Микоплазмы — мельчайшие бактерии, лишенные клеточной стенки и в силу малого размера генома, целого ряда ферментных систем способные инфицировать и длительно персистировать в организме человека и животных всех классов. Как им это удается? Известны разнообразные механизмы ускользания микоплазм от иммунологического надзора хозяина. Сравнительно недавно было показано, что существует еще один механизм, обеспечивающий микоплазмам, как и другим бактериям, возможность персистенции в организме хозяина — образование биопленки, где микроорганизм защищен гликокаликсом — полисахаридным слизистым слоем, состоящим из компонентов, которые могут быть как синтезированы самими бактериями, так и адсорбированы из среды обитания [1].

Интенсивное развитие современной молекулярно-биологической и электронно-микроскопической методической базы сформировало качественно новый уровень исследований, позволяющий анализировать развитие инфекционного процесса, используя непосредственно клинически доступные биоматериалы от больных. Нами ранее при анализе клинического материала, полученного непосредственно в ходе оперативного вмешательства от больных с мочекаменной болезнью, на наличие, состав и состояние микрофлоры с помощью стандартных микробиологических, молеку-лярно-генетических (полимеразная цепная реакция — ПЦР) и современных микроскопических методов было показано, что у пациентов с мочекаменной болезнью микроорганизмы способны существовать на поверхности мочевых камней в состоянии биопленок [2]. В ходе этих исследований был выявлен широкий спектр микроорганизмов, образующих сложные сообщества на мочевых камнях. При исследовании ультратонких срезов биопленок, полученных с поверхности почечных камней, в составе микробных сообществ были выявлены многочисленные полиморфные структуры (округлые, эллипсовидные, в виде коромысла), окруженные только асимметричной цитоплазматической мембраной, размером от 250 до 400 нм (для округлых форм) и до 800 нм (для извитых). Такая субмикроскопическая организация обнаруженных структур соответствует строению микоплазм.

Наряду с этим установлено, что многие виды микоплазм способны сами формировать биопленку. К таковым относятся M. capricolum, M. putrefaciens, M. bovis, M. yeatsii, M. gallisepticum, M. pullorum, M. pulmonis, M. salivarium и клинические изоляты U. urealyticum и U. parvum [3, 4].

Объектом нашего исследования явилась M. pneumo-niae (Mр) — возбудитель респираторных заболеваний верхних дыхательных путей человека, бронхита, первичной атипичной пневмонии и осложненного течения бронхиальной астмы [5].

Mр обладает способностью активно передвигаться и наделена специальным образованием, которое служит для прикрепления микробной клетки к поверхности и одновременно является ее ведущей частью в процессе движения. Это образование, называемое терминальным («tip»), имеет полусферическую форму (80×125 нм) и содержит электронно-плотную осевую структуру с актиноподобным белком [6]. Колонии Mр адсорбируют на своей поверхности эритроциты млекопитающих и птиц, клетки культуры ткани (HeLa и др.) Для этого вида микоплазм характерна способность к цитадсорбции на клетках респираторного эпителия микроорганизмов [7].

Сорбционные свойства Mр определяют мембранные адгезины гликопротеиновой природы (P1, P2 и др.). Молекулы адгезинов связаны с цитоскелетом, могут направленно передвигаться по поверхности мембраны и концентрироваться в области структуры «tip», что является необходимым условием надежного прикрепления микоплазм. При изучении адгезии было показано, что популяция Mp состоит из клеток с различными адгезивными потенциями. В процессе участвует лишь часть жизнеспособных клеток, хотя присутствие на поверхности микробных клеток адгезинов отмечают для всех клеток популяции. Предполагают, что это может быть связано с топографической организацией адгезинов, и, возможно, существует механизм, обеспечивающий их сборку и активацию [8].

При выращивании в жидкой питательной среде Mp обладает способностью прирастать к влажным твердым поверхностям культуральных сосудов из стекла и пластика, что впервые описано еще в 1967 г. [9, 10]. Механизм этого явления детально не изучен, однако считают, что, как и в случае адсорбции микоплазм на эпителиальных клетках, он определяется мембранными адгезинами. Прикрепление к абиотическим поверхностям в дальнейшем ведет не только к расширению площади слоя микроорганизмов, но и к увеличению его плотности, причем колонии прирастают настолько прочно, что для их снятия требуется механическое воздействие.

Об образовании Mp биопленок опубликовано несколько работ. Так, в 2011 г. J. Kornspan и соавт. показали связь способности Mp расти на абиотических поверхностях с белком P1, так как этот процесс ингибировался анти-P1 поликлональными моноспецифическими антителами. Архитектоника суточной биопленки, сформированной на стекле, описана авторами по результатам сканирующей микроскопии как отдельные «вулканоподобные» структуры, образованные клетками микоплазм, объединенными слоем экзоклеточного матрикса [11].

W. Simmons и соавт. считают, что значительную роль в образовании биопленки Mp играют полисахариды, которые, по общему представлению, составляют часть экзоклеточного матрикса, а обогащение питательной среды каталазой способствует процессу биопленкообразования [12, 13].

Однако для понимания поведения Mp в организме человека и особенностей течения вызываемого ею инфекционного процесса, а также для разработки рациональных методов лечения респираторного микоплазмоза необходимо создание экспериментальной лабораторной модели образования биопленок.

Цель нашей работы — выявление ультраструктурных особенностей образуемой клетками Mp биопленки в динамике.

В работе использовали культуры Mycoplasma pneumoniae Fh, Ureaplasma urealyticum (Uu) из коллекции Лаборатории микоплазм и Л-форм бактерий ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Культуры микроорганизмов выращивали в стеклянных флаконах с жидкой питательной средой и на чашках Петри с 1,3% агаром. Для выращивания культуры использовали коммерческие питательные среды Difco PPLO бульон и агар («Becton, Dickinson and Company», США) с добавлением 20% нормальной сыворотки крови лошади, 1000 ед/мл пенициллина, 1% глюкозы (для Mp) и 1% мочевины (для Uu).

Так как популяция Mp неоднородна по способности расти на абиотической поверхности, проводили селекцию клеток, стабильно растущих на стекле. Для этого сначала делали первичный засев концентрированной взвеси культуры (1×10⁷—1×10⁸ КОЕ/мл), полученной путем смыва колоний, выращенных на агаре, в стеклянный флакон с 100—150 мл бульонной среды. После инкубации флаконов при 37 °C в течение 2—3 дней полученную пленку роста на стеклянной поверхности пассировали 2—3 раза «со стекла на стекло», что давало возможность получить культуру, стабильно растущую на стеклянной поверхности.

Для оценки эффективности формирования пленки Mp на твердой поверхности использовали полистироловые микротитровальные 96-луночные планшеты (фирмы «Costar», США). В лунки планшетов вносили жидкую питательную среду, инокулированную исследуемым микроорганизмом в объеме 150 мкл в разведении 1:10, далее планшет инкубировали при 37 °C в течение 2 и 3 дней. После инкубации из лунок удаляли питательную среду вместе с планктонными клетками микроорганизма и однократно промывали физиологическим раствором. Выросшую в лунках биопленку окрашивали 0,01% спиртовым раствором кристалл-виолета, в течение 45 мин при комнатной температуре. К пленке в лунках планшета добавляли по 200 мкл 96° этилового спирта и оставляли их при комнатной температуре на 45 мин для экстрагирования красителя спиртом. Оптическую плотность окрашенного спирта измеряли на фотометре IEMS, ReaderMF («Labsystems» Швеция) при длине волны 540 нм. Результаты обрабатывали с помощью специальной компьютерной программы [14].

Для изучения ультраструктурной организации биопленки, формируемой Mp при росте на стекле, использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Mp выращивали на поверхности покровных стекол, помещенных в пробирки с инокулированной микоплазмой жидкой питательной средой. После инкубации пробирок при 37 °C в течение 1, 2 или 3 сут покровные стекла с выросшим на них слоем биопленки культуры извлекали из пробирок и фиксировали 10% раствором формалина.

С целью сохранения естественной структуры биопленки, экзоклеточный матрикс которой является ее морфологической и функциональной составляющей, препараты не подвергались сушке в критической точке, что выгодно отличает методику нашего исследования от ранее использованных [11]. Стекла были высушены при комнатной температуре, на их поверхность напылено золото толщиной слоя 5 нм. В ходе работы было использовано следующее оборудование: двулучевой ионно-электронный сканирующий микроскоп Quanta 200 3D («FEI Company», США); модуль для напыления SPI-MODULE Sputter Coater («SPI Supplies», США). Исследование проводилось в условиях высокого вакуума, при ускоряющем напряжении 5,0—10,0 kV. Рабочие увеличения от ×300 до ×40 000.

Данные количественной оценки интенсивности формирования пленки роста Mp в лунках полистироловых планшетов представлены на рис. 1.

В отличие от Mp Uu не растут на абиотических поверхностях, что хорошо видно из рис. 1, так как оптическая плотность содержимого в опытных лунках практически идентична плотности чистой питательной среды контрольных лунок.

Результаты, полученные при выращивании Mp на планшетах, могут свидетельствовать лишь о самом факте образования этой микоплазмой биопленки, но не дают возможности проследить динамику этого процесса. Очень малый объем среды и довольно активный контакт с атмосферой вызывают быстрое закисление среды, приводящее к гибели микроорганизмов и отторжению пленки.

Динамика формирования биопленки была оценена методом сканирующей электронной микроскопии. Для этого культуры выращивали в закрытых стеклянных пробирках с 5 мл питательной среды. Эти условия обеспечили максимальное распространение биопленки по поверхности стекла через 3 сут от начала культивирования.

С помощью сканирующей электронной микроскопии было показано, что через 24 ч культивирования препарат представлял собой адгезированные на стекле конгломераты клеток инокулята, различные по размеру и форме, с четкими неровными краями (рис. 2).

Через 48 ч наблюдения в препарате по-прежнему регистрировались массивные ограниченные многослойные скопления бактериальных клеток, покрытые внеклеточным матриксом. Вокруг них, а также по большей части площади стекла распространялся тонкий слой биопленки (рис. 4).

Препарат последнего срока наблюдения представлял собой стекло, полностью покрытое биопленкой разной толщины (рис. 6).

Данное исследование позволило проследить структурные преобразования, связанные с динамикой формирования на стекле непрерывного слоя бактериальной культуры микоплазм. Особенности ультраструктуры этого слоя, такие как плотные скопления микробных клеток, многоуровневая их организация, наличие слоя внеклеточного средней электронной плотности гомогенного вещества с характерными отверстиями по типу пор, подтверждают морфологическую идентичность его бактериальным биопленкам, описанным ранее при изучении других микроорганизмов [17, 18].

Сорбционные свойства Mp как in vivo, так и in vitro связывают с мембранными адгезинами гликопротеиновой природы, поэтому вполне логично предположить, что Mp может расти в виде биопленки и на эпителиальных клетках респираторного тракта человека.

Многими исследователями показано, что биопленка может обеспечить микроорганизмам защиту от клеточных антибактериальных (фагоцитов) и гуморальных (антител и белков системы комплемента) факторов. Бактерии, находясь в составе биопленки, становятся устойчивыми к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков [19, 20].

Для микоплазмоза, вызываемого Mp, характерны генерализация инфекционного процесса, о чем свидетельствуют разнообразные внелегочные проявления (поражение кроветворной системы, сердца, печени, центральной нервной системы, кожи и др.), и длительная персистенция возбудителя в организме человека, предположительно в составе биопленки [21].

Полученные с помощью микробиологических и электронно-микроскопических методов данные имеют большое значение и могут быть использованы не только для понимания механизмов персистенции Мр в организме человека и особенностей течения инфекционного процесса, но и при разработке рациональных методов лечения респираторного микоплазмоза.

Информация о финансировании. Дополнительного финансирования данной работы не было.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарность. Авторы выражают благодарность доктору биологических наук, профессору Юлии Михайловне Романовой за помощь в анализе материала и его оформлении.

Сведения об авторах

Бархатова О.И. — e-mail: barhatova1902@gmail.com

Андреевская С.Г. — e-mail: hacaranda@yandex.ru

Алексеева Н.В. — e-mail: info@gamaleya.org

Жуховицкий В.Г. — e-mail: zhukhovitsky@rambler.ru

Раковская И.В. — e-mail: rakovskaya35@mail.ru

Автор, ответственный за переписку:

Раковская И.В. — e-mail: rakovskaya35@mail.ru

Как цитировать:

Бархатова О.И., Андреевская С.Г., Алексеева Н.В., Жуховицкий В.Г., Раковская И.В. Образование биопленки in vitro возбудителем респираторного микоплазмоза Mycoplasma pneumoniae. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(3):-127. https://doi.org/10.17116/molgen201937031

сокращения: