Введение
Заболевания, вызываемые ортопоксвирусами, всегда представляли существенную угрозу здоровью человека [1]. Сразу 2 из 12 видов рода orthopoxvirus, вирус натуральной оспы (variola virus) (ВНО) и вирус оспы обезьян (monkeypox virus) (ВОО), определены в действующих санитарных правилах и нормах как особо опасные патогены первой группы патогенности [2]. Самой эффективной мерой в борьбе с вызываемыми ими инфекциями является вакцинация. Международная программа по элиминации натуральной оспы выполнялась при помощи тотальной вакцинации и завершилась в 1980 г. Благодаря тому, что ортопоксвирусы имеют высокий уровень антигенного кроссовера — более 95%, был сформирован коллективный иммунитет и к натуральной оспе, и к оспе обезьян. Однако со временем коллективный иммунитет понизился настолько, что участились и стали более интенсивными вспышки заболеваний, вызываемых как другими ортопоксвирусами, так и оспой обезьян [3].
ВОО был впервые выделен в 1958 г. в Дании от импортированной макаки-крабоеда, а первые зарегистрированные случаи заболевания людей были описаны в начале 1970-х годов в Центральной Африке [4, 5]. В Африке оспа обезьян является зоонозным заболеванием, распространенным среди довольно обширного ареала животных, включая белок и других грызунов [6, 7]. Ученые нашей страны под руководством академика РАЕН С.С. Маренниковой впервые доказали, что оспа обезьян может поражать и человека [8]. У людей оспа обезьян характеризуется выраженной лимфаденопатией, клиническая картина включает высокую температуру, головную боль, недомогание и развитие кожных поражений. Уровень смертности достигает 10% при инфекции, вызванной штаммами центральноафриканской клады [9]. Западноафриканские штаммы вызывают инфекцию с менее тяжелыми клиническими проявлениями [10, 11].
С января 2022 г. в мире регистрируются вспышки заболевания, вызванного ВОО, а к сентябрю 2023 г. отмечено почти 90,5 тыс. случаев оспы обезьян, из них более 150 (0,17%) летальных [12]. Для неполового пути передачи отмечена низкая инфекционность и слабая тяжесть заболевания. Однако следует помнить, что ВОО способен изменять биологические свойства. Поэтому необходимо постоянное обеспечение лабораторной диагностики как основного средства мониторинга заболевания разнообразными современными способами.
В настоящее время выявление ВОО основано на проведении анализа клинических образцов методом полимеразной цепной реакции [13]. Доказанными считаются подтвержденные другими лабораторными методами (например ИФА) случаи. Иммуноферментная диагностика специфических к ВОО антител широко применяется, но она обеспечивает только ретроспективное выявление оспы обезьян [14]. По этой причине актуальной в настоящее время является разработка средств иммунодиагностики, основанных на выявлении антигенов ВОО [15]. Решение эьой задачи тесно связано с созданием гибридом — продуцентов моноклональных антител (МКА) к уникальным антигенам ВОО.
За рубежом есть зарегистрированные тест-системы ИФА, разрешенные к применению в своих странах. Принцип их действия основан на выявлении белка A27L ВОО сэндвич-методом [16].
Цель нашего исследования — определение возможности разработки средства иммуноферментной диагностики оспы обезьян на основе МКА по специфическому антигену поверхностного белка A29L ВОО.
Материал и методы
Дизайн аминокислотных последовательностей, получение штаммов-продуцентов рекомбинантных аналогов белков ВОО, Trx
Дизайн аминокислотных последовательностей, получение штаммов и рекомбинантных белков проводили по классическим методикам [17].
Получение инактивированных нативных антигенов ВОО, ВНО и ВОВ
Штаммом hMpxV/Russia/St.Petersburg-02/2022 ВОО, штаммом India 3a вируса натуральной оспы (ВНО) и штаммом ЛИВП вируса осповакцины (ВОВ) заражали монослой чувствительной клеточной культуры и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 5—7 сут до поражения монослоя на 80—90%.
Титрование ВОО проводили методом бляшкообразования в 24-луночных планшетах. Титр вируса выражали в БОЕ/мл [18]. Титр ВОО составил 4,1·106 БОЕ/мл, стоки вируса хранили при –70°C.
Культуральную вируссодержащую жидкость (КВЖ) с ВНО обрабатывали добавлением трехкратного объема 10% формалина и выдерживали в течение 14 сут при 23°C. ВОО и ВОВ инактивировали 0,02% раствором пропиолактона в течение 2 ч при 37°C. Аликвоты ВОО, ВНО и ВОВ хранили при –70°C.
Иммунизация животных рекомбинантными белками ВОО
В работе использовали инбредных разнополых 10—12-недельных мышей линии BALB/c массой 20—22 г. Подопытных животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях. Трех мышей линии BALB-C внутрибрюшинно иммунизировали препаратом очищенного рекомбинантного белка AgPOX 50 мкг/животное, трехкратно, с перерывом в 14 сут, первый раз с полным адъювантом Фрейнда, затем с неполным адъювантом Фрейнда. Через 14 дней после последней иммунизации проводили бустерную иммунизацию антигеном в 0,9% NaCl. Через 3 дня из иммунизированных животных выделяли спленоциты, которые в дальнейшем были использованы для гибридизации. Гибридизацию полученных спленоцитов с линией клеток миеломы мыши SP2/0 проводили с использованием полиэтиленгликоля 1500 (Sigma Aldrich) согласно инструкции производителя. После гибридизации полученные пулы гибридомных клеток высевали в лунки планшета с селективной средой IMDM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина. Каждые 3 сут в лунке с пулом заменяли селективную среду свежей. На 10—14-е сутки культивирования из лунок отбирали супернатант и тестировали в ИФА на наличие специфичных антител к белку AgPOX. Из них отдельные гибридомные штаммы-продуценты МКА получали методом предельных разведений.
Очистка моноклональных антител
МКА против рекомбинантного белка AgPOX выделяли из асцитной жидкости мышей, которым вводили клетки гибридом. Сначала МКА переосаждали в 50% растворе (NH4)2SO4 (50%), после чего антитела растворяли в буфере ХБА (0,75 М глицин-NaOH, 3 М NaCl, pH 8,9). На втором этапе антитела очищали хроматографически, для этого колонку с сорбентом (белок А сефароза-4B эж, Thermo Fischer Scientific, США) промывали 5 объемами колонки буфером ХБА и наносили раствор МКА. После нанесения колонку еще раз промывали буфером ХБА. Антитела элюировали 0,1 М цитратным буфером, pH 3,5. К раствору очищенных антител добавляли 1/10 объема буфера (1,5 М трис-HCl, pH 8,8) для нейтрализации pH. Затем МКА диализом переводили в буфер ЗФР (0,02М калий фосфорнокислый, pH 7,3; 0,15М натрия хлорид, 0,05% раствор азида натрия). Концентрацию белка в препарате определяли спектрофотометрически, проводя измерение при длине волны 280 нм.
Выбор гибридом, синтезирующих IgG к A29L ВОО
Выбор гибридом, синтезирующих IgG к A29L ВОО, осуществляли в ИФА на иммуносорбентах (ИС) с 6 антигенами. Для приготовления ИС рекомбинантные и нативные белки раздельно сорбировали в лунках 96-луночного планшета для иммунологических реакций (Nunc MaxiSorp), внося в пропорции 1:100 с 0,01 М раствором натрия углекислого по 100 мкл/лунку. После инкубации при 23°C в течение 18 ч жидкость аспирировали и вносили по 200 мкл блокирующего раствора 0,1% казеина (Serva). После 2 ч инкубации при 23°C жидкость аспирировали и высушивали в течение 18 ч при 23°C. Каждую пробу супернатанта, содержащую МКА к AgPOX, исследовали в ИФА параллельно с использованием этих ИС. В качестве отрицательного контроля (К–) использовали растворы МКА к белкам других вирусов. Для этого вносили в дубле в лунки по 100 мкл супернатанта, разведенного 1:100 в 0,1% растворе бычьего сывороточного альбумина (РС). После инкубации при 37°C в течение 60 мин лунки ИС отмывали пятикратно раствором фосфатно-солевого буферного раствора с добавлением 0,2% Твин-20 (ФСБ-Т). Затем вносили по 100 мкл разведенного 1:5000 в РС пероксидазного конъюгата антител кролика к IgG мыши (Sigma Aldrich). После инкубации при 37°C в течение 30 мин лунки ИС отмывали пятикратно раствором ФСБ-Т и вносили по 100 мкл хромогена ТМБ для визуализации образовавшихся иммунных комплексов через 15 мин инкубации при 37°C. Останавливали реакцию внесением 1 М раствора серной кислоты, результаты учитывали на планшетном ридере при длине волны 450 нм. Гибридома, продуцирующая антитела к уникальным эпитопам белка A29L, удовлетворяла критериям отбора при условии превышения величины фонового сигнала в 200 раз от супернатанта с IgG в лунках планшета с антигеном AgPOX, в 100 раз с Trx-A29 и при отсутствии любого сигнала выше фонового (4х среднеарифметическое значение оптической плотности К–) в лунках с антигенами Trx, ВНО и ВОВ.
Определение чувствительности МКА к A29L ВОО в ИФА
Культуральную жидкость, содержащую ВОО, разводили раствором NaHCO3 до концентраций 104, 103, 102 и 10 БОЕ/мл и вносили по 100 мкл/лунку 96-луночного планшета для иммунологических реакций в 18 дублях. После инкубации при 23°C в течение 18 ч жидкость аспирировали и вносили по 200 мкл блокирующего раствора — 0,1% раствора казеина (Serva). После 2 ч инкубации при 23°C жидкость аспирировали и высушивали в течение 18 ч при 23°C. ИФА проводили, как описано выше, в качестве первичных антител использовали МКА к A29L ВОО от трех гибридом в концентрации 0,02 мг/мл.
Результаты и обсуждение
Дизайн искусственного мозаичного белка AgPOX, содержащего уникальные эпитопы ВОО
Дизайн искусственного мозаичного белка AgPOX, содержащего уникальные эпитопы ВОО, проведен на основе сравнительного анализа структурно-функциональной организации белков ВОО, ВНО, ВОВ и других ортопоксвирусов. Выявлены и комбинированы уникальные эпитопы ВОО с «иммунологически существенными» отличиями от белков-ортологов. В составе AgPOX представлены уникальные участки восьми белков ВОО, включая короткую последовательность белка A29L (рис. 1).
Рис. 1. Аминокислотная последовательность белка AgPOX.
Розовым цветом обозначена аффинная 8xHis-метка; зеленым цветом — сайт распознавания TEV-протеазы; серым цветом — полилинкерная последовательность. Синие буквы — уникальные аминокислотные остатки антигенов ВОО.
Дизайн белка Trx-A29
Белок A29L ВОО способствует слиянию мембран вирусной частицы и клетки-хозяина. Существует только четыре аминокислотных различия с белками-ортологами ортопоксвирусов. В иммуногенной области расположены только три [16].
В качестве матрицы для синтеза антигена использовали укороченный вариант кодирующей последовательности ДНК A29L (1—83 а.о.). В состав включен спирально-спиральный домен, отвечающий за самосборку в четвертичную структуру [19]. При трансформации реципиента Escherichia coli плазмидой pET-32(a)-A29L проведена инсерция целевого фрагмента A29L в последовательность гена Trx для достижения оптимальных условий синтеза последовательности (рис. 2).
Рис. 2. Аминокислотная последовательность белка Trx-A29.
Не окрашена последовательность белка Trx. Голубым цветом обозначен сигнальный пептид; зеленым цветом — гепарин-связывающий домен (HBD); сине-зеленым цветом — линкер; желтым цветом — спирально-спиральный домен (CCD). Фиолетовым цветом обозначена 6xHis метка. Серым цветом обозначен сайт распознавания эндонуклеазы рестрикции HindIII. Красным цветом выделены аминокислотные остатки, уникальные для ВОО. Подчеркнута последовательность, имеющаяся в составе белка AgPOX.
Получение штаммов-продуцентов рекомбинантных аналогов белков ВОО, Trx и наработка ими рекомбинантных белков
На основе штамма BL21(DE-3) E. coli был создан продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pET28b-AgPOX белка AgPOX. Рекомбинантный белок AgPOX в дальнейшем использован для иммунизации животных при получении диагностических МКА к ВОО. Индукцию синтеза белка AgPOX осуществляли внесением IPTG до 0,1 мМ. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка AgPOX в количестве 5—10 мг на 1 г биомассы при выделении методом аффинной металлхелатной хроматографии.
Второй штамм-продуцент, Escherichia coli Rosetta2/pET-32(a)-A29L, нарабатывает рекомбинантный белок Trx-A29. При индукции синтеза белка Trx-A29 с использованием IPTG на 1 г биомассы выход белка составляет 7,32 мг. Он содержит в своем составе последовательность Trx. По этой причине при применении Trx-A29 для отбора продуцента IgG в ИФА потребовалось использование дополнительного иммуносорбента на основе чистого Trx чтобы исключить выбор продуцента антител к тиоредоксину. Белок был очищен из биомассы штамма-реципиента.
Контроль качества нативных антигенов ВНО и ВОВ
Исходя из того, что геномы ВОО, ВНО и ВОВ идентичны более чем на 90%, для контроля специфичности и отсутствия кроссреактивного связывания антител на антигены ВНО и ВОВ использовали иммуносорбенты на основе их инактивированных препаратов. Специфическую активность иммуносорбентов ВНО и ВОВ исследовали в ИФА с применением первичных антител из сыворотки крови иммунизированных штаммом ЛИВП ВОВ мышей. Результаты ИФА — в табл. 1.
Таблица 1. Величина положительного сигнала IgG к антигенам ортопоксвирусов у иммунизированных штаммом ЛИВП ВОВ мышей на иммуносорбентах ВНО и ВОВ
| № мыши | ИС ВНО | ИС ВОВ | ||
| ОП, о.е. | КПоз | ОП, о.е. | КПоз | |
| 1 | 2,346 | 59 | 4,501 | 64 |
| 2 | 1,343 | 34 | 4,223 | 60 |
| 3 | 1,009 | 25 | 5,947 | 85 |
| 4 | 1,986 | 50 | 4,652 | 66 |
| 5 | 1,193 | 30 | 4,963 | 71 |
| 6 | 0,907 | 23 | 4,389 | 63 |
| отр. К1 | 0,009 | 0,2 | 0,014 | 0,2 |
| отр. К2 | 0,010 | 0,3 | 0,019 | 0,3 |
| Ср. геометрическое | 34,4 | 67,8 | ||
| Lg ср. геом | 1,54 | 1,83 | ||
| Доверит. интервал Lg I95 | 0,17 | 0,13 | ||
Примечание. * — КПоз = оптическая плотность исследуемого образца / оптическая плотность фона (4х среднего арифметического отрицательного контроля).
Получение и характеризация МКА против белка A29L ВОО
В результате гибридизации, селекции и последующего скрининга выросших гибридомных клеток получены 15 гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку AgPOX. Результаты ИФА по определению их диагностических характеристик — в табл. 2.
Таблица 2. Результаты ИФА по отбору гибридом
| № гибридомы | Иммуносорбент в ИФА, КПоз.* | |||||
| AgPOX | Trx+A29 | Trx | ВОВ | ВНО | ВОО | |
| 4H11 | 212,9 | 847,7 | 1,0 | 1,3 | 0,9 | 161,8 |
| 8F12 | 222,8 | 813,4 | 2,5 | 0,9 | 1,0 | 169,3 |
| 2B6 | 215,3 | 686,7 | 1,1 | 1,3 | 0,9 | 163,6 |
| 4C4 | 210,0 | 674,1 | 1,2 | 1,8 | 1,0 | 159,6 |
| 2D1 | 209,9 | 673,7 | 1,0 | 1,3 | 0,9 | 159,5 |
| 5D4 | 231,1 | 664,2 | 1,1 | 1,2 | 1,1 | 175,6 |
| 1H2 | 205,6 | 654,6 | 1,1 | 1,4 | 0,8 | 156,3 |
| А12 | 221,2 | 654,3 | 1,0 | 1,3 | 0,9 | 168,1 |
| 4E7 | 213,9 | 650,2 | 1,1 | 1,4 | 0,9 | 162,5 |
| 1E3 | 234,7 | 642,7 | 1,1 | 1,1 | 1,0 | 178,4 |
| 3F10 | 225,2 | 574,4 | 1,1 | 1,3 | 0,9 | 171,2 |
| 7D1 | 218,5 | 437,4 | 1,0 | 1,3 | 0,9 | 166,1 |
| 8D8 | 222,2 | 183,7 | 1,1 | 1,5 | 0,9 | 168,9 |
| 6A12 | 236,5 | 220,9 | 1,1 | 2,7 | 0,9 | 179,8 |
| 3E12 | 245,3 | 190,2 | 1,1 | 1,2 | 0,9 | 186,4 |
| МКА ККГЛ 4E8 | 0,1 | 0,1 | 0,6 | 0,1 | 0,1 | 0,5 |
| МКА ЛЗН 5H11 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | 0,3 | 0,1 | 0,1 |
| МКА SARS-CoV-2 6C10 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,4 | 0,4 |
Примечание. * — КПоз = оптическая плотность исследуемого образца / оптическая плотность фона (4х среднего арифметического отрицательного контроля).
Чувствительность ИФА с использованием МКА к A29L ВОО
Три гибридомы отобраны для депонирования по критерию производительности МКА мыши класса IgG к A29L ВОО. Серии препаратов МКА a-A29L_MPoxV от каждой из гибридом исследованы в ИФА на предмет чувствительности при выявлении антигена ВОО в иммуносорбенте. Результаты — в табл. 3.
В данном эксперименте мы применили комбинированный способ получения диагностических МКА к определенному эпитопу ВОО с последующим контролем их специфичности. Для гибридизации использованы спленоциты от мышей, иммунизированных рекомбинантным белком с восемью уникальными для ВОО последовательностями. Выбор перспективных гибридом проведен на другом рекомбинантном белке с последовательностью A29L, содержащей три поверхностных уникальных для ВОО эпитопа.
Для контроля специфичности использованы нативные антигены ВНО и ВОВ. Предварительно они показали, что данный способ их применения обеспечивает чувствительность анализа по результатам ИФА с применением поликлональных антител иммунизированных ВОВ мышей (см. табл. 1). Статистически достоверных различий для антигенов ВОВ и ВОО в ИФА не выявлено (интервалы погрешности при доверительном уровне 95% вероятности перекрываются).
При определении чувствительности МКА от 15 гибридом к последовательности A29L ВОО в составе белка Trx-A29 (см. табл. 2) величины положительных сигналов на нативном антигене ВОО превысили сигнал от отрицательного контроля более чем в 150 раз. Кроме того, 12 из 15 образцов МКА имели величины положительных сигналов в ИФА к антигену Trx+A29 в 2—4 раза выше, чем к антигену AgPOX, использованному для иммунизации животных, это свидетельствует о том, что Trx+A29 содержит эпитопы с корректными фолдингом. Специфичность МКА подтверждает отсутствие ложноположительного сигнала от антигенов Trx, ВНО и ВОВ. МКА трех отобранных для депонирования гибридом при исследовании их диагностической чувствительности, согласно табл. 3, показали достоверное десятикратное отличие сигнала от фона при детекции ВОО в концентрации 102 БОЕ/мл.
Таблица 3. Определение чувствительности ИФА по выявлению антигена ВОО с применением в качестве первичных антител МКА трех серий от разработанных гибридом, в усредненных КПоз* от трех повторов
| МКА | Концентрация ВОО в иммуносорбенте, БОЕ/мл | |||
| 104 | 103 | 102 | 10 | |
| a-A29L_MPoxV 1 | 159,6 | 47,7 | 11,0 | 1,2 |
| a-A29L_MPoxV 2 | 159,5 | 43,4 | 12,5 | 1,9 |
| a-A29L_MPoxV 3 | 165,3 | 46,7 | 11,1 | 1,4 |
| МКА ККГЛ 4E8 | 0,5 | 0,2 | 0,3 | 0,6 |
| МКА ЛЗН 5H11 | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,7 |
| МКА SARS-CoV-2 6C10 | 0,2 | 0,1 | 0,6 | 0,2 |
Примечание. * — КПоз = оптическая плотность исследуемого образца / оптическая плотность фона (4х среднего арифметического отрицательного контроля).
Увеличить чувствительность набора реагентов можно при использовании МКА без инактивации препарата ВОО. Тогда часть антигенных детерминант не поменяет конформацию и не затруднит связывание с активными центрами МКА. Набор реагентов RayBio Monkeypox Virus (MPXV) A29 ELISA Kit производства RayBiotech, Inc. (США) предназначен для иммуноферментной диагностики ВОО сэндвич-методом по антигену A29L за 4 ч 45 мин. К сожалению, в эксплуатационной документации нет описания пробоподготовки, хотя результат выражается в концентрации пг/мл белка A29L. Поэтому привязать результат к вирусной активности невозможно. В РФ зарегистрировано медицинское изделие «Набор реагентов Тест-система иммуноферментная для выявления антигена ортопоксвирусов по ТУ 9388-148-14237183-10» производства АО «НПО «Микроген». Изделие позволяет выявить без дифференцировки антигены ортопоксвирусов в неинактивированных биопробах при подготовке планшета к анализу в течение 24 ч и времени анализа 1 ч 10 мин.
Полученные нами результаты могут помочь в сокращении времени выявления антигена ВОО за счет разработки на основе биотинилированных МКА двухстадийной системы непрямого твердофазного ИФА со временем анализа не более 3 ч. В качестве анализируемых образцов будут исследоваться инактивированные и неинактивированные биопробы.
Заключение
На основе штаммов E. coli разработаны продуценты рекомбинантных белков: белка, состоящего из уникальных аминокислотных последовательностей нативных белков ВОО AgPOX для иммунизации животных с целью получения производящих специфические МКА гибридом; и белка, содержащего пептидную последовательность нативного белка A29L ВОО Trx-A29 для отбора в ИФА продуцентов МКА к ВОО при использовании его в качестве антигена.
На примере штамма hMpxV/Russia/St.Petersburg-02/2022 из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (номер депонирования V-1200) показана возможность выявления вируса оспы обезьян методом ИФА с применением МКА к белку A29L в концентрациях выше 102 БОЕ/мл.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности создания современного средства диагностики ВОО на основе метода ИФА.
Благодарности. Авторы выражают искреннюю благодарность Андрею Леонидовичу Матвееву, старшему научному сотруднику Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, за его неоценимый вклад в создание гибридом и редактирование статьи.
Финансирование работы. Работа выполнена в рамках государственного задания ГЗ-34/21 ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (номер государственного учета НИР: рег. №121033100069-4).
Соблюдение этических стандартов
Информация о соблюдении стандартов работы с животными. Исследования и манипуляции на животных были проведены с одобрения комитета по биоэтике ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Информация об исследованиях, где в качестве объектов выступали люди. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.