В основе развития преэклампсии (ПЭ) лежит нарушение плацентации, обусловленное ранним отсутствием сосудистого ремоделирования плаценты, это начинается с недостаточной инвазии трофобласта и заканчивается эндотелиальной дисфункцией сосудов матери. В результате нарушается перфузия плаценты, в ней возникает гипоксия [1—5].

Известно, что особую роль в регуляции формирования фетоплацентарного комплекса на протяжении всего гестационного срока играет фактор роста эндотелия сосудов типа, А — VEGF-A, белок семейства Vascular endothelial growth factor. Процесс инвазии трофобласта связан с уровнем белков VEGF и их рецепторов [6, 7].

Проведенное исследование основано на изучении связи полиморфизма С2578А, С936Е гена VEGF-A с развитием ПЭ и микроморфометрическими особенностями плаценты.

Имея тесную связь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептор 1-го типа VEGF и рецептор 2-го типа VEGF), в результате активации их VEGF способствует сосудистой поддержке, выживанию незрелых и развитию новых кровеносных сосудов. Эндотелиальные клетки сосудистой стенки экспрессируют указанные рецепторы. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию. Эндотелиальные клетки участвуют в таких разнообразных процессах, как вазоконстрикция и вазодилатация, презентация антигенов, а также служат очень важными элементами всех кровеносных сосудов как капилляров, так и вен или артерий [8—10].

Цель исследования — определить роль полиморфизма С2578А, С936Е гена VEGF-A в развитии ПЭ с использованием клинико-анамнестических факторов риска осложненного течения беременности и морфологических особенностей плаценты.

Проведено комплексное исследование с участием 197 беременных, возраст которых составил от 17 до 40 лет. Пациентки разделены на две группы. Основную группу (n=97) составили беременные с ПЭ; контрольную группу (n=100) — женщины c физиологически протекающей беременностью.

Обследование включало общеклинические методы, биохимический анализ крови, систему гемостаза, кардиотокографию, ультразвуковую фето- и плацентометрию. Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории молекулярно-генетической диагностики Научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России. В качестве биологических образцов использована венозная кровь беременных женщин. Типирование полиморфизма нетранслируемого региона в позиции +936C>T (локус rs3025039) и промоторного региона в позиции –2578 A>C (локус rs699947) гена VEGF-А проводили методом полимеразной цепной реакции.

В соответствии с целью исследования изучены патоморфологические особенности плацент. Исследованы 10 плацент женщин основной группы с умеренной и тяжелой ПЭ и 10 плацент женщин контрольной группы с физиологически протекавшей беременностью. При исследовании плацент проводили макро- и микроморфометрический анализ, а так же иммуногистохимическую (ИГХ) оценку уровня экспрессии фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A и двух рецепторов к нему — VEGFR1, VEGFR2; уровня экспрессии белков эндотелиальных клеток CD31 и CD34.

Из ткани плаценты, фиксированной в 10% растворе нейтрального формалина, после стандартной парафиновой проводки готовились срезы, окрашивались гематоксилином Майера и эозином. После стандартного гистологического исследования проводилось ИГХ исследование. Исследование выполнено на депарафинированных срезах толщиной 4—5 мкм. Депарафинирование, демаскировку антигеном и ИГХ реакции проводили с использованием стандартных протоколов и автостейнера Leica Bond Max (Leica Biosystem, Германия). В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к CD31 (клон JC70, Cell Marque, разведение 1:100), CD34 (клон QBEnd/10, Cell Marque, разведение 1:100), VEGF (клон VG1, GeneTex, разведение 1:100) и кроличьи поликлональные антитела к VEGFR1 (GeneTex, разведение 1:100), VEGFR2 (GeneTex, разведение 1:100). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.

Оценку ИГХ реакции проводили полуколичественным методом по шкале от 0 до 3 баллов (0 — реакция отсутствует, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — выраженная реакция).

Небольшое количество исследований (20 плацент) обусловлено сложностью патоморфологического изучения плацент, а также использованием высокотехнологичного оборудования и высокой стоимостью проведения ИГХ-анализа.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 25 (IBM, США) путем расчета средних значений, стандартного отклонения, стандартной ошибки средних, t-критерия Стьюдента и критерия χ².

Результаты сравнительного анализа распространенности генотипов полиморфного варианта гена VEGF-А у исследуемых основной и контрольной групп показали, что 72,3% беременных женщин с ПЭ являются носительницами аллеля T локуса rs3025039 гена VEGF-А (59,8% гетерозиготных и 13,4% гомозиготных носительниц), который ассоциируется с низким уровнем экспрессии гена. Женщины контрольной группы в 100% являются носительницами аллеля С локуса rs3025039 гена VEGF-А, который ассоциируется с высоким уровнем экспрессии гена VEGF (58% гомозиготных и 42% гетерозиготных носительниц).

Носителями аллеля, А в локусе rs699947, отвечающего за низкий уровень экспрессии гена VEGF-А, являются 65% беременных с ПЭ (12,4% гомозиготных и 52,6% гетерозиготных) и 83% женщин с нормально протекающей беременностью (26% гомозиготных и 57% гетерозиготных).

Носителями аллеля C в локусе rs699947, отвечающего за высокий уровень экспрессии гена VEGF-А, являются 87,6% беременных с ПЭ (35% гомозиготных и 52,6% гетерозиготных) и 74% женщин с нормально протекающей беременностью (57% гомозиготных и 17% гетерозиготных).

Согласно данным международного банка однонуклеотидных полиморфизмов dbSNP, частота встречаемости аллеля T в локусе rs3025039 составляет 13,36% (по данным проекта 1000 Genomes) и 12,25% (по данным проекта клинических генотипирований TOPMED). Минимальная популяционная частота аллеля T составляет 8,4% (в африканской популяции), максимальная популяционная частота — 22,77% (в смешанной американской популяции) [18].

Результаты исследования показали, что в крови 197 беременных женщин присутствует ДНК из 394 хромосом (по 2 хромосомы, содержащие ген VEGF-А), среди которых обнаружено 126 (31,98%) хромосом с аллелем Т, что значительно превышает средние частоты распространенности аллеля Т локуса rs3025039 в разных популяциях мира. Учитывая, что у беременных с ПЭ частота аллеля Т составляет 43,3%, что в 2 раза выше по сравнению с популяционной частотой, а при физиологической беременности частота составляет 21%, которая соответствует популяционной частоте, диктует предположение о наличии связи аллеля T локуса rs3025039 гена VEGF с развитием П.Э. Отсутствие гомозигот по аллелю Т локуса rs3025039 у женщин контрольной группы нарушает правило равновесного наследования мутаций Харди—Вайнберга и позволяет предположить наличие отсекающего (отрицательного) отбора носителей гомозигот Т.Т. Присутствие гомозигот по аллелю Т локуса rs3025039 у 13,4% пациенток основной группы и отсутствие таковых у женщин контрольной группы дает основание предполагать, что гомозиготное носительство аллеля Т локуса rs3025039 является генетическим маркером развития ПЭ. В исследуемых образцах крови обнаружено 146 хромосом с аллелем, А в локусе rs699947, что соответствует частоте 37%.

При статистически незначимой частоте гетерозигот в крови женщин основной и контрольной групп среди исследуемых основной группы выявлено примерно в 2 раза больше гомозиготных носителей аллеля C в локусе rs699947 и в 2 раза меньше носителей аллеля, А в локусе rs699947 по сравнению с женщинами контрольной группы. Эти данные свидетельствуют о протективном действии в гомозиготном состоянии аллеля А, уменьшающего риск развития ПЭ примерно в 2 раза. Вместе с тем гомозиготное носительство аллеля C в локусе rs699947 указывает на повышенный риск развития ПЭ примерно в 2 раза. При этом гетерозиготность локуса rs699947 никак не влияет на риск развития ПЭ.

При морфологическом исследовании выяснено, что масса и площадь материнской поверхности плацент женщин контрольной группы соответствовали параметрам гестационного срока. Плаценты имели круглую либо овальную форму с преимущественно центральным и парацентральным прикреплением пупочного канатика. Средняя масса плаценты составила 518,4±28,3 г. Пуповина в 6 случаях была умеренно извита и сочеталась с варикозным расширением пуповинной вены. Отмечена гипоплазия Вартонова студня. На плодовой поверхности 5 плацент выявлялся белесоватый ободок шириной не более 0,5 см и протяженностью 1/3 длины окружности плаценты.

При микроскопическом исследовании в плацентах женщин контрольной группы отмечены умеренные нарушения материнского и плодового кровотока, выражавшиеся в виде хронических геморрагических (2 случая) и ишемических инфарктов (4 случая), мелкоочагового тромбоза (4 случая) и стаза (3 случая) межворсинчатого пространства центральных и суббазальных зон. Хронические геморрагические инфаркты были мелкоочаговыми и локализовались преимущественно в краевых отделах плаценты.

Выявлены также дистрофические (6 случаев) и некротические (3 случая) изменения эпителия ворсин с умеренным и повышенным отложением фибрина. В 8 из 10 последов отмечалось умеренное отложение фибрина в базальной децидуальной оболочке. В зонах некроза эпителия ворсин выявлялись мелкоочаговые отложения солей кальция.

Наблюдались умеренно выраженные компенсаторно-приспособительные реакции, выражавшиеся в гиперплазии терминальных ворсин и капилляров (в 4 случаях) и гиперплазии синцитиальных почек (6 случаев). Количественное увеличение синцитиокапиллярных мембран выявлено в 4 случаях. В 3 плацентах обнаружено выраженное полнокровие промежуточных и в 2 — терминальных ворсин, что можно расценивать как проявление механизмов адаптации.

У женщин основной группы чаще встречались плаценты округлой и овальной форм с центральным и парацентральным прикреплением пуповины. Кроме того, в отличие от плацент женщин группы контроля встречалась неправильная форма плаценты с краевым прикреплением пупочного канатика (3 из 10). Средняя масса плаценты у женщин основной группы составила 480,94±34,2 г.

В плацентах пациенток с ПЭ в 2 раза чаще по сравнению с плацетами женщин контрольной группы отмечалось наличие по ходу пуповины ложных узлов с гипертрофией Вартонова студня и извитым ходом сосудов в них, что может представлять структурную основу нарушений пуповинного кровотока.

При микроскопическом исследовании в плацентах женщин основной группы так же, как и женщин контрольной группы, преобладали нарушения материнского кровотока, представленные в виде хронических геморрагических инфарктов (8 случаев), преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты (2 случая), стаза (5 случаев) и тромбоза (2 случая) межворсинчатого пространства суббазальных и центральных зон. Частота хронических геморрагических инфарктов в 4 раза превышала аналогичный параметр плацент исследуемых контрольной группы. Данные расстройства материнского кровообращения происходили на фоне незавершенной гестационной перестройки эндометриальных сегментов спиральных артерий в парацентральных и краевых отделах плаценты.

Нарушения плодового кровотока в виде ишемических инфарктов наблюдались в 8 из 10 плацент (p<0,05). Отмечалось также наличие выраженной дилатации и полнокровия вен стволовых ворсин.

В плацентах женщин основной группы обнаружено умеренное (4 случая) и выраженное (4 случая) отложение фибрина в зонах некроза эпителия ворсин. Отложение фибрина в зонах некроза эпителия ворсин в 5 случаях сочеталось с мелкоочаговыми петрификатами в некротизированных участках трофобластического эпителия.

Отмечалась гиперплазия терминальных ворсин, капилляров в них и синцитиальных почек, что можно расценивать как проявление компенсаторно-приспособительных процессов. Кроме того, часто определялось полнокровие промежуточных и терминальных ворсин (5 случаев).

При морфометрии ИГХ препаратов плаценты с использованием антител к CD31 и CD34 проведен подсчет количества позитивно окрашенных кровеносных капилляров в каждой ворсине. Установлено, что при ПЭ среднее количество кровеносных капилляров на одну ворсину составляет 5,3±0,3, в то время как на одну ворсину плацент женщин контрольной группы приходится в среднем 6,4±0,4 кровеносного капилляра (p<0,05). Кроме меньшего количества капилляров, приходящихся на одну ворсину плацент исследуемых основной группы по сравнению с плацентами исследуемых контрольной группы, меньше и средние значения периметра и площади капилляров: 224,5±12,2 и 309,4±20,6 мкм (p<0,05); 145,9±11,2 и 186,2±10,7 мкм² (p<0,05) соответственно.

Результаты морфологического, морфометрического и иммуногистохимического исследования позволяют сделать вывод, что при преэклампсии в ткани плаценты развивается гипоксия вследствие нарушения развития сосудистого русла. Это подтверждается результатами морфометрии ворсин и капилляров в них и уровнем экспрессии эндотелиальных маркеров CD31 и CD34. При этом ткани и клетки, находящиеся в условиях гипоксии, компенсаторно повышают уровень васкуляризации.

Известно, что основным механизмом, запускающим процессы компенсации в ворсинчатом дереве плаценты при развитии в ней гипоксии, является активация проангиогенных факторов. Наибольшая роль в формировании ангиогенеза, в том числе фетоплацентарного, отводится фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецепторам (VEGFR1 и VEGFR2). Кроме того, VEGF может повышать жизнеспособность эндотелиоцитов и стабилизировать сосудистое русло.

Присутствие гомозигот по аллелю Т локуса rs3025039 у 13,4% пациенток с преэклампсией и отсутствие таковых у здоровых женщин дает основание предполагать, что гомозиготное носительство аллеля Т локуса rs3025039 является генетическим маркером развития преэклампсии.

При статистически незначимой частоте гетерозигот в крови женщин основной и контрольной групп среди исследуемых основной группы выявлено примерно в 2 раза больше гомозиготных носителей аллеля С в локусе rs699947 и в 2 раза меньше носителей аллеля, А в локусе rs699947 по сравнению с женщинами контрольной группы. Эти данные свидетельствуют о протективном действии в гомозиготном состоянии аллеля А, уменьшающего риск развития преэклампсии примерно в 2 раза. Вместе с тем гомозиготное носительство аллеля С в локусе rs699947 указывает на повышенный риск развития преэклампсии примерно в 2 раза. При этом гетерозиготность локуса rs699947 никак не влияет на риск развития преэклампсии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Сакварелидзе Николай Юрьевич — https://orcid.org/0000-0002-9041-6055

Акуленко Лариса Вениаминовна — https://orcid.org/0000-0002-2959-0716

Цахилова Светлана Григорьевна — https://orcid.org/0000-0002-4898-6919

Малышева Евгения Михайловна — https://orcid.org/0000-0001-6330-6988

Жарков Николай Владимирович — https://orcid.org/0000-0002-4707-4889

Аксенова Татьяна Николаевна — https://orcid.org/0000-0002-1567-7490

Олисаева Ирма Викторовна — https://orcid.org/0000-0001-5993-4973

Автор, ответственный за переписку: Цахилова Светлана
Григорьевна — e-mail: tsakhilova@mail.ru;
https://orcid.org/0000-0002-4898-6919