Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности

Беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. В это время возрастает численность Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), обладающих иммуносупрессивным действием [2]. Системные иммунные реакции смещаются в сторону гуморального ответа (феномен Th2-девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [1]. Помимо этого периферическая толерантность формируется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [14].

Изучение роли гормонов беременности в качестве причин данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии. Хорионический гонадотропин (ХГ), который продуцируется во время беременности, не только играет существенную роль в регуляции стероидогенеза в плаценте и у плода [11], но и обладает иммуномодулирующим действием [1]. Важно отметить, что максимальная концентрация ХГ в период гестации совпадает с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC) на клеточной поверхности эмбриона (7—10 нед), распознавание которых может привести к процессам иммунного отторжения [2]. ХГ способствует Т-хелперному ответу 2-го типа (Th2) [1], непосредственно связываясь с поверхностью Т-лимфоцитов [17]. Кроме того, он регулирует активность фагоцитирующих клеток [1].

Цель работы —оценить влияние ХГ на синтез Т-лимфоцитами интерлейкина-4 (IL-4) и интерферона-γ (IFN-γ), индукцию адаптивных Treg, а также экспрессию IDO моноцитами, а также их фагоцитарную и окислительную активности.

Материал и методы

Исследование проводили на мононуклеарах периферической крови (МПК), выделенных из венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. ХГ применяли в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл (соответствующих уровню гормона во II—III и I триместры беременности) [18].

МПК культивировали с ХГ в среде 199 с добавлением 10% ЭТС («Sigma», США), 10 мМ Hepes («ICN Рh.», США), 2 мМ L-глутамина («ICN Рh.», США) и 100 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения) в течение суток в условиях 5% СО₂. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 является основным маркером Treg, количество последних оценивали как процент CD4⁺CD25^bright Foxp3⁺ клеток (Anti-Human Foxp3-Alexa Fluor 488, 206D) в гейте CD4⁺CD25^bright лимфоцитов (PE/Cy5 anti-human CD4, OKT4; PE anti-human CD25, BC96).

Для оценки внутриклеточного синтеза цитокинов в CD3⁺CD4⁺- и CD3⁺CD8⁺-лимфоцитах использовали фикоэритрин-конъюгированные антитела к IL-4 и IFN-γ («Caltag», CША). Для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали форболмиристацетат (PMA) (50 нг/мл, «Sigma», США,) в комбинации с иономицином (50 мкг/мл, «Sigma», США), затем применяли брефелдин А (10 мкг/мл, «ICN Рh.», США), согласно стандартной методике. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США).

Активность IDO определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина — первого стабильного метаболита триптофана [6]. Поскольку IDO продуцируется только антиген-презентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, полученные результаты интерпретировали как продукцию IDO моноцитами. МПК, стимулированные IFN-γ (10 нг/мл, «Вектор Бест», Россия) или липополисахаридом (ЛПС) — 100 нг/мл («Sigma», США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкM триптофана («Sigma», США) в течение 4 ч. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. В лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 (США).

Фагоцитарную активность моноцитов определяли после часовой инкубации с ХГ по степени снижения свечения люминесцентного генно-инженерного штамма фагоцитируемых бактерий E.coli lux⁺ с использованием люминометра Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты оценивали по индексу фагоцитарной активности (ИФА), отражающего процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100×(Х₁–Х₂)/Х₁, где Х₁ — интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х₂ — то же опытной пробы (бактерии⁺фагоциты) [3].

Окислительную активность моноцитов определяли в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Для этого после часовой инкубации с ХГ измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Активаторами фагоцитов в стимулированном варианте ЛЗХЛ (20 мин) служили опсонизированные бактерии E.coli (штамм К-12). Для измерений использовали люминометр Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты выражали в относительных световых единицах — RLU (related light units).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Учитывая значение баланса IFN-γ и IL-4, продуцируемых Т-лимфоцитами, для сохранения беременности [2], в начале исследовали влияние ХГ на способность CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺ Т-лимфоцитов продуцировать данные цитокины. Как видно на рис. 1,

Рисунок 1. Влияние ХГ на внутриклеточный уровень цитокинов (IL-4 и INF-γ) в лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=9). 1 — CD4⁺ IFN-γ⁺, 2 — CD4⁺IL-4⁺, 3 — CD8⁺ IFN-γ⁺, 4 — CD8⁺IL-4⁺. Здесь и на рис. 2: * — p<0,05 по отношению к контролю.

суточная инкубация МПК (100 МЕ/мл) с ХГ приводила к повышению процента IL-4-позитивных CD3⁺CD4⁺T-клеток. В то же время гормон не влиял на внутриклеточную продукцию IFN-γ и IL-4 CD3⁺CD8⁺Т-лимфоцитами, равно как и на продукцию IFN-γ CD3⁺CD4⁺T-клетками. Таким образом, в концентрации, характерной для I триместра беременности, ХГ может являться одним из факторов, способствующих формированию иммунного ответа по Тh2-типу.

Далее установлено, что суточная инкубация МПК с ХГ (10 и 100 МЕ/мл) увеличивает процент CD4⁺CD25^brightFoxp3⁺ клеток в культуре (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние ХГ на экспрессию Foxp3 в гейте CD4⁺CD25^bright лимфоцитов периферической крови женщин in vitro (n=9).

Так как результат оценивался после суточной инкубации, а для пролиферации естественных Treg требуется от 4 до 7 сут [8], стимулирующий эффект ХГ можно интерпретировать как способность увеличивать долю только адаптивных Treg.

Во время беременности пул Treg в периферической крови возрастает как за счет пролиферации естественных Treg, так и за счет индукции адаптивных Treg (экспрессия молекулы Foxp3) [10]. Важно отметить, что в механизме передачи сигнала участвует цAMФ [2], повышение уровня которого приводит к экспрессии молекулы Foxp3 [5]. Не исключено, что увеличение относительного количества Treg в периферической крови на ранних сроках нормальной беременности [10] связано именно с действием ХГ.

Спонтанная активность IDO в нормальных МПК практически не определяется, поэтому при оценке влияния ХГ на активность данного фермента мы использовали стандартные индукторы — ЛПС и IFN-γ [13]. ХГ (100 МЕ/мл) достоверно усиливал активность IDO в ЛПС-стимулированных МПК и не влиял на ее активность при стимуляции клеток IFN-γ (табл. 1).

Взаимодействие ЛПС с Toll-подобным рецептором 4 (TLR-4) вовлекает МАРК-киназный (митоген-активированная протеинкиназа) каскад с последующей активацией ядерного транскрипционного фактора NF-κB [13]. По-видимому, ХГ является коактиватором TLR4-зависимой индукции IDO.

При оценке фагоцитарной активности установлено, что ХГ угнетает фагоцитоз E.coli lux⁺ моноцитами периферической крови (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов женщин в отношении E. coli lux⁺ (n=8). a — p<0,05 в отношении эффекта высокой дозы ХГ, b — то же в отношении низкой его дозы.

Данный эффект зависел от концентрации гормона. Так, в малой концентрации (10 МЕ/мл) ХГ угнетал фагоцитарную активность только в первые 15 мин, после чего моноциты восстанавливали свою функциональную активность, а в концентрации 100 МЕ/мл (соответствующей I триместру беременности) гормон подавлял фагоцитоз на протяжении всего исследуемого периода.

В отношении спонтанной ЛЗХЛ моноцитов, которая отражает исходный уровень окислительного метаболизма клеток, установлено, что только высокая концентрация ХГ (100 МЕ/мл) угнетает продукцию активных форм кислорода. В то же время на ЛЗХЛ стимулированных E. coli моноцитов ХГ не влиял (табл. 2).

Таким образом, ХГ подавлял фагоцитарную и окислительную активность моноцитов, оказывая более выраженный эффект в концентрации 100 МЕ/мл, соответствующей I триместру беременности. Возможно, что снижение функциональной активности моноцитов определяет один из механизмов предупреждения антифетальных реакций и защиты собственных тканей от повреждения в этот период гестации.

На рис. 4

Рисунок 4. Роль ХГ в формировании иммунологической толерантности при физиологически протекающей беременности. ЦТЛ — цитотоксические лимфоциты.

представлена гипотетическая схема, суммирующая полученные результаты. Гормон избирательно активирует синтез IL-4 T-клетками, настраивая их функциональную активность по Th2-цитокиновому типу. К этому присоединяется способность ХГ увеличивать пул адаптивных Treg, одновременно костимулируя TLR-индуцированную активность IDO моноцитов. Известно, что при контакте молекул CTLA-4, представленных на Treg, с лигандами В7.1/2, которые экспонированы на антигенпрезентирующих клетках (моноцитах), экспрессия IDO в последних усиливается [9]. В свою очередь, клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации адаптивных Treg из CD4⁺CD25–-лимфоцитов [7]. В то же время активация IDO может приводить к гибели цитотоксических лимфоцитов вследствие дефицита необходимой для их активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, таких как кинуренин [15]. Важно отметить, что наиболее выраженными эффектами обладает концентрация ХГ (100 МЕ/мл), которая наблюдается в I триместре беременности, т.е. в период экспрессии антигенов MHC I класса на клеточной поверхности эмбриона, распознавание которых может привести к его отторжению.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ является одним из факторов, способствующих поддержанию иммунологической толерантности при беременности.

Выводы

1. ХГ в концентрации сопоставимой с его уровнем в I триместре беременности (100 МЕ/мл) достоверно увеличивает процент CD3⁺CD4⁺T-лимфоцитов, содержащих молекулы IL-4.

2. Гормон не оказывает влияния на внутриклеточную продукцию IFN-γ и IL-4 в субпопуляции CD3⁺CD8⁺Т-лимфоцитов, равно как и на продукцию IFN-γ CD3⁺CD4⁺T-клетками.

3. Независимо от концентрации ХГ достоверно повышает процент CD4⁺CD25^brightFoxp3⁺ клеток in vitro, одновременно повышая активность индоламин-2,3-диоксигеназы в ЛПС-стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови.

4. Гормон угнетает фагоцитоз E. coli lux⁺ моноцитами и подавляет спонтанную продукцию активных форм кислорода в реакции люминолзависимой хемилюминесценции.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».