Сравнительная геномика штаммов Escherichia coli АВ1157, АВ2463, АВ2494 и АВ1885

Авторы:
  • Г. Б. Смирнов
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • И. Н. Бодоев
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • А. П. Макарова
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • Т. Б. Бутусова
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • В. А. Веселовский
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • А. C. Гуляев
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • Е. А. Шитиков
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
  • Е. Н. Ильина
    Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства России, Москва, Россия, 119435
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(3): 134-139
Просмотрено: 775 Скачано: 24

В 1960 г. Эдвард Адельберг и Сара Бернс приступили к созданию коллекции штаммов Escherichia coli K12, несущих префикс AB [1]. В 1962 г. эта коллекция обогатилась штаммом АВ1157, который содержал несколько ауксотрофных мутаций и мутаций по генам утилизации углеводов, был устойчив к стрептомицину и использовался как F-реципиент в конъюгационных скрещиваниях с донорными штаммами [2]. Целью этих экспериментов было изучение генетической структуры бактериальной хромосомы. Именно штамм АВ1157 был использован Полом Говардом-Фландерсом с сотрудниками в качестве исходного при выделении мутантов по генам uvrA, uvrB и uvrC, в которых поврежденным оказался первый этап (инцизия) эксцизионной репарации ДНК после УФ-облучения. Эти мутанты были получены после обработки бактерий АВ1157 азотистой кислотой. Таким образом, был получен штамм AB1885, содержащий мутацию uvrB5 [3]. В том же 1966 г. из штамма АВ1157 был получен мутант, не способный к генетической рекомбинации. Этот штамм содержал мутацию recA13 и был обозначен АВ2463 [4]. Следующим мутантом, полученным из штамма АВ1157, был мутант, дефектный по системе SOS-ответа, т. е. не способный к мутагенезу, индуцированному радиацией. Штамм был обозначен АВ2494 и содержал мутацию lexA1, которая лишала репрессор LexA способности к аутопротеолизу [5]. Штаммы АВ2463 и АВ2494 были получены с помощью N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина (НГ).

Все эти штаммы были использованы многочисленными коллективами [6—9] исследователей в сотнях работ, посвященных репарации, рекомбинации и мутагенезу у бактерий E. coli. Однако геномы этих штаммов секвенированы не были. Мы провели полногеномное секвенирование штаммов АВ1157, АВ2463, АВ2494 и АВ1885. В настоящей работе представлен анализ результатов секвенирования, который выявил значительное количество изменений в геномах АВ2463 и АВ2494 по сравнению с родительским штаммом АВ1157. В связи с этим сделана попытка ответить на следующие вопросы: 1) когда возникли обнаруженные нами изменения (сразу после мутагенеза или в последующие годы)? 2) изменения в геномах АВ2463 и АВ2494 происходили «по одному сценарию» или совершенно независимо? 3) каков вклад спонтанных мутаций штамма АВ1157 в различия между геномами AB1157, АВ2463 и АВ2494?

Материал и методы

Бактериальные штаммы и культивирование. Культивирование бактерий проводили в соответствии с описанными ранее протоколами [10]. Основные генетические характеристики штаммов: AB1157, F-thr-1 leu-6 proA2 his4 thi-1 argE3 lacY1 galK2 ara-14 xyl-5 mtl-I tsx-33 strA31 sup-37; AB2463, как AB1157, но также recA13; AB2494, как AB1157, но также metb-I lexA1 и AB1885 как AB1157, но uvrB5 (данные взяты из базы данных Йельского университета (The Coli Genetic Stock Center (http://cgsc2.biology.yale.edu/))).

Штаммы АВ1157, АВ2463, АВ2494 и АВ1885 были любезно предоставлены Г.Б. Смирнову Полом Говардом-Фландерсом в 1967 г. Штамм АВ1157, обозначаемый здесь как АВ1157 alt, был любезно предоставлен М.А. Петровой из коллекции Сектора анализа и хранения микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН в 2017 г.

Выделение ДНК. Лизис бактерий проводили с использованием буфера Promega Nuclei (Promega, США). Для удаления клеточных белков добавляли насыщенный раствор NaCl. ДНК концентрировали и обессоливали осаждением изопропанолом. К осадку ДНК добавляли 50—100 мкл ТЕ-буфера для дальнейшего хранения при 4 °C. ДНК дополнительно очищали, используя миниколонки для очистки ДНК («Technoclone», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Секвенирование и анализ генома. ДНК (300 нг для каждого образца) фрагментировали с использованием системы Covaris S220 («Covaris, Woburn, Massachusetts», США) до конечного размера 300—500 п.о. согласно рекомендациям производителя.

Для секвенирования на приборе Ion Torrent PGM («Thermo Fisher Scientific») приготовление библиотек осуществляли набором Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit («Thermo Fisher Scientific»). Для эмульсионной ПЦР использовали набор Ion PGM™ Template OT2 200 Kit («Thermo Fisher Scientific»). Секвенирование ДНК проводили с использованием Ion 318 chip v2 и the Ion PGM™ Sequencing 200 Kit v2 («Thermo Fisher Scientific»).

Для секвенирования на HiSeq 2500 platform («Illumina», США) готовили библиотеки парно-концевых фрагментов согласно рекомендации производителя с использованием набора NEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit («New England Biolabs», США). Индексацию библиотек осуществляли набором NEB Next Multiplex Oligos for Illumina (96 Index Primers) («New England Biolabs», США). Секвенирование проводили согласно рекомендациям производителя с использованием набора HiSeq Rapid PE Cluster Kit v2, HiSeq Rapid SBS Kit v2 (500 cycles) и HiSeq Rapid PE FlowCell v2.

Результаты секвенирования депонированы в базу данных NCBI под проектом PRJNA416242. Номера депонирования архивов секвенированных прочтений (Sequence Read Archive (SRA)) SRX3421413 — AB1157, SRX5178624 — AB1157 alt, SRX5178623 — AB1885, SRX3421414 — AB2463 и SRX3421412 — AB2494. Выравнивание прочтений с прибора на референсный геном Escherichia coli K-12 substr. MG1655 (NC_000913.3) проводили с использованием Bowtie 2 [11]. Для поиска однонуклеотидных полиморфизмов использовали программу FreeBayes [12]. В анализе учитывали полиморфизмы с минимальным х10 покрытием ридами и наличием измененного нуклеотида в 90% прочтений [13].

Для поиска участков генома со статистически значимо увеличенным числом однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) для каждого окна (длиной 2000 п.о. и 10 000 п.о.) было получено среднее значение числа SNP; вероятность получить наблюдаемое число вставок в окне оценивали согласно распределению Пуассона. Достоверным считали отличие с p-уровнем значимости менее 0,05 после поправки Бонферрони на множественное сравнение. Расчеты проводили с помощью языка программирования R.

Результаты и обсуждение

Были получены геномные последовательности исследуемых штаммов E. coli: родительский штамм AB1157, другая линия этого штамма AB1157 alt, recA13 мутант AB2463, lexA1 мутант AB2494 и uvrB5 мутант AB1885.

Геномы штаммов сравнивали между собой и относительно референсного генома Escherichia coli K-12 substr. MG1655 (NC_000913.3), представленного в NCBI (далее E. coli K12 (NCBI)) (табл. 1).

Таблица 1. Попарное сравнение количества мутаций в генах изученных штаммов Примечание. I — миссенс мутации, II — нонсенс мутации и III — синонимичные мутации.

Геномы штаммов АВ2463 и АВ2494, полученных путем обработки штамма АВ1157 нитрозогуанидином, содержали 131 и 293 отличий от генома АВ1157 соответственно. Анализ локализации этих мутаций по геномам не выявил статистически достоверных кластеров, при этом выявленные SNPs для штаммов АВ2463 и АВ2494 не совпадали между собой ни по одной из позиций. Большая часть этих изменений представлена транзициями GC на АТ (табл. 2),

Таблица 2. Количество и тип уникальных замен в генах штаммов АВ2463, АВ2494 и AB1885
что соответствует известному механизму действия алкилирующих агентов [14].

В свою очередь геномы различных линий АВ1157 (в тексте АВ1157 и АВ1157 alt) отличались друг от друга по 8 позициям. Геном АВ1157 отличался от E. coli K12 (NCBI) по 120 позициям. В геноме АВ1157 произошли 2 замены, отсутствующие в геномах АВ2463 и АВ2494 (здесь и далее замены, характерные для генома АВ1157, обозначены на основе его сравнения с геномом К12 (NCBI)). Однако геном AB1157 alt не содержал этих двух замен, но в свою очередь имел 5 своих уникальных мутаций. Геном штамма AB1157 содержал 11 мутаций (2 нонсенс, 7 несинонимичных и 2 синонимичные), которых нет в геноме АВ2494, 9 из которых общие с АВ2463 и АВ1157 alt.

Геном штамма АВ1885 (получен после обработки штамма АВ1157 азотистой кислотой) имел всего 25 отличий от генома АВ1157, 9 из которых были найдены именно в геноме АВ1157 (7 общие с АВ2463 и 2 уникальные для АВ1157). АВ1885 содержал 16 уникальных мутаций, которых не было выявлено в родительском геноме штамма АВ1157 и эти мутации не совпадали ни по одной из позиций с изменениями в геномах АВ2463 и АВ2494. Полученные нами данные указывают, что азотистая кислота может вызывать трансверсии и транзиции, с небольшим преимуществом последних (10 из 16) (см. табл. 2).

В дальнейшем был проведен сравнительный анализ известных генетических маркеров штаммов из базы E. coli Genetic Stock Center, Yale University School of Medicine. В табл. 3 представлены

Таблица 3. Описание мутаций, общих для всех E. coli AB-штаммов
генетические маркеры, их фенотипическое проявление и мутации, которые являются общими для всех штаммов. В табл. 4 и
Таблица 4. Мутации, общие для ряда секвенированных АВ-штаммов
5
представлены генетические маркеры, которые специфичны для исследуемых штаммов.

Таблица 5. Уникальные мутации в AB-штаммах

Полногеномное секвенирование по праву стало классическим методом молекулярной генетики бактерий. Расшифровка геномных последовательностей исторически важных штаммов являлась вопросом времени. Результаты секвенирования не только подтвердили ранее известные мутации, соответствующие генетическим характеристикам штаммов и описанные в базе Йельского университета, но и выявили новые, ранее неизвестные (неопубликованные) дефекты в генах, определяющих фенотип. Как выяснилось, штамм АВ2494, хотя и проявляет одинаковый с остальными штаммами фенотип, т. е., например, не способен расти на минимальной среде без добавления аргинина, но имеет мутацию в другом гене метаболизма аргинина. Наша работа позволит по-новому взглянуть на ранее полученные данные.

Первый вопрос, обозначенный во введении, можно сформулировать иначе: являются ли наблюдаемые изменения в геномах АВ2463 и АВ2494 спонтанными или индуцированными НГ? К сожалению, мы точно не знаем, сколько изменений возникло непосредственно после мутагенного воздействия, однако мы можем сравнить количество изменений в штаммах, полученных с помощью НГ и азотистой кислоты. Количество отличий между геномами АВ1157 и АВ1885 в 10 раз меньше, чем между геномами АВ1157 и АВ2463 или АВ2494. Это означает, что абсолютное большинство замен пар оснований в геномах штаммов АВ2463 и АВ2494 произошло под влиянием НГ, а не вследствие спонтанного мутагенеза. Таким образом, на первый вопрос можно вполне определенно ответить: наблюдаемые изменения в геномах АВ2463 и АВ2494 — следствие мутагенного воздействия НГ.

Что касается второго вопроса, то «один сценарий» предполагает сходство в локализации и характере изменений в геномах АВ2463 и АВ2494. Как видно из результатов, основными мутациями являются транзиции GC на АТ для обоих геномов, другими словами, характер или тип изменений одинаковый. Полученные результаты показывают, что в геноме штамма АВ2463 присутствует 129 уникальных мутаций, у штамма АВ2494 — 280, однако позиции этих мутаций не совпадают, и есть всего 9 генов (из 344 суммарно), в которых произошли мутации в разных позициях у обоих штаммов. Отсутствие сходства свидетельствует о том, что при получении штаммов АВ2463 и АВ2494 НГ атаковал геном АВ1157 беспорядочно, что, в конечном счете, вызвало появление в геномах АВ2463 и АВ2494 совершенно разных изменений. Итак, ответ на второй вопрос также очевиден — при получении штаммов АВ2463 и АВ2494 НГ вызвал в геноме А1157 мутации в совершенно разных сайтах. Возможно, это связано с различными условиями мутагенного воздействия (например, отличия рН раствора мутагена в разных экспериментах).

Чтобы ответить на третий вопрос, нужно понять, сколько произошло мутаций в геноме АВ1157 после получения из него штаммов АВ2463 и АВ2494. Совершенно очевидно, что штамм АВ1157 за 56 лет с момента получения в 1962 г. должен был претерпеть генетические изменения. Следовательно, для определения объема спонтанных изменений мы сравнили геномы двух линий АВ1157, имеющих совершенно разную историю хранения и культивирования, т. е. существовавшие все эти годы (1962—2018) в различных лабораториях. Две линии АВ1157 отличались всего на 8 мутаций (АВ1157 — 3 мутации и АВ1157 alt — 5) и все они произошли в разных генах. Различие в количестве мутаций между обеими линиями АВ1157 и мутантами, полученными с помощью НГ, отличается больше, чем на порядок. Однако оценить долю спонтанных мутаций штаммов АВ2463 и АВ2494, возникших в период после обработки НГ и до момента секвенирования, невозможно. Коль скоро мы уже выяснили, что наблюдаемые отличия геномов АВ2463 и АВ2494 от родительского генома АВ1157 есть следствие мутаций, индуцированных НГ, очевидно, что возможная доля спонтанных изменений генома АВ1157 сравнительно мала.

Выводы

1. В геномах штаммов E. сoli аннотированы ранее неизвестные мутации, соответствующие широко известным генетическим маркерам.

2. Сотни отличий геномов штаммов АВ2463 recA13 и АВ2494 lexA1, с одной стороны, и родительского штамма АВ1157, с другой стороны, в подавляющем большинстве обусловлены мутациями, индуцированными НГ.

3. Мутации в геномах штаммов АВ2463 и АВ2494 распределены беспорядочно, т. е. не образуют «горячих районов» или «горячих точек».

4. Выявленные нами мутации в геноме штамма АВ2463 не совпадают ни по одной из позиций ни с мутациями в геноме штамма АВ2494, ни с мутациями в геноме штамма АВ1885.

5. За период с момента разделения клонов АВ1157 и АВ1157 alt до момента секвенирования (56 лет) в геномах этих штаммов возникли 8 мутаций, которые могут считаться спонтанными.

6. За период с момента разделения клонов E. coli K12 (NCBI) и АВ1157 до моментов секвенирования их геномов в геномах этих штаммов возникло 120—122 отличий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Смирнов Г.Б. — e-mail: smirngb@ya.ru; https://orcid.org/0000-0001-9269-6129

Бодоев И.Н. — e-mail: ivan-bodoev@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-6611-5535

Макарова А.П. — e-mail: alenka130795@rambler.ru; https://orcid.org/0000-0003-2584-9062

Бутусова Т.Б. — e-mail: tabutusova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-7419-4229

Веселовский В.А. — e-mail: djdf26@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4336-9452

Гуляев А.C. — e-mail: andrewgull87@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-6329-2421

Шитиков Е.А. — e-mail: eshitikov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-4865-6004

Ильина Е.Н. — e-mail: ilinaen@gmail.com

Автор, ответственный за переписку:

Бодоев И.Н. — e-mail: ivan-bodoev@yandex.ru

Как цитировать:

Смирнов Г.Б., Бодоев И.Н., Макарова А.П., Бутусова Т.Б., Веселовский В.А., Гуляев А.C., Шитиков Е.А., Ильина Е.Н. Сравнительная геномика штаммов Escherichia coli АВ1157, АВ2463, АВ2494 и АВ1885. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(3):134-139. https://doi.org/10.17116/molgen201937031

Список литературы:

  1. Adelberg EA, Burns SN. Genetic variation in the sex factor of Escherichia coli. Journal Bacteriology. 1960;79:321-330. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC278688/pdf/jbacter00488-0027.pdf
  2. DeWitt S, Adelberg E. The occurrence of a genetic transposition in a strain of Escherichia coli. Genetics. 1962;47:577-685. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1210353/pdf/577.pdf
  3. Howard-Flanders P, Boyce RP, Theriot L. Three loci in Escherichia coli K-12 that control the excision of pyrimidine dimers and certain other mutagen products from DNA. Genetics. 1966;53:1119-1136.
  4. Howard-Flanders P, Theriot L. Mutants of Escherichia coli K-12 defective in DNA repair and in genetic recombination TL — 53. Genetics. 1966;53:1137. https://doi.org/10.2307/3583555
  5. Howard-Flanders P. Genes that control DNA repair and genetic recombination in Escherichia coli. Advances in Biological and Medical Physics. 1968;12:299-317. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4879502
  6. Howard-Flanders P, Theriot L, Stedeford JB. Some properties of excision-defective recombination-deficient mutants of Escherichia coli K-12. Journal Bacteriology. 1969;97:1134-1141. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC249825/pdf/jbacter00393-0184.pdf
  7. Green MHL, Greenberg J, Donch J. Effect of a recA gene on cell division and capsular poly-saccharide production in a lon strain of Escherichia coli. Genetics Research. 1969;14:159-162. https://doi.org/10.1017/S0016672300001993
  8. Ganesan AK, Smith KC. Dark-recovery processes in Escherichia coli irradiated with ultraviolet light. 3. Effect of rec mutations on recovery of excision-deficient mutants of Escherichia coli K-12. Journal Bacteriology. 1970;102:404-410. Available: https://pdfs.semanticscholar.org/3017/191fad191b9b4f7ff0735b567521e8750974.pdf
  9. Sommer S, Knezevic J, Bailone A, Devoret R. Induction of only one SOS operon, umuDC, is required for SOS mutagenesis in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 1993;239:137-144. https://doi.org/10.1007/BF00281612
  10. Bodoev IN, Ilina EN, Smirnov GB. Сharacteristics of Emergence of Mutants Resistant to Nalidixic Acid and Novobiocin in E.coli Strains with recA and lexA Mutations. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2018;33:30-33. https://doi.org/10.3103/S0891416818010044
  11. Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012;9:357-359. https://doi.org/10.1038/nmeth.1923
  12. Garrison E, Marth G. Haplotype-based variant detection from short-read sequencing. 2012; Available: https://arxiv.org/pdf/1207.3907.pdf
  13. Garrison E, Marth G. Haplotype-based variant detection from short-read sequencing. 2016; Available: https://www.cs.umd.edu/class/spring2016/cmsc702/public/FreeBayesDraft2015Jan12.pdf
  14. Lucchesi P, Carraway M, Marinus MG. Analysis of forward mutations induced by N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine in the bacteriophage P22 mnt repressor gene. Journal Bacteriology. 1986;166:34-37. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3957871
  15. Wright BE, Minnick MF. Reversion rates in a leuB auxotroph of Escherichia coli K-12 correlate with ppGpp levels during exponential growth. Microbiology. 1997;143:847-854. https://doi.org/10.1099/00221287-143-3-847
  16. Serebrijski I, Reyes O, Leblon G. Corrected gene assignments of Escherichia coli Pro- mutations. Journal Bacteriology. 1995;177:7261-7264. https://doi.org/10.1128/jb.177.24.7261-7264.1995
  17. Song Y, Lee BR, Cho S, Cho YB, Kim SW, Kang TJ, et al. Determination of single nucleotide variants in Escherichia coli DH5α by using short-read sequencing. FEMS Microbiology Letters. 2015;362:1-7. https://doi.org/10.1093/femsle/fnv073
  18. Lange R, Hengge-Aronis R. The cellular concentration of the σs subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability. Genes & Development. 1994;8:1600-1612. https://doi.org/10.1101/gad.8.13.1600
  19. Sun H, Zeng J, Li S, Liang P, Zheng C, Liu Y, et al. Interaction between rpsL and gyrA mutations affects the fitness and dual resistance of mycobacterium tuberculosis clinical isolates against streptomycin and fluoroquinolones. Infection and Drug Resistance. 2018;11:431-440. https://doi.org/10.2147/IDR.S152335
  20. Lin LL, Little JW. Isolation and characterization of noncleavable (Ind-) mutants of the LexA repressor of Escherichia coli K-12. Journal Bacteriology. 1988;170:2163-2173. https://doi.org/10.1128/jb.170.5.2163-2173.1988
  21. Lin LL, Little JW. Autodigestion and RecA-dependent cleavage of Ind- mutant LexA proteins. Journal of Molecular Biology. 1989;210:439-452. https://doi.org/10.1016/0022-2836(89)90121-6