Опыт разработки наборов реагентов для выявления возбудителей клещевых инфекций методом изотермической амплификации

Комаровский Ю.Ю.

1. ФГБНУ Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный Центр Сибирского отделения РАН»;
2. ООО «Формула гена»

ORCID: 0000-0003-0569-5502

Горбенко А.С.

ORCID: 0000-0001-8756-2660

Васильева Д.И.

ORCID: 0000-0001-9047-5883

Кузнецова Н.Н.

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Красноярском крае» Роспотребнадзора

ORCID: 0000-0001-9693-0795

Оскорбин И.П.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0003-3754-5824

Филипенко М.Л.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0002-8950-5368

Столяр М.А.

ORCID: 0000-0002-8037-9844

Ольховский И.А.

1. ФГБНУ Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный Центр Сибирского отделения РАН»;
2. ООО «Формула гена»;
3. Красноярский филиал НМИЦ гематологии Минздрава России

ORCID: 0000-0003-2311-2219

Опыт разработки наборов реагентов для выявления возбудителей клещевых инфекций методом изотермической амплификации

Авторы:

Комаровский Ю.Ю., Горбенко А.С., Васильева Д.И., Кузнецова Н.Н., Оскорбин И.П., Филипенко М.Л., Столяр М.А., Ольховский И.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Лабораторная служба. 2024;13(2): 30‑38

DOI: 10.17116/labs20241301130

Загрузок: 0

Связаться с автором

Оглавление

Как цитировать:

Комаровский Ю.Ю., Горбенко А.С., Васильева Д.И., Кузнецова Н.Н., Оскорбин И.П., Филипенко М.Л., Столяр М.А., Ольховский И.А. Опыт разработки наборов реагентов для выявления возбудителей клещевых инфекций методом изотермической амплификации. Лабораторная служба. 2024;13(2):30‑38.
Komarovsky YuYu, Gorbenko AS, Vasilyeva DI, Kuznetsova IP, Oskorbin IP, Filipenko ML, Stolyar MA, Olkhovsky IA. Experience in developing reagent kits for identifying pathogens of tick-borne infections using isothermal amplification. Laboratory Service. 2024;13(2):30‑38. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/labs20241301130

Использование инфографики авторами научных работ

Закрыть метаданные

Риск укуса инфицированным клещом определяет необходимость проведения своевременных мер экстренной профилактики. Учитывая статистику случаев присасывания клещей (до 500 тыс. в год) и носительство клещами боррелий (25—50%) и вируса клещевого энцефалита (до 3%), превентивный прием антибиотиков и введение противоклещевого иммуноглобулина без предварительного тестирования клещей несет дополнительные риски развития антибиотикорезистентности и побочных реакций. В связи с этим разработка экспресс-тестов для использования сразу после удаления клеща представляется актуальной задачей. Одним из перспективных методов молекулярно-генетической экспресс-диагностики является петлевая изотермическая реакция (LAMP).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработка набора реагентов для совместной изотермической детекции нуклеиновых кислот возбудителей боррелиоза Borrelia burgdorferi s.l, и Borrelia miyamotoi, а также набора для детекции вируса клещевого энцефалита.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали 178 образцов ДНК и 325 образцов РНК, выделенных из клещей, а также образцы ликвора пациентов. Для постановки LAMP подбирали оптимальный дизайн праймеров и состав реакционной среды. Детекцию продуктов LAMP проводили с использованием интеркалирующих красителей, регистрируя кинетику флюоресцентного сигнала, также использовали варианты визуальной оценки. Сравнительное тестирование методом ПЦР-РВ выполняли с использованием коммерческих наборов АО «Вектор-Бест» и ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Использование разработанного набора «NT MxLAMP BOR+MIY» позволило в одной постановке выявлять ДНК боррелий с пределом аналитической чувствительности к B. burgdorferi s.l., 46 копий/мкл, а к B. miyamotoi — 361 копии/мкл. Набор для выявления вируса клещевого энцефалита «NT LAMP TBEV» продемонстрировал предел чувствительности — 36 копий/мкл. При сравнительных испытаниях все положительные результаты совпали с результатами коммерческих ПЦР-тест-систем, однако относительная чувствительность (78%) набора «NT MxLAMP BOR19+MIY1» уступала результатам, полученным с использованием наборов АО «Вектор-Бест». Дополнительная опция для визуальной оценки результатов реакции позволила определить ДНК возбудителей боррелиоза в клещах и ликворе, в том числе и без предварительного выделения нуклеиновых кислот.

ВЫВОДЫ

Использование разработанных на основе LAMP наборов с высокой специфичностью позволяет выявлять генетические маркеры возбудителей выбранных клещевых инфекций. Вместе с тем для внедрения в практику тестирования Point-of-care необходимо улучшить их чувствительность и адаптировать к использованию с портативными устройствами термостатирования и детекции результатов реакции.

Ключевые слова:

Borrelia burgdorferi s.l

B.Miyamotoi

вирус клещевого энцефалита

LAMP

Авторы:

Комаровский Ю.Ю.

ORCID: 0000-0003-0569-5502

Горбенко А.С.

ORCID: 0000-0001-8756-2660

Васильева Д.И.

ORCID: 0000-0001-9047-5883

Кузнецова Н.Н.

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Красноярском крае» Роспотребнадзора

ORCID: 0000-0001-9693-0795

Оскорбин И.П.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0003-3754-5824

Филипенко М.Л.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0002-8950-5368

Столяр М.А.

ORCID: 0000-0002-8037-9844

Ольховский И.А.

ORCID: 0000-0003-2311-2219

Дата поступления:

29.12.2023

Дата принятия в печать:

16.04.2024

Список литературы:

Рудакова С.А., Теслова О.Е., Муталинова Н.Е., Пеньевская Н.А., Блох А.И., Рудаков Н.В., Савельев Д.А., Кузьменко Ю.Ф., Транквилевский Д.В. Обзор эпидемиологической ситуации по иксодовым клещевым боррелиозам в Российской Федерации в 2013—2022 гг. и прогноз на 2023 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2023;2:75-87. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-2-75-87
Андаев Е.И., Никитин А.Я., Толмачева М.И., Зарва И.Д., Яцменко Е.В., Матвеева В.А., Сидорова Е.А., Колесникова В.Ю., Балахонов С.В. Эпидемиологическая ситуация по клещевому вирусному энцефалиту в Российской Федерации в 2022 г. и прогноз ее развития на 2023 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2023;1:6-16. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-1-6-16
Платонов А.Е. «Новая» инфекция, вызываемая Borrelia Miyamotoi: микробиология, эпидемиология, диагностика, клиника и патогенез. М.: Де’Либри; 2017.
Волчев Е.Г., Перминова Л.А., Красикова Е.А., Карташов М.Ю., Кривошеина Е.И. Оценка риска инфицирования возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов, резервируемых популяциями Ixodidae в Калининградской области. Управляемые и другие социально значимые инфекции: диагностика, лечение и профилактика: Материалы Российской научно-практической конференции с трансляцией в интернет 7—8 февраля 2023 г., Санкт-Петербург. Журнал инфектологии. 2023;15(1):31. Ссылка активна на 28.12.23. https://niidi.ru/adv/rossiyskaya-nauchno-prakticheskaya-konferentsiya-s-translyatsiey-v-internet-upravlyaemye-i-drugie-sotsial-no-znachimye-i/
Мельникова О.В., Лопатовская К.В., Трушина Ю.Н., Адельшин Р.В., Яковчиц Н.В., Андаев Е.И. Десятилетний мониторинг сочетанных природных очагов инфекций, передающихся иксодовыми клещами, в Прибайкалье. Молекулярная Диагностика. Сборник Трудов. АО «Cайенс медиа проджектс»; 2023;242-243.
Холодилов И.С., Белова О.А., Мотузова О.В., Гмыль А.П., Романова Л.Ю., Бойко В.А., Крючков Р.А., Орлова О.Е., Пакскина Н.Д., Шамсутдинов А.Ф., Карганова Г.Г. Оценка зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита с использованием различных методов исследования. Неоднозначность трактовки результатов. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2014;76(3):29-36.
Рудакова С.А., Теслова О.Е., Муталинова Н.Е., Кузьменко Ю.Ф., Штрек С.В., Пеньевская Н.А., Рудаков Н.В. Молекулярно-генетический надзор на основе индикации и идентификации боррелий в иксодовых клещах. Фундаментальная и клиническая медицина. 2023;8(1):63-70. https://doi.org/10.23946/2500-0764-2023-8-1-63-70
Петруша О.А., Файзулоев Е.Б. Методы детекции результатов реакции петлевой изотермической амплификации ДНК. Клиническая лабораторная диагностика. 2020;65(1):67-72. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-1-67-72
Houmansadr F, Soleimani M, Naddaf SR. Development of A Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Detection of Relapsing Fever Borreliae. J Arthropod-Borne Dis. 2020. https://doi.org/10.18502/jad.v14i1.2703
Bhadra S, Esteve-Gasent MD, Ellington AD. Analysis of macerated ticks using Boolean logic gating colorimetric isothermal nucleic acid assays for Lyme Borrelia and Ixodes scapularis ticks. Sci Rep. 2023;13(1):11439. https://doi.org/10.1038/s41598-023-38452-8
Ольховский И.А., Горбенко А.С., Комаровский Ю.Ю., Столяр М.А., Васильева Д.И., Епифанова О.С., Ходов Д.А., Рудакова С.А., Рудаков Н.В., Оскорбин И.П., Филипенко М.Л. Модификация изотермического теста выявления ДНК возбудителей клещевого боррелиоза. Клиническая лабораторная диагностика. 2022;67(1):59-64. https://doi.org/10.51620/0869-2084-2022-67-1-59-64
Патент РФ на изобретение №2763595/30.12.2021. Бюл. №1. Комаровский Ю.Ю., Горбенко А.С., Ольховский И.А., Столяр М.А., Васильева Д.И. Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов. Ссылка активна на 29.12.23. https://new.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2763595&TypeFile=html
Патент РФ на изобретение №2800261/19.07.23. Бюл. №20. Комаровский Ю.Ю., Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А., Васильева Д.И., Кузнецова Н.Н. Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых нейроинфекций. Ссылка активна на 29.12.23. https://new.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2800261&TypeFile=html
«Айвок». Аналитическое и медицинское оборудование. Ссылка активна на 29.12.23.
Зубик А.Н., Рудницкая Г.Е., Евстрапов А.А. Изотермическая петлевая амплификация LAMP в формате микроустройств (обзор). Научное Приборостроение. 2021;31(1):3-43.

Закрыть метаданные