Введение

Кожные лоскуты широко используются в реконструктивной и пластической хирургии для замещения или закрытия дефектов как врожденного, так и приобретенного характера. Наибольшую проблему представляют дефекты, расположенные на участках тела с минимальной толщиной подкожно-жировой клетчатки (голень, предплечье, тыл кисти или стопы, ушная раковина, некоторые отделы лица). Для достижения наиболее функционального и эстетичного результата пластику дефектов данных областей необходимо проводить тонкими перфорантными лоскутами (кровоснабжающимися от перфорантного сосуда) [1]. Создание тонкого или супертонкого лоскута — довольно трудоемкий процесс, сопровождающийся механическим истончением комплекса тканей под оптическим увеличением с высоким риском повреждения субдермального сосудистого сплетения. Именно в этой связи тонкие лоскуты чаще остальных подвержены частичным некротическим изменениям из-за нарушений гемодинамики в послеоперационный период. Дальнейшее после иссечения некроза лечение обычно требует больших временных затрат, ежедневных перевязок для обеспечения вторичного заживления или повторных операций. Для преодоления данной проблемы многие исследования показывали сохранение существующей микроциркуляции за счет фармакологических средств. Основным недостатком данного метода является необходимость системного применения довольно больших дозировок, что сопровождается повышением выживаемости лоскутов, однако и ростом побочных реакций организма [2, 3].

В последние годы в литературе появляется множество данных о способности стромально-васкулярной клеточной фракции (stromal vascular fraction — SVF) стимулировать ангиогенез. Так в исследованиях S. Atalay и соавт. [4] зарегистрировано достоверное повышение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) у крыс при введении SVF в дерму при лечении ожогов на 3-и и 10-е сутки по сравнению с контролем. Помимо VEGF такие факторы ангиогенеза, продуцируемые клетками SVF, как ßFGF, HGF, PDGFB, TGFß, также участвуют в росте сосудов [5, 16]. Данный факт оказал воздействие на появление результатов исследований о влиянии SVF на выживаемость микрохирургических кожных лоскутов в эксперименте. Большое количество работ в последние годы указывают на стимуляцию ангиогенеза мезенхимальными стволовыми клетками и стволовыми клетками жировой ткани (как выделенной частью SVF) в лоскутах прямой мышцы живота крыс, а также в лоскутах на широком основании. Исследования показывают почти полное отсутствие некрозов в дистальных частях лоскутов при местной стимуляции тканей клеточными продуктами [6—14].

Однако вопрос профилактики нарушения кровообращения в тонких и супертонких перфорантных лоскутах остается открытым. А учитывая возможное применение клеточного продукта для регуляции ангиогенеза в комплексе тканей, стоит говорить о подготовке лоскута, или его префабрикации. Термин «префабрикация» был впервые введен Шеном в 1982 г., он описывает имплантацию сосудистой ножки на новую территорию, за которой следует период созревания и неоваскуляризации, а затем перенос ткани на основе ее имплантированной ножки. Из этого следует, что в основе процесса префабрикации лежит неоангиогенез [15].

Цель работы — улучшить ангиогенез тонких перфорантных лоскутов крысы за счет префабрикации тканей стромально-васкулярной клеточной фракцией.

Материал и методы

Эксперимент проводили на половозрелых самцах белой лабораторной крысы линии Wistar (n=36). Анестезия производилась с помощью наркозного аппарата для животных с использованием фторотана или севорана. У крысы в паховой области билатерально иссекали ингуинальный жир (3 г) (рис. 1).

Рис. 1. Техника операции по резекции ингуинального жира у крысы.

Из полученного материала с помощью стандартного ручного протокола по выделению SVF, подробно описанному В.Б. Карпюк и соавт. [17], за исключением использования клеточной среды DMEM/F12, получали клеточную взвесь в объеме до 1 мл. Цитометрия клеточной взвеси не проводилась, так как при соблюдении всех этапов забора жира, а также ферментативного выделения SVF из него опирались на многочисленные литературные данные и источники, описывающие клеточный состав полученной фракции.

При выборе дизайна перфорантного лоскута отметили, что в области заднебоковой поверхности грудной стенки крысы кожу кровоснабжают три перфорантных источника, а именно: перфорантные сосуды лопаточной артерии, боковой грудной артерии и поясничной артерии. Для проведения эксперимента у подопытной крысы выполняли подъем кожно-жирового лоскута заднебоковой поверхности грудной стенки с сохранением лишь одного источника кровоснабжения — из перфорантных ветвей боковой грудной артерии, таким образом оставляя целым лишь один перфорасом. Учитывая субдермальные связи между перфорасомами и их влияние на выживаемость любого перфорантного лоскута, опытной группе (n=13) выполняли хирургическое удаление подкожной жировой клетчатки до сосочкового слоя дермы на половине лоскута, убирая сосуды соседних перфорасом (рис. 2).

Рис. 2. а — техника операции по поднятию перфорантного лоскута боковой грудной артерии крысы и визуализация сосудистого рисунка методом диафаноскопии; б — стрелкой указан основной перфорантный сосуд, идущий от боковой грудной артерии, белые и черный контуры очерчивают соседние перфорасомы; в — голубой квадрат очерчивает часть лоскута, откуда острым путем убирали все сосуды соседних перфорасом, а голубыми крестами показаны точки введения взвеси SVF в толщу лоскута.

Данный процесс контролировали с помощью просвечивания лоскута белым рассеянным светом (диафаноскопии). В травмированный таким образом лоскут папульно, с помощью инсулинового шприца с иглой 30G, вводили заранее приготовленную клеточную взвесь SVF. Введение осуществляли во внутреннюю поверхность лоскута по всей его поверхности и в область массива тканей с сосудистой ножкой. В контрольной группе (n=13), используя такой же дизайн лоскута, вводили физиологический раствор. Всем животным для контроля результата на спине выкраивали свободный аутодермотрансплантат с подлежащей подкожной жировой клетчаткой и укладывали его на место с краевой фиксацией нитью Prolene 5-0 (рис. 3).

Рис. 3. Внешний вид животного после операции с фиксированными нитью Prolene 5-0 лоскутом и аутодермотрансплантатом на спине.

В раннем послеоперационном периоде животные получали обезболивание Sol. Promedoli.

Макроскопический контроль и фотографирование производили на 3-и, 9-е и 11-е сутки. Животные выводились из эксперимента группами: n=5 — на 3-и сутки после операции, n=6 — на 9—11-е сутки после операции как в опытной так и в контрольной группах, а полученные образцы лоскутов и аутодермотрансплантатов отправляли на гистологическое (окраска гематоксилином и эозином) и иммуногистохимическое исследования (маркеры CD34 QBEnd/10, SMA 1A4). Оценивали наличие или отсутствие некротических изменений, выживание зон кровоснабжения лоскутов, сосудистый рисунок методом диафаноскопии, а также неоангиогенез при микроскопии препаратов.

Результаты

В опытной группе при визуальном осмотре определялось полное отсутствие зон некроза мягких тканей истонченных перфорантных лоскутов у животных, которым интраоперационно вводили SVF.

В контрольной группе отмечали появление и прогрессирование некроза тканей в отдаленных от основного перфорантного сосуда зонах лоскута (где поводили механическое удаление подлежащих тканей) начиная с 3-х суток (рис. 4).

Рис. 4. а — состояние лоскута + SVF на 3-и сутки после операции (n=5); б — состояние лоскута + SVF на 9—11-е сутки после операции (n=6); в — состояние лоскута на 3-и сутки после операции, лоскут без SVF (n=5); г — состояние лоскута на 9—11-е сутки после операции, лоскут без SVF (n=6).

При подъеме лоскута при диафаноскопии на 3-и сутки в опытной группе отмечали бурный сосудистый рост (сосуды 3-го и 4-го порядка) в тонком лоскуте. При этом визуально четко был виден направленный рост сосудов из сохранившегося перфорасома. В контрольной группе отмечали полное визуальное отсутствие сосудов в истонченной области. При гистологическом исследовании в образцах лоскутов с SVF отмечали густую сосудистую сеть в дерме, состоящую из молодых сосудов на 3-и сутки и сети сосудов разной степени зрелости на 9—11-е сутки (рис. 5).

Рис. 5. а—г — лоскуты на диафаноскопии после поднятия; б—д — лоскуты на диафаноскопии после механической обработки; в — макроскопическая картина неоангиогенеза на диафаноскопии на 3—4-е сутки после операции; е — макроскопическая картина неоангиогенеза на диафаноскопии на 9—11-е сутки после операции; ж, з, и — картина некроза лоскутов без SVF на 3-и, 9-е и 11-е сутки соответственно.

В контрольной группе отмечали гистологическую картину некроза, геморрагического пропитывания и лейкоцитарной инфильтрации при полном отсутствии сосудов. Данная картина повторяла гистологическое исследование аутодермотрансплантатов как в опытной, так и в контрольной группе (рис. 6).

Рис. 6. Гистологическая картина неоангиогенеза лоскутов (окраска гематоксилином и эозином).

а—б — стрелками показаны молодые сосуды на 3-и сутки после операции; в—г — стрелками показаны более зрелые сосуды на 9-е сутки после операции; д—е — бессосудистые части лоскутов с участками некроза без SVF на 3-и и 9-е сутки соответственно.

При иммуногистохимическом исследовании используемые маркеры были направлены на типирование эндотелия сосудов. Исследования подтвердили данные гистологии, выявив как многочисленные сети молодых сосудов, так и зрелые сосудистые элементы в лоскутах, где ангиогенез был потенцирован SVF (рис. 7).

Рис. 7. Иммуногистохимическое исследование лоскутов.

а—б — лоскуты + SVF на 3-и и 9-е сутки соответственно. Стрелками показаны молодые сосуды на 3-и сутки. Эндотелий сосудов разной степени зрелости на 9-е сутки; в—г — лоскуты без SVF на 3-и и 9-е сутки соответственно. Малочисленные сосуды, очаги инфильтрации тканей.

Обсуждение

Проведя данное экспериментальное исследование, удалось выявить, что местная стимуляция сосудистого роста как проявление префабрикации тонких перфорантных лоскутов происходит за счет описанных в литературе механизмов паракринной стимуляции мезенхимальными стволовыми клетками. При этом сосудистый рост в ишемизированные ткани потенцированно идет из близлежащего источника кровоснабжения и наступает довольно рано — молодые сосуды мы видели уже на 3-и сутки. На 11-е сутки сосудистая сеть была настолько выраженной, что в истонченной части лоскута наблюдали сосуды 3-го и 4-го порядка. Плотность сосудов подсчитана на 1 мм² и отражена на рис. 8.

Рис. 8. Плотность сосудов в лоскуте на микропрепаратах после проведения исследования.

Макроскопическая диафаноскопия также подтверждает гистологическое и иммуногистохимическое исследования.

Данные исследования показали, что подготовка тонких и супертонких перфорантных лоскутов может проходить с контролируемым ангиогенезом из единственного оставшегося перфорасома, это может позволить производить максимально возможное истончение перфорантных лоскутов с механическим повреждением субдермальных связей между перфорасомами и сохранением кровоснабжения всего лоскута в клинической практике.

Воздействие SVF на стимуляцию и, возможно, модуляцию ангиогенеза в комплексе тканей является очевидным при проведении данного исследования, так как в контрольной группе животным вводили физиологический раствор, отмечая частичную или полную гибель лоскутов. Те же проявления некробиоза отмечали и в опытной, и в контрольной группе в свободных дермотрансплантатах без инъекции как SVF, так и физиологического раствора.

Выводы

Применение SVF для контролируемого ангиогенеза в тонких микрохирургических перфорантных лоскутах имеет большое практическое значение и открывает новые возможности в префабрикации и дальнейшей преламинации комплексов тканей для замещения дефектов лица и конечностей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, сбор материала, написание текста — И.Б. Казанцев

Сбор материала, дизайн исследования, редактирование — А.И. Цуканов

Концепция исследования, редактирование — В.В. Иванов

Сбор материала, концепция исследования — О.А. Кайдаш

Проведение гистологического и иммуногистохимического исследований — А.С. Жевняк

Сбор материала — В.И. Коробейникова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.