Лимбальная недостаточность (ЛН) — патологическое изменение зоны лимба, проявляющееся помутнением роговицы, врастанием конъюнктивы и сосудов на роговицу, а также снижением остроты зрения [1]. Лимб — лентовидный полупрозрачный участок в зоне перехода прозрачной роговицы в непрозрачную склеру, который играет роль анатомического и функционального барьера для врастания эпителия конъюнктивы на поверхность роговицы. В базальном слое складок палисада Vogt лимба находятся лимбальные стволовые клетки (ЛСК) — основной пул клеток, ответственных за регенерацию поверхностных повреждений роговицы. Функция ЛСК регулируется в том числе мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) / клетками ниши лимба [2—5]. В основе патогенеза ЛН лежит повреждение ЛСК и/или нарушение их микросреды (лимбальной ниши), вызванное различными факторами, в том числе химическими, термическими, механическими, аутоиммунными и генетическими [1]. Выбор терапевтической или хирургической лечебной тактики зависит от тяжести и формы заболевания и заключается в восстановлении функции лимбальной ниши и/или анатомической структуры лимба, включая целостность эпителия роговицы.

Консервативная терапия включает использование бандажных контактных линз, увлажняющих капель, противовоспалительных препаратов и капель с производными аутокрови [6—8]. При неэффективности терапии и снижении качества жизни пациентов из-за необходимости частых инстилляций и обострений, методами выбора являются хирургические технологии, включая трансплантацию тканей и культивированных клеток. В зависимости от источника материала различают аллолимбальную и аутолимбальную трансплантации. Трансплантация клеток представляет собой реальную альтернативу трансплантации лимба в связи с простотой выполнения хирургической манипуляции. Традиционная хирургическая техника трансплантации лимба, предложенная в 1989 г. [9], из-за ряда недостатков, таких как высокий риск развития ятрогенной ЛН на парном глазу и ограниченное применение при двусторонней ЛН, не нашла широкого распространения в офтальмологической практике. В настоящее время основными методами хирургического лечения ЛН являются трансплантация культивированных ЛСК и простая трансплантация лимбального эпителия. Последняя технология применяется с использованием фибринового клея для фиксации лимбальных трансплантатов на поверхности роговицы [10]. Однако из-за отсутствия регистрации фибринового клея на территории РФ отечественными авторами была разработана модифицированная технология простой трансплантации лимбального эпителия [11, 12], которая является сопоставимой по эффективности. А при аллолимбальной трансплантации отмечен высокий риск отторжения трансплантата [13 ,14].

Активное развитие клеточных технологий и тканевой инженерии способствовало разработке способов трансплантации стволовых клеток. В качестве источника клеток для трансплантации используют эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, МСК и эпителиальные клетки слизистой оболочки полости рта [15—18]. В качестве перспективного метода лечения ЛН следует рассматривать трансплантацию культивированных ЛСК на основе различных носителей, которые, в свою очередь, различают на синтетические (полиметакрилат, полилактид-ко-гликолид, поликапролактон и др.) и природного происхождения (амниотическая мембрана, коллаген, фибрин, хитозан, кератин и др.) [19—21]. Основные недостатки синтетических материалов связаны с отсутствием у некоторых из них полной биосовместимости и токсичностью продуктов их распада [22, 23]. Особое внимание следует уделять материалам природного происхождения. Коллаген 1-го типа является основным белком внеклеточного матрикса роговицы. Множественные экспериментальные и клинические исследования касались трансплантации ЛСК на основе коллагена и продемонстрировали, что коллаген является биосовместимым, не цитотоксичным, коммерчески доступным материалом, который обеспечивает рост эпителиальных клеток роговицы. Тем не менее одним из важных недостатков коллагеновых гидрогелей является их низкие биомеханические свойства, существенно ограничивающие хирургию. Поэтому носители, изготовленные на основе коллагена, часто подвергают дополнительным сшивкам, что снижает их проницаемость для клеток, а также в ряде случаев влияет на их биосовместимость из-за повреждения нативной структуры белковой молекулы в результате химической обработки.

Для решения этой проблемы нами предложен подход, связанный с использованием нативного коллагена высокой концентрации. В нашем предыдущем исследовании [24] было показано, что коллагеновые гидрогели, приготовленные из концентрированного раствора коллагена 1-го типа, отвечают всем этим требованиям. Однако вопрос о способности клеток, находящихся внутри такого носителя, оказывать клинически значимый эффект в условиях in vivo не был исследован.

Цель исследования — разработка экспериментальной модели ЛН и оценка эффективности трансплантации тканеинженерной конструкции, состоящей из культивированных клеток, содержащих популяцию ЛСК и коллагенового носителя.

Материал и методы

Экспериментальные исследования были проведены на 12 кроликах породы шиншилла (средний возраст 6 мес, масса 3 кг). Проведение процедур соответствовало требованиям международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципам гуманности, изложенным в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС), «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Операции и исследования на кроликах выполнены на базе кафедры глазных болезней Первого МГМУ им.И.М. Сеченова и НИИГБ им. М.М. Краснова. Гистологическое исследование и работа с культурой клеток выполнены на базе Института биологии развития им. Н.К. Кольцова.

Все хирургические процедуры на животных проводили с использованием сочетанной анестезии в операционной с соблюдением правил асептики. Предоперационная подготовка включала обработку операционного поля согласно методике Пирогова—Гроссиха—Филончикова, установку блефаростата, местную анестезию в виде субконъюнктивальной или субтеноновой инъекции раствора лидокаина (2% — 0,5 мл) и эпибульбарную инстилляцию алкаина (проксиметакаин 0,5%). Кроме того, внутримышечно вводили тилетамина гидрохлорид 2,5%, золазепама гидрохлорид 2,5% (золетил 50) — 0,4мл и ксилазин 2% — 0,7мл.

На основании предварительных in vitro-исследований носителем для клеток был выбран коллагеновый гидрогель, изготовленный из коллагена 1-го типа с концентрацией 10 мг/мл.

Выделение ЛСК из биоптата проводили на основе комбинирования ферментативного метода и метода экспланта. Подробно получение тканеинженерной конструкции описано в ранее проведенном исследовании [25]. Характеристики культивируемых клеток (фенотип, пролиферативная активность и стволовость клеток) до и после пересадки на коллагеновую мембрану оставались неизменными по данным иммуноцитохимического исследования при использовании маркеров ЛСК, зрелых роговичных эпителиальных клеток, мезенхимоподобных клеток и пролиферативной активности клеток (P63, CK3/12, Vimentin и Ki 67).

На первом этапе исследования оценивали биологические эффекты выбранного носителя для лимбальных клеток (коллагеновой мембраны) при имплантации в зону лимба (2 кролика, 2 глаза). Левые глаза экспериментальных животных подвергали хирургическому вмешательству, а правые — служили в качестве контроля. Основные этапы операции включали разрез конъюнктивы вдоль лимба в секторе с 3 до 5 часов, отсепаровку конъюнктивы и теноновой оболочки, лимбэктомию в секторе с 3 до 5 часов, имплантацию подготовленной по размеру и форме коллагеновой мембраны, наложение трех узловых швов (нейлон 10-0). Реакция окружающих тканей на имплантацию коллагена отсутствовала клинически (с помощью биомикроскопии) и по результатами гистологического исследования.

Глаза энуклеировали для проведения гистологического исследования и фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина в течение 1 сут. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали по стандартному гистологическому протоколу.

Для перехода к следующему этапу исследования было необходимо создать модель ЛН и показать ее состоятельность. Моделирование ЛН осуществляли путем хирургического удаления участка лимбальной ткани (не менее 50%) с последующим дополнительным ожогом щелочью у 10 кроликов (10 глаз). После отсепаровки конъюнктивы и теноновой оболочки в зоне лимба при помощи остроконечного офтальмологического лезвия под углом 45°, отступив 1 мм со стороны роговицы, проводили удаление лимбальной ткани. Удаленные участки разделяли на фрагменты размерами 2×4 мм и использовали в качестве биоптата для выделения лимбальных клеток на следующем этапе работы. Операцию заканчивали наложением двух узловых швов (нейлон 10-0) на конъюнктиву, глаз промывали офтальмологическим ирригационным раствором BSS (балансол, РФ), выполняли субконъюнктивальную инъекцию раствора дексаметазона 0,4% — 0,5 мл. В послеоперационном периоде закапывали левофлоксацин 0,5% и дексаметазон 0,1% 3 раза в день в течение 2 нед.

Для усиления явлений ЛН через 1 нед дополнительно проводили химический ожог в зоне операции с помощью стерильной ватной палочки, смоченной в растворе 1М NaOH (4%) в течение 30 с, после чего промывали глазную поверхность раствором BSS в течение 20 мин. Инстилляцию глазных капель продолжали.

Явления ЛН оценивали по появлению биомикроскопических признаков (нарастание конъюнктивы на поврехность роговицы, эрозия, помутнение и неоваскуляризация роговицы) и данным импрессионной цитологии. При проведении импрессионной цитологии с окрашиванием на муцины для обнаружения бокаловидных клеток в условиях местной анестезии отводили верхнее и нижнее веко кролика и на интересующую зону глазной поверхности (центральная часть роговицы, лимбальная зона или конъюнктива) прикладывали полоску мембраны-фильтра (MF-Millipore, размер пора 0,22 мкм, GSWP02500, Германия) размером 3×5 мм с компрессией стеклянной глазной палочкой. Полоски переносили на предметное стекло с адгезивной поверхностью и подсушивали отпечаток на воздухе в течение 30 мин, а затем фиксировали в абсолютном спирте [26]. Окраску альциановым синим/ШИК проводили согласно протоколу производителя (ООО Labico, РФ). После заключения под покровное стекло препараты исследовали под световым микроскопом Leica DM 2500 (Германия) с фоторегистрацией. В качестве показателя, свидетельствующего об активности процесса ЛН, использовали наличие бокаловидных клеток конъюнктивы.

Через 1 мес после операции экспериментальные животные с моделированной ЛН были разделены на 2 группы (по 5 особей в каждой). В опытной группе выполняли трансплантацию тканеинженерной конструкции, а в контрольной — использовали только консервативное лечение (инстилляции дексаметазона 0,1% и девофлоксацина 0,5% по 1 капле 3 раза в день в течение 2 нед).

Техника трансплантации тканеинженерной конструкции заключалась в следующем: после разреза и отсепаровки конъюнктивы и теноновой оболочки в зоне лимба выполняли поверхностную лимбэктомию. Тканеинженерную конструкцию формировали ножницами по форме удаленного лимба и помещали на обнаженную поверхность удаленного участка. Для фиксации трансплантата накладывали 4 узловых шва (нейлон 10-0). Отсепарованную ранее конъюнктиву фиксировали с помощью 2 узловых швов (шелк 8-0) таким образом, чтобы дополнительно покрыть поверхность трансплантата.

В послеоперационном периоде назначали противовоспалительную терапию в виде однократной субконъюнктивальной инъекции раствором дексаметазона 0,4% — 0,5 мл и инстилляции левофлоксацина 0,5% и дексаметазона 0,1% по 1 капле 3 раза в день в течение 2 нед.

На 3, 7 и 30-е сутки после хирургического вмешательства проводили биомикроскопию с фоторегистрацией, оценивали воспалительную реакцию глазной поверхности, прозрачность роговицы и целость эпителия с помощью флюоресцеиновой пробы, а также выполняли оптическую когерентную томографию (ОКТ) переднего сегмента глаза с использованием аппарата Optovue (США) в режимах Corneal Line, Corneal Cross-Line. Кроме этого, для оценки результатов использовали импрессионную цитологию в различных участках с целью выявления бокаловидных клеток.

Результаты

Оценка реакции окружающих тканей на имплантацию коллагеновой мембраны

После имплантации коллагеновой мембраны в зону лимба роговица оставалась прозрачной, отсутствовали биомикроскопические признаки воспаления и реакции отторжения, а также дефекты эпителия (рис. 1, а). В одном случае в зоне наложения узловых швов отмечено врастание кровеносных сосудов (рис. 1, б). При гистологическом исследовании определяли коллагеновую мембрану, которая была покрыта эпителием конъюнктивы (рис. 2). Кроме того, обнаружена миграция единичных клеток с крупными гиперхромными ядрами внутри коллагеновой мембраны. Признаков воспаления и фиброза в зоне имплантации не наблюдали. На основании полученных результатов был сделан вывод о возможности использования коллагена в качестве основы тканеинженерной конструкции.

Рис. 1. Биомикроскопическая картина переднего сегмента глаза кролика после лимбэктомии и имплантации коллагеновой мембраны.

а — 1 мес после имплантации (локализация имплантата отмечена звездочкой); б — местная реакция в виде врастания сосудов в зоне узловых швов (отмечена стрелкой).

Рис. 2. Микрофотография гистологического препарата от зоны лимба после имплантации коллагеновой мембраны: коллагеновая мембрана (1), конъюнктива (2), склера (3).

Окраска гематоксилином и эозином, ув. 400.

Результаты моделирования ЛН

В течение трех дней после операции наблюдали нарастание отека роговицы с тенденцией к усилению после этапа нанесения дополнительного химического ожога. В течение 1 нед явления воспаления и отечность постепенно стихали на фоне врастания кровеносных сосудов в лимбальную зону роговицы. Через 1 мес была выявлена классическая биомикроскопическая картина ЛН, которая включала неоваскуляризацию, поверхностное помутнение и эрозию роговицы (рис. 3).

Рис. 3. Биомикроскопическая картина переднего сегмента глаза кролика через 1 мес после моделирования ЛН: эрозия (1), облаковидное помутнение роговицы (2) и неоваскуляризация (3).

По результатам импрессионной цитологии через 1 мес после моделирования ЛН выявлена «конъюнктивизация» в центральных и лимбальных участниках роговицы. В указанных зонах отмечали наличие бокаловидных клеток, которые должны отсутствовать в норме (рис. 4). Полученные результаты подтверждают возможность использования комбинации хирургического (лимбэктомия) и химического (аппликация щелочи) этапов для экспериментального моделирования ЛН.

Рис. 4. Результаты импрессионной цитологии различных анатомических участков глаз после моделирования ЛН

а — конъюнктива; б — лимб; в — центральная зона роговицы. Красной стрелкой обозначена конъюнктивальная сторона среза, желтыми стрелками — бокаловидные клетки. Окраска ШИК-реакцией, ув. 100.

Оценка эффективности трансплантации тканеинженерной конструкции

После трансплантации тканеинженерной конструкции в опытной группе и после проведения консервативного лечения в контрольной во всех случаях отмечена положительная динамика в виде уменьшения размера эрозии роговицы. В течение 48 ч после операции роговица прокрашивалась флюоресцеином и отмечался выраженный отек стромы. Через 7 сут отмечены первые явления эпителизации в обеих группах с различной скоростью и в разных участках (рис. 5). Через 1 мес в опытной группе, в которой была выполнена пересадка тканеинженерной конструкции с ЛСК, наблюдали полную эпителизацию роговицы (отсутствие прокрашивания флюоресцеином) и практически полное восстановление прозрачности роговицы с сохранением легкого поверхностного помутнения. В контрольной группе сохранялась шероховатость эпителия, роговица окрашивалась флюоресцеином, наблюдали явления эпителиопатии, что наглядно иллюстрируют данные ОКТ переднего сегмента глаза (рис. 6). В конечном счете время эпителизации роговицы в опытной и контрольной группах составило 9,2±2,95 и 46,20±12,07 сут соответственно (разница достоверна, p=0,139).

Рис. 5. Динамика заживления эрозии (обозначена стрелками) в опытной (а) и контрольной (б) группах по данным биомикроскопического исследования в разных сроках наблюдений (объяснение в тексте).

Стрелками отмечена зона эрозии роговицы.

Рис. 6. Результаты ОКТ центральной зоны роговицы через 1 мес после консервативного (а) и хирургического (б) лечения.

а — шероховатость и дефекты эпителия роговицы; б — полное восстановление эпителиального слоя роговицы.

По данным импрессионной цитологии в центральной части роговицы и лимбальной зоне в опытной группе не было обнаружено бокаловидных клеток, что свидетельствует о нормальной эпителизации роговицы, в то время как в контрольной группе они присутствовали, что является косвенным признаком активности ЛН (рис. 7).

Рис. 7. Результаты импрессионной цитологии через 30 сут после лечения в контрольной (а) и опытной (б) группах.

а — наличие многочисленных бокаловидных клеток в центральной зоне роговицы; б — отсутствие бокаловидных клеток в центральной зоне роговицы.

Обсуждение

Лимбальная недостаточность остается грозной и трудноизлечимой формой патологии роговицы, приводящей к стойкому снижению не только зрения, но и качества жизни пациента. Ситуация осложняется тем, что отсутствует эффективный и безопасный метод лечения, а кератопластика связана с определенными и часто трудноустранимыми осложнениями. Очевидно, что разработка и поиск новых, а также совершенствование известных способов лечения ЛН крайне актуальны в настоящее время. Основная задача проведенного экспериментального исследования заключалась в оценке возможности лечения ЛН путем пересадки культивированных стволовых клеток лимба в составе коллагенового носителя. Анализ данных литературы показал, во-первых, недостаточную эффективность применения клеток в чистом виде, а во-вторых, отсутствие четкого протокола культивирования клеток с их дальнейшим фенотипированием.

Выбор экспериментального животного для моделирования и оценки результатов последующего лечения ЛН путем трансплантации ЛСК обусловлен схожестью строения роговицы кролика и человека, включая палисады Vogt [27], что позволяет проводить хирургические манипуляции с использованием стандартных офтальмологических инструментов в условиях, максимально приближенных к реалиям клинической практики. Следует отметить, что клинические проявления ЛН у кроликов отличаются менее выраженной стромальной неоваскуляризацией, а также меньшим количеством бокаловидных клеток и низкой воспалительной реакцией [28].

В литературе описаны два метода моделирования ЛН — механический и химический. Однако до сих пор отсутствует единый протокол создания модели ЛН у экспериментальных животных [29]. В проведенном исследовании была изучена комбинация этих двух методов.

В качестве носителя для доставки ЛСК был выбран коллаген 1-го типа как материал, наиболее близкий по своему составу к тканям роговицы и лимба [30, 31]. Основной недостаток коллагенового гидрогеля связан с его низкими биомеханическими свойствами, что может осложнять проведение хирургических манипуляций и длительную фиксацию материала в зоне трансплантации. Для решения этой проблемы ряд авторов использовали химическое сшивание коллагена, однако этот метод может повышать иммуногенность материала [32, 33]. Поэтому в данной работе для транспортировки и пересадки ЛСК использовали нативный (необработанный и химически немодифицированный) коллаген, а необходимые биомеханические свойства обеспечивали увеличением его концентрации. Кроме этого, разработанная хирургическая техника трансплантации тканеинженерной конструкции предполагала использование трансплантата малого размера, соответствующего пораженной зоне лимба, что позволило снизить риск повреждения клеток и добиться надежной фиксации трансплантата в сравнении с другими методами [34, 35].

Комплексный подход к оценке результатов лечения ЛН включал оценку анатомической целости эпителия, структуры роговицы, наличия бокаловидных клеток на основе стандартной биомикроскопии с окрашиванием роговицы флюоресцеином, а также оценку данных ОКТ и импрессионной цитологии.

Полученные результаты в целом совпадали с данными, полученными ранее [36—38]. Так, при использовании коллагенового Vitrigel, который содержит низкую концентрацию коллагена (0,5%), в качестве носителя для культивированных ЛСК при лечении предварительно созданной тотальной ЛН с помощью химического ожога было выявлено, что трансплантация тканеинженерной конструкции, включающей культивированные ЛСК, эффективна при лечении ЛН [37, 38]. Авторами сделан вывод о том, что коллаген 1-го типа способствует восстановлению эпителия и поддержанию дифференцировки эпителия роговицы.

Заключение

Полученные экспериментальные данные позволяют расценивать трансплантацию культивированных из лимбальной зоны клеток на коллагеновом носителе перспективным методом лечения ЛН, смоделированной на экспериментальных животных. Дальнейшие исследования должны быть направлены на анализ долгосрочных результатов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.А., Е.О., С.А.

Сбор и обработка материала: Я.Ю., О.Р., А.С.

Статистическая обработка: Я.Ю., А.А.

Написание текста: Я.Ю.

Редактирование: А.А., С.А., А.С., Е.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.