-67 и теста ВПЧ ВКР для диагностики CIN2+ составила 82,6% и 91,3%, а специфичность — 88,8% и 63,7% соответственно. У пациенток с LSIL чувствительность двойного иммуноокрашивания p16/Ki-67 и теста ВПЧ ВКР составила 86,7% и 100,0%, а специфичность — 67,8% и 20,7% [35].

Таким образом, оценка коэкспресии p16/Ki-67 позволяет идентифицировать группу пациенток высокого риска с сопоставимой чувствительностью и более высокой специфичностью по сравнению с тестированием на ДНК ВПЧ. При этом сокращается число пациенток с LSIL, требующих дальнейшего обследования и наблюдения в клиниках с использованием кольпоскопического и гистологического методов исследования.

Показатели диагностической эффективности двойного окрашивания у пациенток с HSIL и ASC-H. Согласно клиническим рекомендациям, в России пациенткам по результатам цитологического исследования HSIL показана кольпоскопия с гистологическим исследованием материала. Иммуноцитохимическое исследование р16/Ki-67 рекомендовано как дополнительный метод дифференциальной диагностики степени тяжести поражения шейки матки [36]. Несмотря на то что в целях повышения чувствительности цервикального скрининга проводится котестирование с совместным использованием детекции ДНК ВПЧ и цитологического метода, тем не менее исследования показали, что более 60% пациенток с HSIL, направленных на кольпоскопию с биопсией или эксцизией, имеют ≤CIN1 по результатам гистологии [37—40]. Необходимы более эффективные стратегии стратификации для повышения точности диагнозов и снижения частоты направлений на инвазивные манипуляции. Такое количество ложноположительных результатов цитологии может быть обусловлено сложностью интерпретации препаратов с низкой частотой воспроизводимости между специалистами в зависимости от опыта. Метод двойного окрашивания р16/Ki-67 позволяет обойтись без морфологической оценки, предполагается, что он может быть реализован с более быстрым обучением и высокой воспроизводимостью результатов [41, 42].

В работе R. Luttmer и соавт. из 446 женщин у 79 (18%) была выявлена CIN3, у 85 (19%) пациенток — CIN2. Для диагностики применяли методы Пап-теста, генотипирования ВПЧ 16/18, их комбинацию и двойное окрашивание p16/Ki-67. В результате получены следующие значения Se и Sp: Пап-тест — 87,7% и 44,9%, генотипирование ВПЧ 16/18 — 75,3% и 56,2%, Пап-тест совместно с генотипированием ВПЧ 16/18 — 95,1% и 25,8%, двойное окрашивание — 93,8% и 51,2%. Аналогично проводили диагностику для CIN2 с определением показателей эффективности методов: Пап-тест — 86,7% и 54,3%, генотипирование ВПЧ 16/18 — 60,8% и 57,1%, Пап-тест совместно с генотипированием ВПЧ 16/18 — 92,2% и 30,4%, двойное окрашивание — 85,5% и 60,0% [44]. Полученные результаты исследования согласуются с данными ряда других авторов, согласно которым специфичность двойного окрашивания p16/Ki-67 для обнаружения CIN2+ выше по сравнению с цитологическим исследованием и тестированием на ДНК ВПЧ [43, 45].

Y. Zhu и соавт. для оценки эффективности методов, включая исследование мРНК белков Е6/Е7 ВПЧ, провели обследование 300 пациенток. В диагностике CIN2 Se и Sp методов составили: для ДНК ВПЧ — 98,2% и 17,5%, для мРНК Е6/Е7 ВПЧ — 87,0% и 42,7%, для p16/Ki-67 — 98,2% и 82,5% соответственно. Аналогично для определения CIN3+: ДНК ВПЧ — 100% и 16,0%, мРНК Е6/Е7 ВПЧ — 88,0% и 39,6%, p16/Ki-67 — 100% и 74,2% соответственно [46].

Однако, согласно данным систематического литературного обзора, показатели специфичности двойного окрашивания для поражений CIN2+ в разных возрастных группах пациенток сопоставимы по сравнению с Пап-тестом и составляют 92,0—96,25% и 92,6—96,3% соответственно [47].

Пациенток с цитологическим заключением атипичных плоских клеток, которые не исключают HSIL (ASC-H), направляют на кольпоскопию с последующим гистологическим исследованием, а также проводят им ВПЧ-тестирование [36]. Однако стратификация таких пациенток с помощью метода р16/Ki-67, возможно, позволит избежать чрезмерного инвазивного обследования и лечения пациенток. Согласно результатам метаанализа по оценке эффективности различных методов при стратификации пациенток с цитологическим заключением ASC-H для выявления CIN2+ и CIN3+, чувствительность теста на выявление ВПЧ ВКР составила 93% и 91% соответственно, специфичность — 45% и 42%. Генотипирование ВПЧ 16/18 типов оказалось менее чувствительным (50%), но более специфичным (74%). Для двойного окрашивания p16/Ki-67 Se и Sp для CIN2+ составили 94% и 50% соответственно [48]. В своей работе Y. Wu и соавт. показали, что специфичность при использовании двойного иммуноокрашивания p16/Ki-67 была выше по сравнению с тестом на ВПЧ ВКР (88,9% против 40,7%) [49].

Заключение

Метод двойного окрашивания имеет высокие показатели чувствительности и специфичности метода и может использоваться как биомаркер в выявлении неоплазий в программах скрининга на основе первичного ВПЧ-тестирования. Данный метод также может быть эффективно использован для уточняющей диагностики степени поражения в дополнение к цитологическому методу. Однако необходим анализ для оценки рентабельности и экономической эффективности данного исследования в программах скрининга РШМ в России.

Финансирование. Работа выполнена в рамках госзадания ИИФ УрО РАН (регистрационный номер НИОКТР 122020900136-4).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Авторы подтверждают, что статья или ее части ранее не были опубликованы.