Для визуализации различных процессов в клетке часто прибегают к введению генов флуоресцентных белков в геном клетки. При этом актуальным является вопрос стабильности исходной культуры клеток, фенотип-генотипические свойства которой подвергаются существенным трансформациям. Отбор субклонов еще в большей степени ассоциирован с искусственной онкотрансформацией, что подчеркивает важность в контексте исследований в области рака.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проанализировать уровень экспрессии флуоресцирующего белка TagRFP в опухолевых клетках Hep2-TagRFP, сравнить морфологию клонов, выделенных из гетерогенной культуры Hep2-TagRFP, и выявить фенотипические отличия по сравнению с исходной гетерогенной клеточной культурой.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Линия аденокарциномы гортани Hep2-TaqRFP была получена с использованием лентивирусной трансдукции. Последующее клонирование и селекция позволили отобрать два субклона 2B10 и 2F11, стабильно экспрессирующих флуоресцентный белок TagRFP. МТТ-тест, цитофлуорометрия с анализом клеточного цикла, реал-тайм ПЦР, получение ксенографтов на мышах линии Nude были использованы для подтверждения фенотипических отличий субклонов от исходной клеточной линии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получена гетерогенная флуоресцирующая клеточная линия аденокарциномы гортани Hep2 с конститутивной экспрессией белка TagRFP. На основе линии Hep2-TagRFP получено два стабильных субклона и изучены их свойства. Показано, что высокая копийность трансгена TagRFP может влиять на экспрессию ключевых генов цитоскелета (ACTB и TUBB3), снижать уровень пролиферативной активности и изменять уровень метаболической (активность митохондриальных оксидоредуктаз), демонстрируя также снижение туморогенности полученных клонов в мышах линии Nude.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Случайные встройки лентивирусной кассеты могут влиять на экспрессию ключевых генов (генов «домашнего хозяйства»), что продемонстрировано на полученных клонах опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии целевого белка. Полученные субклоны опухолевых клеток-трансдуктантов отличаются от исходной гетерогенной культуры не только по уровню флуоресценции белка TagRFP в клетках, но и по метаболическим, пролиферативным и туморогенным свойствам.
