Введение

Одной из задач восстановительной медицины является реабилитация лиц, пострадавших от травм, болезни или неблагоприятных воздействий внешней среды, и восстановление функциональных резервов человеческого организма [1, 2]. В настоящее время особую актуальность приобретает эффективная реабилитация пациентов, получивших ожоговые травмы в условиях современных боевых действий. При этом несмертельные ожоги являются одной из основных причин осложнений, длительной госпитализации и инвалидности. В литературе имеются единичные данные по применению клеточных технологий при лечении ожогов [3—5]. Характер течения раневого процесса, частота перевязок и потенциальный риск осложнений (хронические раны, инфекционные осложнения) — основные факторы, влияющие на время заживления ран и, как следствие, на стоимость лечения, эффективность и продолжительность реабилитационных процедур, в том в том числе проводимых в санаторно-курортных учреждениях [1—3].

Современные ранозаживляющие средства (и в рамках комплексного подхода, и как самостоятельный метод лечения) остаются необходимыми препаратами при лечении кожных ран как в стационарных, так и в амбулаторных условиях [6]. Корректный подбор таких изделий позволяет снизить риск вторичной инфекции, ускорить репарацию тканей, уменьшить травматизм и количество перевязок, сократить время пребывания в стационаре, минимизировать рубец и сохранить функциональность поврежденной ткани [7].

В настоящее время ведется поиск новых технологий лечения, в том числе с использованием раневых покрытий с заданными функциональными качествами, такими как: гипоаллергенность, отсутствие токсического и местного раздражающего действия, атравматичность при использовании и замене, поддержание микросреды, защита от экзогенного инфицирования и др. [8, 9]. Инновационным подходом в конструировании раневых покрытий нового типа может стать технология получения новых гибридных мембранных материалов на основе ионно-трековой мембраны (TM) и нано-каркаса из биополимеров (хитозан, коллаген, гиалуроновая кислота и т.д.).

TM получают путем облучения тонких полимерных пленок, как правило из поликарбоната и полиэтилентерефталата, быстрыми тяжелыми ионами с последующей фотосенсибилизацией и химическим травлением. Традиционно в медицине и биологии TM используют для фильтрации и сепарации клеток и молекул, а также для исследований клеточной миграции, межклеточного взаимодействия, процессов клеточной пролиферации и дифференцировки [10, 11]. Однако к настоящему времени недостаточно полно описаны возможности и перспективы использования TM в качестве компонента раневых покрытий. Между тем наличие микропор (рис. 1) в сочетании с пластичностью TM может обеспечить защиту от инвазии экзогенной микрофлоры, газо- и водопроницаемость [12].

Рис. 1. Скан поверхности полиэтилентерефталатной ионно-трековой мембраны.

Ув.: а — 6000×, б, в — 20000×.

В настоящем исследовании использовали TM из полиэтилентерефталата, поскольку он обладает биологической инертностью и используется в протезировании и реконструктивной хирургии [13, 14]. Для придания TM новых функциональных свойств использовали метод электроформирования на поверхности TM биослоя из хитозана и коллагена.

Метод электроформирования хорошо известен и используется при создании тканеинженерных конструкций. Преимущество данного метода в том, что он позволяет регулировать физико-химические и биологические свойства нановолокон. Однако сам метод комбинации TM и электроформирования нановолокон является сравнительно новым и требует дополнительных исследований. В то же время хитозан и коллаген являются достаточно хорошо изученными биополимерами, применяемыми в восстановительной медицине, тканевой и клеточной инженерии [15—17].

Цель исследования — охарактеризовать влияние раневого покрытия на основе TM, модифицированной нановолокнами из коллагена и хитозана, на эффективность восстановления кожных покровов у экспериментальных животных после тяжелого термического ожога.

Материал и методы

Экспериментальные исследования in vitro были выполнены на базе ФГБУ «Национальный исследовательский центр реабилитации и курортологии» Минздрава России.

В качестве основы была использована полиэтилентерефталатная пленка, перфорированная ионами тяжелых металлов (Xe, Kr) на ускорителе ядерных частиц. Компоненты биопластического материала (коллаген, хитозан) последовательно вносили в раствор в концентрациях 27 мг/мл и перемешивали до полного растворения. Нанесение биополимерного слоя из раствора проводили методом электроспиннинга с использованием установки Nanon-01A (MECC Co., LDT, Япония). Для стабилизации биослоя использовали термическую (120 °C, 60 мин) обработку [12]. Изготовление композитного биоматериала проводили в Объединенном институте ядерных исследований (Дубна).

Адгезивные свойства биоматериалов

Оценку адгезивных свойств биоматериала оценивали по количеству фибробластов, прикрепившихся к поверхности образцов. Для улучшения визуализации клеток проводили предварительное окрашивание витальным флуоресцентным красителем PKH-26.

Предварительно простерилизованные спиртом и УФ-облучением образцы (диаметр 5 мм) помещали в лунки 96-луночных планшетов из расчета один образец на лунку, общее количество повторов для каждого образца — 5 шт. Во всех экспериментах, где не указано иное, использовали питательную среду ДМЕМ, содержащую 10% фетальную бычью сыворотку (ФБС) и 1% раствор пенициллина-стрептомицина. Инкубировали в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂). Через 6 ч с использованием световой и люминесцентной микроскопии оценивали количество фибробластов на поверхности исследуемых образцов.

Пролиферативная активность клеток

Оценку пролиферативной активности проводили при совместной инкубации исследуемых образцов с фибробластами человека. Для улучшения визуализации клеток выполняли предварительное окрашивание клеток витальным флуоресцентным красителем PKH-26.

Для характеристики пролиферативной активности в лунки 96-луночного планшета поместили заранее простерилизованные спиртом и УФ-облучением образцы (диаметр 5 мм), из расчета один образец на лунку, общее количество повторов для каждого образца — 5 шт. Затем в лунки внесли 0,1 мл питательной среды, содержащей фибробласты в количестве 2∙10⁴ шт/мл.

Через 24, 48 и 72 ч после совместной инкубации образцов с фибробластами оценивали количество и морфометрические характеристики клеток. Для этого использовали микроскоп Leica (Leica Microsystems, Германия) и методы светового, поляризационного и люминесцентного наблюдения. Пролиферативную активность оценивали, подсчитывая количество клеток на 20 квадратах площадью 0,1 мм².

Выделение моноцитов периферической крови человека (PBMCh)

Выделение PBMCh из крови человека проводили центрифугированием в градиенте плотности на Ficoll-1077. Для этого 300 мл свежевзятой крови смешивали в соотношении 1:1 (об./об.) с фосфатно-солевым буфером (ФСБ), затем 30 мл суспензии наслаивали на 15 мл Ficoll-1077, используя для этого пробирки объемом 50 мл, процедуру проводили при комнатной температуре. Затем пробирки центрифугировали при 500g в течение 30 мин. Лейкоцитарную пленку аккуратно собирали шприцем и ресуспендировали в ФСБ, после чего центрифугировали при 500g в течение 20 мин. Лейкоцитарные пленки аспирировали и промывали ледяным ФСБ и центрифугировали при 500g в течение 8 мин при 4 °C. Собранные PBMCh культивировали в течение ночи в RPMI-1640 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина и 10 об.% инактивированной нагреванием ФСБ в 12-луночных планшетах во влажной атмосфере (5 об.% CO₂, 37 °C).

Оценка маркеров клеточной дифференцировки

Изолированные PBMC вносили в лунки 12-луночного планшета в количестве 1∙10⁶/мл, после чего к клеточной суспензии добавляли исследуемые образцы в количестве 10 гранул. Культивирование проводили в 1 мл питательной среды RPMI-1640 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина, в стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂). Через сутки кондиционированную среду извлекали, аликвотировали и хранили при −70 °C. Профиль антигенов дифференцировки лейкоцитов человека (CD14, CD16, CD163, CD206) определяли согласно инструкции производителя (BD Bioscience) на проточном цитометре BD FACSCanto II.

Индукция термического ожога на экспериментальных животных

Исследования на экспериментальных животных (крысы Wistar) проводили в Институте физиологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар). Все исследования были одобрены Локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ РК» (протокол №1 от 05.03.2023). В исследовании использовали половозрелых самцов крыс линии Wistar с массой тела 200—250 г, в количестве 60 шт.

Все хирургические манипуляции с животными выполняли в соответствии с этическими принципами (принципы «3R»: replacement, reduction, refinement) под общим наркозом для уменьшения стресса и болевых ощущений. Условия содержания и процедура эксперимента соответствовали стандартам GLP. Температура воздуха в помещении составляла 24 °C, влажность — 55—60%, длина светового дня — 12 ч. Экспериментальные животные имели свободный доступ к воде и пище.

Для индукции ожога использовали стеклянную емкость цилиндрической формы объемом 0,5 л. Емкость заполняли водой и нагревали на водяной бане до 90 °C. Ожог индуцировали, прикладывая суженную часть емкости, закрытую теплопроводящей металлической крышкой, к коже крыс в межлопаточной области. Перед индукцией термического ожога крыс анестезировали с использованием внутримышечной инъекции анестетика общего диссоциативного действия (Золетил, Virbac, Франция), затем у крыс брили межлопаточную область, после чего прикладывали емкость к поверхности кожи на 60 с. Площадь контакта теплопроводящего элемента с кожей крыс составляла 1,7 см². Через каждые 48 ч область ожога фотографировали и визуально оценивали клиническую картину ожоговой травмы (гиперемию, отечность, признаки инфекции и т.д.). Площадь ожога оценивали с использованием программного обеспечения Altami Studio.

Животных выводили из эксперимента на 21-е сутки, область ожога вскрывали, проводили фотосъемку прилегающих и подлежащих тканей, извлекали фрагменты ткани для гистологического исследования.

Статистическая обработка результатов

Для проверки нормальности распределения использовали тест Колмогорова—Смирнова. Количественные данные в случае нормального распределения представлены в виде M±SD, где M — среднее значение, SD — стандартное отклонение. При отсутствии нормального распределения количественные данные представлены в виде Me [Q₁; Q₃], где Me — медиана, Q₁, Q₃ — нижний и верхний квартили соответственно. Сравнение количественных показателей между группами при нормальном распределении проводили с помощью t-критерия Стьюдента. При сравнении распределения, отличного от нормального, использовали критерий Манна—Уитни для сравнения различий между двумя независимыми выборками. Все различия считались значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Гибридный биоматериал (BioTM) представляет собой перфорированную полиэтилентерефталатную мембрану, на который методом электроформирования нанесен биослой из смеси хитозана и коллагена (рис. 2). Исследование структуры BioTM с использованием сканирующей электронной микроскопии показало, что толщина TM и толщина напыленного биослоя составляла 23 и 45 мкм соответственно (см. рис. 2, в). Основным структурным элементом биослоя являлись спонтанно переплетенные между собой волокна толщиной 170±40 нм (см. рис. 2, г).

Рис. 2. Изображение полиэтилентерефталатной мембраны до (а) и после нанесения биокомпозитного слоя (б); изображение поверхности ионно-трековой мембраны, полученное с использованием растрового электронного микроскопа Hitachi S-3400N (в, г).

Ув.: в —800×, г — 10000×.

Сопоставление полученных результатов с данными литературы показало, что подобная структура поверхности характерна для всех биоматериалов, полученных методом электроформования [18], в том числе и для сформированных на поверхности мембран [19].

На следующем этапе исследования оценивали биосовместимость гибридного биоматериала BioTM. Адгезивные свойства оценивали по количеству фибробластов, прикрепившихся к поверхности BioTM через 1 ч совместной инкубации. В качестве сравнения использовали мембрану без напыленного биослоя (TM).

В контроле, через 1 ч после инкубации, на поверхности культурального пластика насчитывалось 166±53 клетки на 1 мм² (рис. 3, а). Установлено, что поверхность TM обладает слабыми адгезивными свойствами в отношении фибробластов человека (см. рис. 3, б). Выявлено, что модификация TM электропрядным биослоем из смеси коллагена и хитозана увеличивает количество клеток, адгезированных на поверхности биоматериала. При этом количество адгезированных клеток на поверхности BioTM было сопоставимо с контрольными значениями и составляло 160±40 на мм² (см. рис. 3, в).

Рис. 3. Фибробласты на поверхности культурального пластика (а), TM (б) и BioTM (в).

Люминесцентная микроскопия, окрашивание DAPI, ув. 100×.

Кроме адгезивных свойств оценивали способность биоматериалов поддерживать жизнеспособность фибробластов. В контроле, через 72 ч культивирования в стандартных условиях, фибробласты приобретали вытянутую веретеновидную форму с развитыми псевдоподиями нитевидной формы. Длина клеток с учетом филоподий составляла 107±20 мкм (рис. 4, а). При тех же условиях культивирования на поверхности TM клетки не были обнаружены (см. рис. 4, б), что говорит о биологической инертности материала. Установлено, что на поверхности BioTM клетки, так же как и в контроле, приобретают вытянутую форму, длина фибробластов составила 110±17 мкм (см. рис. 4, в).

Рис. 4. Фибробласты на поверхности культурального пластика (а), TM (б) и BioTM (в).

Люминесцентная микроскопия, окрашивание PKH-26, ув.100×.

Таким образом, полученные результаты указывают на модификацию биофункциональных свойств исходной TM, а именно придание ей способности адгезировать на своей поверхности клетки и поддерживать их в функционально активном состоянии. Кроме цитосовместимости немаловажное значение имеет и способность раневого покрытия снижать интенсивность чрезмерного воспалительного ответа.

Центральную роль в процессах репарации поврежденных тканей играет иммунная система. Как воспалительные реакции, так и процессы регенерации ткани регулируются моноцитами и макрофагами. Человеческие моноциты различаются степенью экспрессии на плазматической мембране маркеров клеточной дифференцировки: маркер CD14 (ЛПС-рецептор) и маркер CD16 (рецептор Fc-фрагмента IgG). PBMCh, экспрессирующие CD14-маркер, относятся к классическим моноцитам и составляют 80—90% всей популяции моноцитов. Как правило, эти клетки секретируют незначительное количество провоспалительных цитокинов и обладают высокими фагоцитарными характеристиками. Неклассические PBMCh, экспрессирующие CD16, составляют примерно 5% популяции и характеризуются высоким уровнем секретируемых провоспалительных цитокинов [20].

Хорошо известно, что фенотип макрофагов M1 является провоспалительным и связан с патогенезом, фенотип макрофагов M2 является прорегенеративным и обусловливает процессы репарации ткани. Ремоделирование ткани может усложняться, когда возникает дисбаланс в присутствии провоспалительных и противовоспалительных макрофагов в ткани. Нарушение регуляции этих процессов может приводить к стойкому воспалению и прогрессирующему повреждению тканей. Содействие переходу макрофагов от фенотипа M1 к фенотипу M2 потенциально может быть действенным терапевтическим подходом для облегчения регенерации тканей [21, 22].

Таким образом, оценка функциональных реакций клеток участвующих в воспалительно-репаративных процессах является актуальным направлением в конструировании биоматериалов с заданными медико-биологическими свойствами. В этой связи одной из задач этого этапа исследования являлось оценить влияние гибридного биоматериала на функциональную активность PBMCh.

Оценивали влияние BioTM и TM на спонтанную активацию PBMCh. В контроле, сразу после выделения клеток из периферической крови, количество моноцитов, экспрессирующих CD14- и CD16-рецепторы, составило 87±5 и 10±4% соответственно. Полученные результаты согласуются с данными литературы [18] и указывают на нормальное распределение фенотипов в популяции PBMCh-клеток. Через 48 ч инкубации количество CD14-клеток снизилось и составило 68±3%, количество PBMCh, экспрессирующих CD16-рецептор, увеличилось до 28±3% (рис. 5).

Рис. 5. Влияние гибридного биоматериала (BioTM) и ионно-трековой мембраны (TM) на экспрессию маркеров дифференцировки CD14 и CD16.

* — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контролем (n=5).

Выявлено, что сокультивирование PBMCh с BioTM предотвращает спонтанную активацию PBMCh. Количество активированных моноцитов, экспрессирующих CD16-рецептор, составляло менее 10% от клеточной популяции PBMCh. При этом трековая мембрана без нанесенного биополимерного слоя не влияла на спонтанную активацию PBMCh (см. рис. 5).

Оценивали влияние гибридного биоматериала BioTM и TM на дифференцировку моноцитов в M1/M2-фенотипы. Маркеры клеточной поверхности учитывали на PBMCh только в случае, если они экспрессировали CD14-маркер, что указывает на их моноцитарный фенотип.

Установлено, что через 48 ч культивирования в популяции PBMCh присутствуют 3 фенотипа: M0, M1 и M2. Количество недифференцированных клеток (M0-фенотип) составляло порядка 10% от клеточной популяции. Количество PBMCh, экспрессирующих на своей мембране маркер M1- (CD206) и M2-фенотипов (CD163), составляло 35 и 60% соответственно (рис. 6).

Рис. 6. Влияние гибридного биоматериала (BioTM) и ионно-трековой мембраны (TM) на экспрессию маркеров дифференцировки в M1 (CD206) и M2 (CD163) фенотипы на клетках PBMCh через 48 ч совместной инкубации.

* — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контролем (n=5).

Выявлено, что при инкубации PBMCh с образцами BioTM количество клеток, дифференцированных по M1-фенотипу, снижается с 35±3 до 14±2%, при этом увеличивается количество клеток M0-фенотипа и дифференцированных по M2-фенотипу к общему количеству клеток в популяции. Установлено, что TM не оказывает влияния на экспрессию маркеров дифференцировки моноцитарных клеток крови (см. рис. 6).

Таким образом, обобщая результаты исследований, проведенных в условиях in vitro с использованием фибробластов и моноцитарных клеток периферической крови человека, можно сделать следующее заключение: гибридный биоматериал BioTM обладает качествами, соответствующими требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, а именно: газопроницаемостью, биосовместимостьью и способностью ингибировать иммунно-воспалительные клеточные реакции.

Ожоговая травма остается существенной проблемой медицинского и экономического характера. При глубоких ожогах (III степень по МКБ-10) выделяют несколько критических факторов, определяющих исход ожоговой травмы: возраст пациента и дефицит донорского ресурса. Среди основных трудностей, возникающих при хирургическом лечении критических и субкритических ожогов, выделяют: запретные зоны для забора аутотрансплантата (40% поверхности тела), относительный дефицит донорских ресурсов (при аллотрансплантации) и возраст пациентов. Помимо этого, лечение ожоговых больных весьма дорогостоящее и сопровождается сложной медицинской реабилитацией. В связи с этим остается актуальным вопрос о разработке и внедрении в медицинскую практику биоматериалов, способствующих более эффективному лечению и регенерации кожных покровов.

На следующем этапе исследований оценивали влияние гибридного биоматериала BioTM на динамику воспалительно-регенеративного процесса у крыс после индуцированного термического ожога. Сравнивая динамику восстановления кожных покровов крыс, получавших лечение BioTM и TM после индуцированного ожога, следует отметить более быстрое сокращение площади воспаления по сравнению с группой «Левомеколь». Также наблюдается более ускоренное сокращение площади ожогового повреждения у гибридного биоматериала BioTM по сравнению с TM (рис. 7).

Рис. 7. Площадь повреждения кожных покровов крыс после индуцированного термического ожога.

a — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контрольными животными; b — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с получавшими лечение мазью «Левомеколь»; c — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с предыдущей точкой; d — различия достоверны при p<0,05 по сравнению с TM; Me [Q₁; Q₃] (n=10).

Оба типа раневых покрытий (как BioTM, так и TM) обладают способностью изолировать раневую полость от экзогенных патогенов и обеспечивать газообмен. Возможно, именно этими качествами объясняется ранозаживляющая способность TM. Однако дополнительно к изолирующим свойствам BioTM обладает способностью модулировать иммунно-воспалительный ответ со стороны моноцитарных клеток и предотвращать их спонтанную активацию в провоспалительный фенотип. Можно предположить, что способность раневого покрытия BioTM повышать эффективность репаративной регенерации кожи крыс обусловлена именно этими качествами.

Таким образом, на основе полученных результатов можно сделать следующее заключение: раневое покрытие на основе TM и биокомпозитного слоя ингибирует спонтанную активацию моноцитов и их дифференцировку в провоспалительный фенотип. При интеграции биопластического материала с синтетической мембраной функциональные свойства обоих типов материалов сохраняются, что позволяет получить раневое покрытие нового типа с высоким регенеративным потенциалом, превышающим по эффективности традиционную терапию ожогов.

В настоящее время существует востребованность в медицинских изделиях, предназначенных для реабилитации пациентов и регенерации повреждений мягких тканей различного генеза, способных применяться как в полевых условиях, так и в условиях лечебных учреждений [23—25]. Полученные результаты показывают, что раневые покрытия нового типа на основе гибридного биоматериала BioTM позволят повысить эффективность лечения ран, в том числе обширных и глубоких ран.

Простота использования позволяет применять гибридный биоматериал BioTM не только в условиях стационара, но и экстренно, в полевых условиях. Данная стратегия лечения позволит сократить как сроки временной нетрудоспособности, так и снизить число случаев инвалидизации.

Среди потенциальных потребителей медицинского изделия можно выделить лечебные учреждения хирургического и санаторно-курортного профиля. Биоматериал будет применяться специалистами данных медицинских учреждений в целях повышения эффективности лечения и реабилитации пациентов, в том числе ожоговых травм и обширных повреждений кожных покровов, полученных в результате техногенных катастроф и боевых действий.

Выводы

1. Установлено, что новый гибридный биоматериал BioTM на основе TM с электропрядным слоем из нановолокон коллагена и хитозана поддерживает рост и пролиферативную активность фибробластов человека.

2. Выявлено, что гибридный биоматериал BioTM в условиях in vitro предотвращает спонтанную активацию моноцитов крови человека, ингибирует их дифференцировку в провоспалительный M1-фенотип и способствует переходу моноцитов в прорегенеративный M2-фенотип.

3. В условиях in vivo показано, что гибридный биоматериал BioTM способствует восстановлению кожных покровов у экспериментальных крыс после термического повреждения. При этом эффективность биоматериала BioTM превосходит терапию с использованием мази «Левомеколь».

Работа выполнена в рамках государственного задания №НИОКРТР 124013100897-2, Минздрав России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.