Введение
Репродуктивное здоровье и функция женского населения является основополагающим направлением гинекологии и репродуктологии XXI века. Поднятие уровня здоровья (репродуктивного), увеличение шансов наступления беременности, совершенствование методов и системы охраны этого здоровья женщин с использованием репродуктивных технологий, повышение уровня медицинской грамотности и информированности, а также качества и доступности медицинской помощи являются приоритетными направлениями политики министерства здравоохранения России.
Проблема невынашивания беременности представляет угрозу для репродуктивного здоровья современных женщин, сохраняя актуальность в настоящее время. Невынашивание беременности — одна из основных частей репродуктивных потерь [1—15]. По статистике от 15 до 25% зарегистрированных беременностей заканчиваются самопроизвольным выкидышем или неразвивающейся беременностью, из них от 5 до 20% составляют привычную неразвивающуюся беременность, а остальные 80% беременностей прерываются на сроке до 12 нед [16—23].
Несмотря на то, что причины и провоцирующие факторы невынашивания беременности достаточно изучены, в современных руководствах и клинических протоколах отсутствуют рекомендации по своевременной диагностики и профилактике данной патологии. Сохраняется необходимость в создании методов своевременной диагностики и профилактики патологии беременности.
Материал и методы
В исследование были включены 35 беременных клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности (контрольная группа) и 35 пациенток с диагнозом угрожающий аборт, поступивших на стационарное лечение в возрасте от 18 до 36 лет. В дальнейшем у 32 пациенток из группы с угрожающим абортом по результатам исхода беременности диагноз был изменен на неполный самопроизвольный аборт.
Из кандидаток в группы исследования были исключены пациентки с декомпенсированными формами заболеваний, инфекционными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и не подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Проведение данного исследования одобрено местным этическим комитетом.
Диагноз неразвивающаяся беременность был выставлен на основании клинической картины, данных инструментального обследования и гистологического заключения. Критериями при постановке диагноза (критериями для включения в основную группу) также являлись данные ультразвукового исследования (УЗИ) органов малого таза (трансабдомиального или трансвагинального). УЗИ с доплерометрией проводили в сроке 8—12 нед. Критериями постановки диагноза в данном случае являлись остатки хориальной ткани в полости матки, отсутствие плодного яйца [16—22].
УЗИ и взятие образцов крови производилось на двух базах — Государственного бюджетного учреждения Рязанской области «Городская клиническая больница №8» и Городской клинический родильный дом №1. Дальнейший анализ образцов крови и определение активности протеаз проводилось на базе кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.
Материалом исследования являлась фракция лейкоцитов крови. При госпитализации на стационарное лечение в «Городская клиническая больница №8» с диагнозом угрожающий аборт при беременности 6 нед 2 дня. Образцы получали путем забора периферической крови в объеме 10 мл с помощью стерильных вакуумных пробирок APEXLAB, содержащих в качестве антикоагулянта ЭДТА-К3. Для получения фракции мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови использовали методику, основанную на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина. В стерильную пластиковую пробирку вносили фиколл-урографин из расчета 0,5 мл на 1 мл полученной суспензии форменных элементов крови. Затем сверху осторожно наслаивали суспензию клеток и центрифугировали при 1800g 30 мин (ELMI, CM-6M, Латвия). В результате центрифугирования кровь разделяется на 4 отдельные фракции: первая фракция на дне пробирки содержит эритроциты и обломки клеток крови; вторая — раствор фиколл-урографина; третья, расположенная над градиентом, — суспензия лимфоидных клеток; четвертая — образована плазмой с тромбоцитами. Далее в стерильных условиях пипеткой с границы раздела плотности отбирали фракцию лейкоцитов. Полученные клетки рессуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH = 7,2 (производитель) и центрифугировали при 1800g 15 мин. Отмывку клеток проводили трижды. Для каждого анализа клетки в количестве 1×106 рессуспендировали в 50 мкл лизис-буфера (название коммерческого набора для катепсинов), инкубировали на льду в течение 10 мин и затем центрифугировали 5 мин при 800g (СМ-50, Eppendorf, Германия). Супернатант переносили в отдельные пробирки и использовали для дальнейшего анализа.
Активность катепсинов B и D определяли флуоресценцентным методом с использованием коммерческих наборов (AssayGenie, Ирландия). Полученные результаты выражали в единицах флуоресценции, отнесенных на мг белка (ед. фл./сек × мг белка). Количество белка в пробах анализировали методом Бредфорда (Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, ThermoFisher, США).
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью лицензионного пакета программ Statistica. Оценка же характера распределения данных осуществлялась при помощи критериев Шапиро—Уилка. Оценка данных критерий позволила выяснить о нормальном распределении наших данных. Полученные данные были представлены в виде средней квадратической ошибки (m) и среднего значения (M). Для определения статической значимости различий между сравнимыми показателями пользовались критериями Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. В дальнейшем результаты оценивались как статистически значимые при p<0,05.
Результаты и обсуждение
В финале исследования заключено, что в группе с неполным самопроизвольным выкидышем диагноз не подтвержден у 3 из 35 обследуемых (табл. 1).
Таблица 1. Количество подтвердившихся случаев неполного выкидыша в зависимости от показателя
| Показатель | Неполный самопроизвольный аборт подтвержден, n (%) | Неполный самопроизвольный аборт не подтвержден, n (%) |
| Катепсин D | 32 (91,43) | 3 (8,57) |
| Катепсин B | 32 (91,43) | 3 (8,57) |
Данный диагноз у исследуемых пациенток был установлен спустя 6—7 дней после госпитализации и анализа активности катепсинов в лейкоцитах периферической крови. Минимальный уровень активности катепсина D у группы исследуемых составил 110 863,7 ед.фл./сек×мг белка, а максимальный — 120 564 ед.фл./сек×мг белка; минимальный и максимальный уровень активности катепсина B составили 90 754,9 ед.фл./сек×мг белка и 100 433,3 ед.фл./сек×мг белка соответственно (табл. 2).
Таблица 2. Показатели активности катепсинов В и D при неполном самопроизвольном аборте
| Показатель | Минимальная активность (ед.фл./сек×мг белка) | Максимальная активность (ед.фл./сек×мг белка) |
| Катепсин D | 110 863,7 | 120 564 |
| Катепсин B | 90 754,9 | 100 433,3 |
При проведении ROC-анализа было выяснено что чувствительность и специфичность используемого нами метода при анализе активности катепсина D составила — 93,75% и 100%, а катепсина В — 81,25 и 100% соответственно (рис. 1—6). Достоверность полученных данных проверялась при проведении дисперсионного анализа ANOVA. По полученным нами данным можно резюмировать, что уровень достоверности данных высокий, так как p<0,05, а следовательно, и полученные данные достоверны.
Рис. 1. Дисперсионный анализ ANOVA катепсина D при неполном выкидыше.
Рис. 2. ROC-кривая катепсина D при неполном выкидыше.
Рис. 3. Анализ ROC-кривой катепсина D при неполном выкидыше.
Рис. 4. Дисперсионный анализ ANOVA катепсина B при неполном выкидыше.
Рис. 5. ROC-кривая катепсина B при неполном выкидыше.
Рис. 6. Анализ ROC-кривой катепсина B при неполном выкидыше.
Таким образом, значение активности катепсина D от 110 863,7 до 120 564 ед.фл./сек×мг белка и катепсина B от 90 754,9 до 100 433,3 ед.фл./сек×мг белка в лейкоцитах периферической крови исследуемых пациенток свидетельствует о возможности возникновения в дальнейшем неполного самопроизвольного аборта с вероятность более 80%.
Заключение
Уровень активности катепсинов можно использовать в качестве маркеров прогнозирования и ранней диагностики неполного самопроизвольного аборта в связи с высокой чувствительностью и специфичностью используемого нами метода.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Кошулько П.А., Коваленко М.С.
Сбор и обработка материала — Абаленихина Ю.В., Рокунов Е.Д.
Статистическая обработка данных — Рокунов Е.Д.
Написание текста — Кошулько П.А.
Редактирование — Кошулько П.А., Коваленко М.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.