Изучение патогенеза различных заболеваний, а также поиск методов их диагностики и лечения невозможны без использования биологических образцов/биообразцов человека. К ним относят различные биологические жидкости (цельная кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна и др.), а также образцы тканей, клеточные культуры и т. д.

«Жизненный цикл» биологического образца, полученного от пациента, включает процедуру сбора, пробоподготовки, транспортировки (при необходимости), размещение для хранения, собственно анализ образца с последующей его утилизацией или возвращением неиспользованного материала обратно в хранилище [1]. Разнообразные факторы (способ получения биообразцов, продолжительность и условия транспортировки и хранения до замораживания, материал используемых пробирок и многие другие) определяют качество и характеристики получаемых биобразцов, что непосредственно влияет на результаты исследований с их использованием [2—9].

Одним из основополагающих принципов научного исследования является воспроизводимость получаемых результатов. Отсутствие единых стандартных протоколов проведения этапов пробоподготовки может исказить результаты экспериментальных исследований, а также ухудшить их воспроизводимость. В настоящее время в мировом сообществе проблема невоспроизводимости результатов публикуемых исследований стоит достаточно остро. Этот факт зачастую ставит под сомнение достоверность формулируемых выводов и предлагаемых концепций, создает проблемы для развития трансляционной медицины [10]. Так, исследователям из биотехнологической компании «Amgen» удалось воспроизвести только 6 из 53 ключевых исследований в области онкологии [11]. В 2011 г. аналогичная проблема возникла при выполнении проектов по валидации биомедицинских продуктов в фармацевтической компании «Bayer», когда удалось воспроизвести результаты лишь 1/3 выбранных для работы исследований [2]. Очевидно, что вложение материальных ресурсов в проекты и исследования, полагающиеся на научные данные, которые в последующем не могут быть воспроизведены, приводит и к существенным экономическим затратам [12]. Все это послужило поводом для организации и выполнения различных международных проектов, направленных на повышение качества научных исследований (Reproducibility Initiative, «Reproducibility Initiative — SC19; «Reproducibility Project: Cancer Biology»; Antibody Validation Project, IHC/IF/WB; «Antibodyplus: Trial and validation») [13—15].

Методология научной деятельности подразумевает необходимость следования рекомендациям. Такие рекомендации разработаны, например, для проведения различных видов исследований: рандомизированных (CONSORT), когортных и случай—контроль (STROBE), по поиску диагностических (STARD) и прогностических (REMARK) биомаркеров, а также по составлению систематических обзоров и метаанализов о медицинских вмешательствах (PRISMA), метаанализов наблюдательных медицинских исследований (MOOSE) [16—21].

Исследования с использованием биообразцов составляют существенную долю всех проводимых научных биомедицинских работ. При этом объем и тип информации, описывающей специфические условия преаналитического этапа подготовки биообразцов, представляемой в научных публикациях и нормативных материалах, варьируют в широких пределах. Н. Moore и соавт. [1] подчеркивают, что для улучшения качества исследований, использующих биообразцы человека, крайне важно точно и в соответствии с установленным стандартом описывать все этапы их получения. В качестве подобного стандарта в 2011 г. были предложены «Рекомендации по описанию биообразцов для улучшения качества исследований» (Biospecimen Reporting for Improved Study Quality, BRISQ) [1]. Подробное изложение, анализ и адаптация к их практическому применению являюся предметом данной статьи. В настоящее время в соответствии с требованиями многих научных журналов соблюдение данных рекомендаций является обязательным условием для публикации результатов исследований, полученных при использовании образцов биологического материала человека.

Рекомендации BRISQ были разработаны рабочей группой Национального института рака США и опубликованы в журналах «Cancer Cytopathology», «Journal of Proteome Research», «Biopreservation and Biobanking». Они применимы к любой области исследования, где используются образцы биологического материала человека: трансляционная медицина, поиск биомаркеров различных заболеваний, клинические испытания по изучению лекарственных препаратов, разработка новых технологий и диагностикумов, создание новых фармацевтических продуктов.

Рекомендации BRISQ включают перечень характеристик биообразцов, которые в наибольшей степени могут влиять на структурную целостность, молекулярные и биохимические параметры биоматериала. Эти характеристики упорядочены в соответствии с этапами «жизненного цикла» биообразца от момента получения биологического материала до исследования. Предлагаемые разделы должны быть отражены в любой научной публикации или заявке на получение гранта, а также в документах биобанка, описывающих биообразцы, находящиеся на хранении. Совершенно очевидно, что не всегда и не вся рекомендуемая информация доступна для исследователя, характеризующего биообразцы, а перечень характеристик может меняться в зависимости от целей исследования, о котором идет речь. Однако отсутствие данной информации должно быть обязательно указано с обсуждением возможных влияний на результат. Значимость того или иного параметра должна быть оценена исследователями в рамках конкретной работы. Возможны ситуации, когда тот или иной пункт рекомендаций окажется в другой группе (например, метод обогащения среды, представленный во второй группе параметров, рекомендованных для описания, в рамках исследования по оценке эффективности различных методов будет обязательным для описания, т. е. отнесен к 1-й группе рекомендаций).

В табл. 1—3

В табл. 1 представлены характеристики, обязательные к описанию в разделе «Материал и методы» любой научной статьи, заявки на получение гранта и т. п., поскольку в наибольшей степени могут повлиять на результаты научного изучения биообразцов.

Требуемые характеристики представлены в соответствующих разделах, обозначенных римскими цифрами. В разделе «До помещения на хранение» (раздел I) дается информация о типе образца (ткань, изолированные клетки, цельная кровь, сыворотка/плазма, моча и др.), о том, как получен биообразец (например, методом тонкоигольной аспирации, дооперационный забор крови и т. д.; раздел II). Важно отметить, получен ли образец от больных, страдающих тем или иным заболеванием, или от лиц контрольной группы. Кроме того, для образцов тканей необходимо указать, получены они из патологически измененного или из непораженного участка органа (раздел I, п. 3). Клинические характеристики и диагнозы пациентов должны включать доступную медицинскую информацию, которая имеет отношение к описываемому исследованию. Следует иметь в виду, что клинический и патологоанатомический диагнозы не всегда одинаковы.

Важной информацией о биообразце является описание условий и способов его стабилизации и хранения (раздел III). Например, замораживание или фиксация с контролируемой скоростью (формалин, парафин и др.), указание, какие использовались добавки (гепарин, цитрат натрия или этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА]); следует отметить, если стабилизация не проводилась. Описание типа и условий долгосрочного хранения чаще всего совпадает с данными о способах стабилизации.

При описании способов хранения и транспортировки (раздел IV) указываются температурные параметры, при которых биообразцы сохранялись до анализа, время от получения биообразца до его анализа, а также условия (в первую очередь температура), в которых биообразцы находились во время транспортировки.

Важным этапом работы являются отбор, извлечение из хранилища и процессинг биообразцов перед проведением аналитических процедур в соответствии с задачами, стоящими перед исследователем (раздел V). Поэтому к группе обязательных характеристик относят любые параметры, которые использовались для отбора биообразцов с целью обеспечения качественного материала для исследования.

В табл. 2 включены те характеристики, влияние которых на результат изучения биообразца менее существенно. Так, в разделе I («До помещения на хранение») целесообразно дополнительно описать схему сбора образцов, указав, собирались ли биообразцы специально для проводимого исследования или взяты из общей коллекции (например, из популяционной выборки); каков характер набора биообразцов (ретроспективный или проспективный); применялись ли какие-либо стандартные рабочие процедуры (СОП) и были ли эти СОП доступны для других исследователей (по запросу). По возможности следует указать любые клинические испытания, относящиеся к схеме сбора биообразцов. Характеризуя биобанк, в котором хранились образцы, следует указать его название, местоположение и основные контактные данные, такие как адрес электронной почты или веб-сайт, а также ссылки на любые соответствующие СОП (раздел I, п. 4). В качестве дополнительных сведений о получении, стабилизации и хранении биообразцов (разделы II—III) можно не только указать время и температуру, при которой находился образец от его получения до стабилизации, но и описать вид пробирок/контейнеров, в которые собирается биоматериал, объем жидких образцов и количество аликвот, примерный размер или массу твердых биообразцов. Необходимо привести данные о мерах (если таковые были), которые предпринимались для минимизации процессов окисления в образце, отметить количество циклов замораживания/оттаивания (для жидких биообразцов; раздел IV «Хранение и транспортировка»).

Характеристика биообразцов, несомненно, будет более полной, если к описанию добавить данные об их анатомических особенностях, а также указать квалификацию специалиста, выполнявшего забор биообразца (например, процедурная сестра, врач-гематолог, патологоанатом, микробиолог и т. д.). При описании образцов целесообразно указать метод, с помощью которого изолировали необходимые фрагменты биообразца (например, центрифугирование крови, микродиссекция ткани и т. д.), отметив существенные детали (например, скорость и температуру центрифугирования). Если до длительного хранения или непосредственно перед анализом оценивали качество биообразцов, следует указать используемые методы и результаты оценки (например, наличие гемолиза, целостность РНК).

В табл. 3 перечислены те факторы и условия, которые могут влиять на результаты исследования, однако достоверных данных по этому вопросу нет (например, условия окружающей среды, в которых проживает человек, от которого был получен биообразец). Здесь в разделе «До помещения на хранение» полезно будет привести детали заболевания пациента, если оно известно (например, взят образец во время или после терапии, в острой, хронической или терминальной стадии болезни), причину смерти, описать возможные факторы и воздействия, которым подвергался пациент (неоадъювантная терапия, текущие или прошлые медицинские процедуры или факторы окружающей среды, которые могут влиять на состояние биообразцов, — химио- и лучевая терапия, применение антитромботической терапии, статус курения), указать гормональное или репродуктивное состояние пациента (препубертат, беременность, постменопауза). Раздел «Получение образцов» (см. табл. 3, раздел II, п. 5) содержит сведения о том, сколько времени образец находился в ишемизированном состоянии в организме. Раздел «Хранение и транспортировка» (см. табл. 3; раздел IV) предполагает описание типа контейнера для хранения и транспортировки (например, промышленно изготовленный контейнер, коробка из полистирола) и упаковочный материал, в котором транспортировались биообразцы; тип слайдов для микроскопии, на которых фиксированы биообразцы; условия, при которых транспортировались биообразцы, с указанием конкретных условий в случае их отклонения от стандартных (например, воздействие повышенной температуры в ходе транспортировки). Следует отметить циклы замораживания/оттаивания образцов, длительность и температуру, при которой находился образец между оттаиванием и анализом. Для образцов сыворотки и плазмы крови описание процессов оттаивания необходимо (переходит в ранг обязательных характеристик).

Описание биообразцов в публикации не должно превратиться в некую трудновыполнимую задачу. Приводим два примера, в которых практически полностью отражены все разделы обязательного описания.

1. Забор крови от пациентов обоих полов, 35—64 лет, перенесших инфаркт миокарда, и от лиц контрольной группы без признаков заболевания, подобранных по полу и возрасту к основной группе, осуществляли утром после 12—14 ч голодания из кубитальной вены в вакутейнеры объемом 9 мл (для получения сыворотки крови) и вакутейнеры, содержащие ЭДТА (для получения плазмы крови), объемом 5 мл. Через 0,5—1 ч после забора крови проводили центрифугирование при 900 g в течение 15 мин при температуре +4 °С. Полученную сыворотку/плазму крови разливали на аликвоты в криопробирки (объемом 1,0 мл) в течение не более чем 30 мин и сразу замораживали при температуре –20 °С. Затем не более чем через 2 нед аликвоты сыворотки и плазмы помещали на длительное хранение при температуре –80 °С.

2. С помощью тонкоигольной аспирации (калиброванная игла диаметром 22—25 мм) от женщин (n=55) в течение 1 ч после хирургического удаления молочной железы по поводу рака были получены биообразцы. Аспират распределяли на слайдах и фиксировали в этаноле или формалине или помещали в CytoLit для приготовления ThinPrep слайдов (в соответствии с инструкцией производителя). Образцы ткани, фиксированные в формалине и залитые парафином, фиксировали в 10% растворе формалина в нейтральном буфере в течение 18—24 ч согласно стандартной методике. Все слайды для цитологических исследований были высушены на воздухе и хранились при комнатной температуре до анализа [22].

Таким образом, данные об образцах должны быть зафиксированы во время работы и обязательно представлены в публикации в соответствии с рекомендациями BRISQ или настоящей статьи.

Рекомендации BRISQ являются результатом работы группы экспертов из разных областей: научных сотрудников лабораторий, клиницистов, патологов, сотрудников биобанков, а также редакторов научных журналов. Целью создания этих рекомендаций было улучшение качества биообразцов, а соответственно и качества исследований, в которых они используются. Соблюдение рекомендаций BRISQ позволит авторам, рецензентам, редакторам и контролирующим структурам оценивать, в достаточном ли объеме описаны все этапы получения биообразца, что важно для суждения о достоверности получаемых результатов. Несмотря на то что пункты, отнесенные к группам 2 и 3, не являются обязательными для описания, следует учитывать их возможное влияние на полученные результаты в рамках каждого конкретного исследования.

Таким образом, соблюдение рекомендаций BRISQ при описании преаналитических факторов работы с биообразцами позволит улучшить качество и воспроизводимость научных исследований. Это в свою очередь важно как для фундаментальных работ, так и для практических целей. Широкое внедрение рекомендаций BRISQ, несомненно, повысит эффективность биомедицинских исследований, а также качество статей и вероятность их публикации в высокорейтинговых журналах, что будет способствовать успешной разработке и внедрению новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. Исследователям, планирующим научные работы и подготовку публикаций с учетом современных требований, рекомендуется ознакомиться как с кратким их изложением, приведенным в настоящей статье, так и с полной версией рекомендаций BRISQ [1].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Сивакова О.В. — https://orcid.org/0000-0001-5397-5387; e-mail: osivakova@gnicpm.ru

Покровская М.С. — https://orcid.org/0000-0001-6985-7131; e-mail: mpokrovskaya@gnicpm.ru

Метельская В.А. — https://orcid.org/0000-0001-8665-9129; e-mail: vmetelskaya@gnicpm.ru

Лимонова А.С. — https://orcid.org/0000-0003-1500-3696; e-mail: limonova-alena@yandex.ru

Мешков А.Н. — https://orcid.org/0000-0001-5989-6233; e-mail: meshkov@lipidclinic.ru

Драпкина О.М. — https://orcid.org/0000-0002-4453-8430; e-mail: drapkina@bk.ru