Введение

Возрастающее количество современных высокоэнергетических травм конечностей как у участников боевых действий, так и у пострадавших мирного времени приводит к увеличению количества различных повреждений крупных нервов конечностей. Как правило, лечение таких пациентов является мультидисциплинарной проблемой, в решении которой принимают участие не только нейрохирурги, но и травматологи, сосудистые хирурги и реконструктивно-пластические хирурги. Социальное значение проблемы травмы нервов подчеркивается еще и тем, что различные виды повреждений нервов наиболее часто выявляются среди молодого и трудоспособного населения [1—5].

Наиболее тяжелую в диагностическом, лечебном и прогностическом плане группу среди таких пострадавших составляют пациенты с обширными дефектами нервов. Даже своевременно выполненные реконструктивно-пластические вмешательства с замещением дефектов крупных нервных стволов не гарантируют полного восстановления функций, утраченных при травме нерва. Однако аутонейропластика позволяет добиваться стабильных клинических результатов. В связи с этим создание условий для регенерации поврежденных нервов и исследование путей регуляторного воздействия на регенераторные способности нервов являются актуальной задачей хирургии [6—11].

Среди существующих в настоящее время способов замещения обширных дефектов нервов один из наиболее дискутабельных методов — устранение дефекта нервов за счет соединения проксимального и дистального концов поврежденного нервного ствола с помощью различных видов кондуитов. Сама идея замещения дефектов нервов трубчатыми имплантатами не является новой. Первоначально такие попытки осуществлялись с помощью биологических материалов, таких как декальцинированные сегменты сосудов. В более позднее время появилась возможность изготовления синтетических трубчатых имплантатов. Результаты экспериментальных и клинических исследований эффективности реиннервации тканей после соединения поврежденных нервов с помощью кондуитов неоднозначны, но небезнадежны [12—14]. Очевидна необходимость применения дополнительных приемов стимуляции регенеративных способностей поврежденных нервных волокон, таких как применение клеточных конструкций, использования электропроводящих материалов при разработке кондуитов, а также воздействия различных факторов роста нервной ткани [15—20].

В настоящей экспериментальной работе использованы электропроводящие биодеградирующие матрицы для тканевой инженерии в виде трубок с внутренним диаметром 1,5 мм. Эти кондуиты разработаны в Институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург). Они получены на основе двух биосовместимых полимеров: полилактида и полипиррола. Основой композиционных матриц являются пористые, проницаемые пленки или трубки из полилактида, полученные методом электроформования. На развитую поверхность матриц, состоящих из хаотически переплетенных волокон микронной толщины, нанесен слой электропроводящего полипиррола.

Цель исследования: оценка эффективности восстановления утраченной при травмах иннервации тканей после замещения обширных дефектов нервов синтетическими кондуитами на основе полилактида с полипирролом в эксперименте на лабораторных животных.

Материал и методы

Исследование проводилось в 4 этапа. На первом этапе выполнено прикладное топографо-анатомическое исследование нервов тазовых конечностей у лабораторных животных для постановки технического задания на изготовление синтетических кондуитов, соответствующих требованиям эксперимента. Было проведено топографо-анатомическое исследование тазовых конечностей 5 трупов экспериментальных животных (крыс) после выведения их из опыта по окончании лабораторных исследований в соответствии с учебной программой, не связанных с выполнением микрохирургических вмешательств в области бедра, голени и стопы.

На втором этапе выполняли моделирование травмы крупного нервного ствола лабораторных животных с последующим замещением обширного дефекта синтетическим кондуитом на основе полилактида с полипирролом. Всего выполнено 10 экспериментальных оперативных вмешательств на лабораторных животных (крысы линии Wistar, самцы массой 250—300 г). Оперативные вмешательства проводили в условиях экспериментальной операционной с соблюдением требований асептики и антисептики. Перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняли неингаляционную анестезию 20% раствором золетила («Virbac S.A.», Франция). Для введения в анестезию внутрибрюшинно вводили раствор золетила в дозе 20 мг/кг, при этом состояние седации развивалось через 6—7 мин. Для поддержания анестезии золетил вводили однократно подкожно в дозе 10 мг/кг. В ходе экспериментального оперативного вмешательства выполняли местную инфильтрационную анестезию 0,5% раствором новокаина. К седалищному нерву выполняли заднелатеральный доступ послойным разрезом на уровне средней трети бедра. Микрохирургический этап оперативного вмешательства проводили под оптическим увеличением с использованием операционного микроскопа Leica с бинокулярным отводом для ассистента. После мобилизации седалищного нерва для моделирования обширного дефекта нерва выполняли иссечение его ствола на протяжении 0,5—1,0 см его длины. Затем соединяли проксимальный и дистальный концы поврежденного нерва с помощью синтетического кондуита. С каждой стороны накладывали по 2 узловых П-образных шва (пролен 8/0). В качестве кондуитов применяли электропроводящие биодеградируемые матрицы для тканевой инженерии в виде трубок с внутренним диаметром 1,5 мм. Эти кондуиты разработаны в институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург). Они получены на основе двух биосовместимых полимеров: полилактида и полипиррола. Основой композиционных матриц служат пористые, проницаемые пленки или трубки из полилактида, полученные методом электроформования. На развитую поверхность матриц, состоящих из хаотически переплетенных волокон микронной толщины, нанесен слой электропроводящего полипиррола (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид имплантированного кондуита.

В ходе третьего этапа работ для контроля функционального состояния седалищного нерва в послеоперационном периоде проводили электронейромиографию (ЭНМГ) с помощью двухканального компьютерного цифрового электронейромиографа Нейро-МВП Микро (Россия) с прилагаемым программным обеспечением. Непосредственно в ходе экспериментальных оперативных вмешательств проводили стимуляционную ЭНМГ для уточнения электропроводности кондуита, соединявшего проксимальный и дистальный сегменты поврежденного нерва. Для этого стимуляцию восстановленного нерва выполняли, перемещая биполярный крючковидный стимулирующий электрод с поверхности проксимального сегмента поврежденного нерва на поверхность кондуита и в последнюю очередь — на поверхность дистального сегмента восстановленного в эксперименте нерва. В послеоперационном периоде стимуляционную ЭНМГ проводили по модифицированной методике с использованием игольчатых электродов (l=25 мм, d=0,3 мм). Стимулирующие электроды размещали в проекции седалищного нерва выше уровня выполненных вмешательств, а воспринимающие электроды располагали в толще мышц заднего костно-фасциального футляра голени. До начала эксперимента всем животным было выполнено исследование M-волны методом стимуляционной ЭНМГ. При силе тока 3,0—6,0 мА подаваемого сигнала на стимулирующий электрод амплитуда M-волны от икроножной мышцы составила 30,24±2,11 мВ, латентность — 1,26±0,06 мс. Указанный диапазон силы тока применялся и на последующих этапах эксперимента.

Для исследования спонтанной активности мышечных волокон и потенциалов двигательных единиц проводили игольчатую ЭНМГ по стандартной методике. Метод игольчатой электромиографии, позволяющий оценить выраженность денервационно-реиннервационного процесса в пораженной мышце при травмах нерва, является наиболее адекватным. Это связано с тем, что после полной или частичной денервации волокна скелетных мышц начинают генерировать спонтанную активность: потенциалы фибрилляций и положительные острые волны. Этот феномен — один из наиболее ярких электрофизиологических проявлений денервации мышц.

Четвертый (морфологический) этап исследования осуществляли после выведения животных из опыта передозировкой раствора золетила. Для изготовления микропрепаратов иссекали седалищный нерв на всем протяжении бедра. Фиксацию и проводку препаратов выполняли по стандартным методикам. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологические исследования структуры тканей проводили на изображениях, полученных при сканировании микропрепаратов в автоматическом сканере 3DHISTECH Pannoramic MIDI (Венгрия).

Все этапы экспериментального исследования выполняли с соблюдением Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Женева, 1985). Исследование одобрено независимым Этическим комитетом при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол №251 от 29.06.2021). Оценку полученных числовых данных на соответствие закону нормального распределения количественных величин осуществляли с использованием критерия Шапиро—Уилка. Для сравнения независимых малочисленных совокупностей применяли критерий Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

По результатам выполненного прикладного топографо-анатомического исследования нервов тазовых конечностей у экспериментальных животных выяснено, что у крыс седалищный нерв отдает двигательные ветви к мышцам бедра сразу по выходе из подгрушевидного отверстия. На уровне бедра в составе ствола седалищного нерва в ходе препаровки визуализировались три крупных пучка, которые представляли большеберцовый нерв, общий малоберцовый нерв и задний кожный нерв голени. Таким образом, при планировании экспериментальной травмы с формированием дефекта седалищного нерва и его последующим устранением с помощью кондуита наиболее приемлемым уровнем оперативных вмешательств является средняя треть бедра. Такой подход в отсутствие повреждений двигательных ветвей к мышцам заднего костно-фасциального футляра бедра позволяет сохранять двигательную активность проксимального сегмента тазовой конечности.

Оптимальным доступом к седалищному нерву по условиям эксперимента являлся заднелатеральный. Этот вид доступа позволял без особых трудностей визуализировать в операционной ране седалищный нерв и выполнять все этапы моделирования травмы нерва, а также замещение посттравматического дефекта с помощью синтетического кондуита. Вместе с тем расположение послеоперационного рубца на заднелатеральной поверхности бедра в послеоперационном периоде существенно снижало вероятность преждевременного самостоятельного снятия послеоперационных швов.

Непосредственно в ходе выполнения оперативных вмешательств на лабораторных животных после соединения проксимального и дистального сегментов поврежденного нерва с помощью синтетических имплантатов была определена электропроводность применявшихся синтетических кондуитов (рис. 2).

Рис. 2. Определение проводимости пересеченных нервов и кондуита.

При стимуляции проксимального сегмента стимулом, подаваемым на электрод, 5 мА амплитуда M-ответа составила 1,8 мВ (рис. 3, а). При расположении стимулирующего электрода на поверхности кондуита амплитуда моторного ответа практически не отличалась от таковой, как и при непосредственной стимуляции дистального сегмента седалищного нерва, и составила 25,3 мВ (рис. 3, б) и 25,6 мВ (рис. 3, в) соответственно.

Рис. 3. Параметры кривой моторного ответа икроножной мышцы при выполнении стимуляционной электронейромиографии с расположением стимулирующего электрода на различных уровнях.

а — на уровне проксимального сегмента седалищного нерва; б — при расположении электрода на поверхности кондуита; в — при стимуляции дистального сегмента седалищного нерва.

Учитывая полученные при ЭНМГ данные, можно сделать вывод, что кондуит из полилактида с полиперролом обладает хорошей электропроводимостью.

В послеоперационном периоде на ранних сроках наблюдения нарушение двигательных функций мышц голени и стопы отмечалось у всех лабораторных животных на стороне выполненных экспериментальных вмешательств. Эти нарушения проявлялись в отставании тазовой конечности при свободном перемещении животных в пределах вольера. При исследовании сложного непроизвольного рефлекса подготовки к приземлению (лифтный рефлекс) на стороне оперативных вмешательств отсутствовало движение разведения пальцев по сравнению с контралатеральной конечностью. Проведение нервных импульсов по интактным ветвям седалищного нерва вызывало сокращение мышц голени, включая наружный разгибатель пальцев стопы, сокращение которого обусловливает разгибание и отведение кнаружи двух латеральных пальцев.

На сроках наблюдения, превышающих 30 сут от момента оперативных вмешательств, на стороне операции отмечалось вынужденное положение пальцев стопы в состоянии сгибания, а также дефекты кожного покрова пальцев и стопы.

Эти раны животные наносили себе самостоятельно в отсутствие внешних видимых причин или стимулов. По всей видимости, причиной данных дефектов стали парестезии на фоне сдавления чувствительных волокон в области экспериментального шва. Вместе с тем ни вынужденное положение пальцев стопы, ни наличие дефектов покровов в области стопы и пальцев не оказывали выраженного влияния на ограничение свободных перемещений животных.

При выполнении ЭНМГ на ранних сроках наблюдения в послеоперационном периоде отмечались признаки денервации мышц-мишеней, пересеченных и восстановленных с помощью кондуитов нервов. В режиме мониторинга мышечной активности визуализировались потенциалы фибрилляции денервированных мышц и множество положительных острых волн (рис. 4).

Рис. 4. Электрическая активность денервированной в эксперименте икроножной мышцы на 10-е (а) и 30-е (б) сутки после экспериментального оперативного вмешательства.

По результатам стимуляционной ЭНМГ, даже на поздних сроках наблюдения (100 и 140 сут после операции) не удалось зафиксировать отчетливый моторный ответ мышц-мишеней восстановленных нервов. Таким образом, результаты ЭНМГ свидетельствовали о полной денервации мышц голени и стопы после соединения проксимального и дистального концов поврежденного в эксперименте седалищного нерва с помощью синтетического кондуита, несмотря на его электропроводимость.

При макроскопическом исследовании области экспериментальных вмешательств отмечалось разрастание соединительной ткани с вовлечением в послеоперационный рубец седалищного нерва. Внутри фиброзных тяжей визуализировались проксимальный и дистальный сегменты соединенного кондуитом нерва. Сам трубчатый имплантат представлял собой эластическое образование цилиндрической формы темного цвета, плотно спаянное с окружающими тканями. Проксимальный сегмент пересеченного и подшитого к кондуиту седалищного нерва внешне не отличался от интактного нерва на контралатеральной конечности. Дистальный сегмент седалищного нерва, подшитого к кондуиту, визуально имел меньший, чем проксимальный конец, диаметр и выглядел практически обесцвеченным.

В ходе морфологического исследования на микропрепаратах продольных и поперечных срезов седалищных нервов в области экспериментальных оперативных вмешательств визуализировался частично резорбированный трубчатый имплантат с фиксированными к нему проксимальным и дистальным концами пересеченного нерва. Выше области оперативного вмешательства структура седалищного нерва не имела отличий от контралатеральной интактной конечности (рис. 5). Внутри периневральных футляров визуализировались миелинизированные нервные волокна без признаков дегенеративных изменений. Со стороны проксимального конца подшитого к кондуиту нерва отмечалось истончение соединительнотканных оболочек в зоне наложения микрохирургических швов. Нервные волокна характеризовались разнонаправленным расположением, причем на препаратах одновременно визуализировались как продольно, так и поперечно расположенные волокна по отношению к плоскости среза.

Рис. 5. Структура тканей седалищного нерва на стороне операции.

а — проксимальный сегмент выше зоны оперативного вмешательства; б — на уровне середины трубчатого импланта; в — дистальный сегмент седалищного нерва, подшитого к кондуиту (поперечные срезы, окраска гематоксилином и эозином, ув. ×40).

Внутри трубчатого имплантата нервные волокна визуализировались только вблизи проксимального конца. Расположение визуализированных нервных волокон также не являлось линейным. В просвете среднего и дистального отделов кондуита отмечалось только наличие синтетических волокон, формировавших стенки кондуита, окруженных соединительнотканными и клеточными элементами.

Дистальный сегмент нервного ствола, подшитого к кондуиту, характеризовался признаками полной дегенерации нервных волокон. Внутри периневральных футляров миелинизированных нервных волокон отмечено не было. Внутри пучков седалищного нерва располагались шванновские клетки, разделенные большим количеством соединительной ткани.

Обсуждение

Замещение обширных дефектов нервов с помощью синтетических кондуитов не теряет актуальности среди исследователей. Имеющиеся в настоящее время технологии позволяют создавать различные виды имплантатов для соединения проксимального и дистального концов пересеченного нерва. Применение синтетических кондуитов для замещения дефектов поврежденных нервов потенциально способно создавать условия для восстановления утраченной иннервации без дополнительной ятрогенной травмы нервов, неизбежной при использовании для этой цели аутонейротрансплантатов [21, 22]. Однако становится очевидной необходимость применения широкого спектра приемов, стимулирующих направленный рост регенерирующих нервных волокон через трубчатый имплантат [23—25]. В результате проведенного исследования выяснено, что регенерирующие нервные волокна из состава проксимального сегмента поврежденного нерва заполнили просвет кондуита, но их продвижение в дистальном направлении не имело направленного характера. С учетом опыта исследователей данного направления реконструктивной хирургии применение дополнительных элементов внутри трубчатого имплантата, а также заполнение просветов кондуитов различными средами потенциально способно улучшить результаты экспериментов. Указанные приемы будут апробированы при планировании дальнейших экспериментальных микрохирургических исследований.

Заключение

Соединение концов поврежденного в эксперименте нерва позволило предотвратить ретракцию проксимального и дистального концов вшитого в кондуит нерва, а также препятствовало их вовлечению в послеоперационный рубец. Регенерирующие нервные волокна из проксимального сегмента вшитого в кондуит нерва заполнили внутренний просвет имплантата и сформировали неврому. Таким образом, соединение концов поврежденного нерва с помощью кондуита из полилактида с полипирролом способствует сохранению относительно благоприятных условий для последующих реконструктивных операций на нервах. Использование кондуита из полилактида с полипирролом для соединения концов поврежденных нервов в качестве самостоятельного оперативного приема требует разработки способов стимулирования направленного роста регенерирующих нервных волокон из проксимального сегмента для реиннервации дистального сегмента восстанавливаемого нерва.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Орлов В.П.

Сбор и обработка материала — Орлов В.П., Ништ А.Ю., Сапурина И.Ю., Гаврилюк Б.Л., Толкач П.Г., Стрельцов М.Е.

Статистическая обработка — Орлов В.П., Ништ А.Ю., Гаврилюк Б.Л.

Написание текста — Орлов В.П., Ништ А.Ю., Гаврилюк Б.Л.

Редактирование — Орлов В.П., Ништ А.Ю., Гаврилюк Б.Л.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Orlov V.P.

Data collection and processing — Orlov V.P., Nisht A.Yu., Sapurina I.Yu., Gavrilyuk B.L., Tolkach P.G., Strel'tsov M.Ye.

Statistical processing of the data — Orlov V.P., Nisht A.Yu., Gavrilyuk B.L.

Text writing — Orlov V.P., Nisht A.Yu., Gavrilyuk B.L.

Editing — Orlov V.P., Nisht A.Yu., Gavrilyuk B.L.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.