Введение

В последние годы демографическая ситуация в России характеризуется снижением рождаемости. По данным Росстата за 2021 г., рождаемость снизилась на 2,3% и составила 1,4 млн человек — минимум с 2002 г.

Начиная с 80-х годов прошлого века бесплодие продолжает оставаться серьезной проблемой в современном мире как в экономически развитых странах, так и в развивающихся.

По данным Всемирной организации здравоохранения, частота бесплодного брака в России и в мире достигает 17—20%.

Проблема бесплодного брака продолжает оставаться весьма актуальной, несмотря на многочисленные программы по преодолению бесплодия. Один из наиболее эффективных способов преодоления бесплодия — применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). По данным Российской ассоциации репродукции человека, ежегодно в России проводится более 165 тыс. циклов ЭКО в год, в результате которых на свет появляется более 36 тыс. детей.

В настоящее время, несмотря на совершенствование методов коррекции нарушений фертильности и преконцепционной подготовки супружеской пары, не вызывает сомнения актуальность поиска новых способов повышения эффективности ВРТ.

С тех пор как в 1978 г. родился первый ребенок путем ЭКО, оно используется во всем мире. Уже более 10 млн детей появились на свет благодаря ВРТ. За последние 40 лет, несмотря на постоянные усилия по оптимизации процедур ВРТ, показатели имплантации эмбрионов ЭКО не превышают 40%, а показатель частоты наступления клинической беременности в последние годы существенно не меняется [1].

В последние годы появилось множество новых технологий, которые улучшают результаты применения программ ВРТ: прегравидарная подготовка пациенток, использование разных схем стимуляции овуляции, применение различных культуральных сред и совершенствование методов культивирования эмбрионов [2]. Указанные инновации ВРТ получили большое распространение по всему миру. Многие клиники внедряют новые технологии для повышения результативности программ ЭКО, однако не все из них смогли доказать свою эффективность.

Программа ЭКО состоит из нескольких этапов — овариальной стимуляции овуляции, пункции фолликулов яичников, оплодотворения полученных ооцитов, культивирования эмбрионов, переноса эмбрионов в полость матки. С каждым годом появляется все больше инноваций каждого из этапов ЭКО, направленных на повышение частоты наступления беременности (ЧНБ).

Развитие современных методов оценки качества эмбрионов

Большинство современных исследований направлено на изучение начальных этапов программы ЭКО и представляет собой различные способы модификации схем стимуляции, изобретение новых препаратов, изменение условий культивирования. Несмотря на это, наиболее важные периоды раннего эмбриогенеза проходят в закрытых инкубаторах и не подлежат визуальному контролю на всем этапе раннего эмбриогенеза, что затрудняет отбор эмбрионов лучшего качества.

Культивирование эмбрионов проводится в питательных средах с поддержкой необходимого уровня pH, газового состава (O₂/CO₂) и температуры внутри инкубатора.

После слияния ооцита и сперматозоида при оплодотворении одноклеточная зигота подвергается серии митотических делений, образуя 2-клеточный, 4-клеточный эмбрион, на 3-й день он состоит из 8 бластомеров, на 4-й день образует морулу (12—32 плотно соединенных бластомера), которая затем к 5-му дню развивается в бластоцисту (шар с двумя линиями клеток: внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы). На 5-е сутки эмбрион переносится в полость матки. Однако стоит отметить, что не каждый перенос эмбриона заканчивается наступлением клинической беременности, в связи с этим на 5-е сутки развития также проводят криоконсервацию оставшихся эмбрионов [3]. Стандартом считается получение не менее 80—90% зигот от всех полученных ооцитов и 45—80% качественных бластоцист от общего количества зигот (ESHRE — Европейское общество репродукции и эмбриологии человека, 2017).

Заключительный и один из наиболее важных этапов программы ЭКО — имплантация эмбрионов в полости матки — должен иметь два основных компонента: наличие здорового эмбриона с высоким потенциалом для имплантации и эндометрия, способствующего имплантации эмбриона [4].

В прошлом перенос бластоцисты был сложным из-за трудностей с культивированием эмбриона >48 ч. Таким образом, раньше использовали переносы на стадии дробления (2—3-и сутки развития). Сторонники переноса на стадии дробления считают, что матка женщины является лучшим инкубатором и длительное культивирование эмбриона в течение 5—6 дней может повлиять на его жизнеспособность [5].

Появление в начале 90-х годов прошлого столетия двухступенчатых сред позволило расширить культивирование эмбрионов in vitro [6], привлекая внимание к преимуществам переноса бластоцисты при ЭКО. Множество исследований описывало положительные результаты переноса эмбриона на 5-е сутки культивирования. Бластоциста менее подвержена изменениям окружающей среды, чем эмбрион стадии дробления. Стоит также отметить, что при переносе эмбрионов на 5-е сутки в большей степени моделируется естественный процесс, так как эмбрион обычно поступает внутрь полости матки из маточной трубы на стадии бластоцисты [7].

Потенциал имплантации эмбрионов человека, полученных путем ЭКО, предположительно, в значительной степени определяется их хромосомным составом, но в самом начале цитогенетическому анализу эмбрионов до имплантации препятствовал ряд практических и технических проблем [8]. Первоначально использовалась флюоресцентная гибридизация in situ или FISH-метод преимплантационного скрининга эмбрионов в целях выявления хромосомных патологий. Данный метод не требовал получения большого количества клеток для анализа, поэтому использовался для определения анеуплоидии у эмбрионов стадии дробления. Его принцип основан на специфической гибридизации определенных участков хромосом с флюоресцентно-меченными зондами. Метод позволяет определить структурные перестройки хромосом и выявить количество их копий в интерфазных ядрах по флюоресценции зондов. В 2010 г. консорциум ESHRE PGT (preimplantation genetic testing — предымплантационное генетическое тестирование — ПГТ), ASRM (American society for reproductive medicine — Американское общество репродуктивной медицины) и BFS (British fertility society — Британское общество фертильности) написали заявления о том, что положительный эффект ПГТ с использованием FISH-биопсии на стадии дробления не доказан и что рандомизированные контролируемые исследования (РКИ) на полярных телах и биопсии трофектодермы должны проводиться с использованием эффективных методов, которые анализируют все хромосомы [9]. Прогресс в генетическом тестировании привел к внедрению массивной сравнительной геномной гибридизации, количественной полимеразной цепной реакции и секвенирования следующего поколения для преимплантационного генетического скрининга [10]. Скрининг на анеуплоидию (PGT-A) предполагает исследование большего количества клеток трофэктодермы у бластоцисты 5-х или 6-х суток и используется в качестве дополнения к стандартному лечению с помощью ЭКО бесплодных пар [11].

Стоит отметить, что в начале 80-х годов прошлого века рост показателей успеха передовых репродуктивных технологий (АРТ) ассоциировался с переносом нескольких эмбрионов и наличием многоплодной беременности [12]. Однако с совершенствованием методов культивирования и появлением возможности отбора эмбриона лучшего качества для имплантации на стадии бластоцисты отмечается тенденция к выбору селективного переноса одного эмбриона. В 1999 г. J. Gerris и соавт. [13] первыми оценили селективный перенос одного эмбриона (eSET) — преднамеренный перенос одного эмбриона, когда имеется несколько эмбрионов соответствующей стадии и качества [13]. В результате снизился рост многоплодных беременностей и их осложнений, что привело к повышению рождаемости здорового потомства.

Основная проблема в лаборатории вспомогательной репродукции заключается в создании воспроизводимых и эффективных критериев для выявления эмбриона с самым высоким потенциалом имплантации. На протяжении многих лет во всем мире было использовано несколько методов, направленных на достижение цели.

Первое упоминание о культивировании восходит к 1882 г., когда Сидней Рингер изобрел раствор Рингера — солевой раствор, близкий по составу к биологическим жидкостям, и он успешно применялся для поддержания жизнеспособности тканей лягушки [14]. С 1912 г. начинается история развития культивирования эмбрионов с культивирования Альбертом Брачетом бластоцист кролика [15]. В дальнейшем на протяжении более 20 лет экспериментальные работы были посвящены использованию сложных биологических жидкостей для культивирования, таких как сыворотка и плазма крови. Однако нужно отметить, что этот метод не дал успешных результатов, большинство эмбрионов млекопитающих не развивалось в подобных условиях [16—18]. Первые успехи в культивировании эмбрионов были достигнуты J. Hammond [19] в 1949 г. В простом растворе из неорганических солей с добавлением яичного белка и желтка ему удалось дорастить 8-клеточный эмбрион мыши до бластоцисты [19]. Несколько позже, в 1956 г., W. Whitten [20], полагаясь на исследования J. Hammond, создал среду M16, основой которой стал раствор Рингера—Кребса с добавлением глюкозы и антибиотиков. Данная среда не только позволяла получать бластоцисты, более того, эмбрионы хорошо приживались и давали потомство. В 1957 г. W. Whitten расширил свои исследования, добавив лактат в свою среду, что позволило развиться эмбриону со стадии 2 клеток, но, к сожалению, не из зигот. Это явление было названо «блок дробления» — остановка развития эмбриона на какой-либо стадии дробления [20]. Почти десятилетие спустя в 1968 г. J. Biggers, D. Whittingham, и R. Donahue [21, 22] обнаружили, что добавление пирувата создает среду, которая поддерживает развитие от оплодотворенной яйцеклетки до стадии 2 клеток.

Первые попытки культивирования эмбрионов человека были предприняты в конце 60-х — начале 70-х годов R. Edwards и P. Steptoe и соавт. [23]. В 1969 г. авторы использовали в качестве среды культивирования раствор Тирода T6 — модификацию раствора Рингера с добавлением энергетических субстратов, таких как глюкоза, лактат и пируват. Однако, несмотря на успешные ранее результаты при ЭКО с яйцеклетками хомяков, они получили неудовлетворительный результат при культивировании человеческих эмбрионов [23]. Следующие несколько лет R. Edwards проводил эксперименты с множеством сред, лучший результат продемонстрировал раствор Хема с добавлением 20% телячьей сыворотки Ham’s F-10. Данная среда позволила получить первые бластоцисты и первую беременность с рождением здоровой девочки в 1978 г. Несмотря на успешный исход, долгое время при использовании этой среды довольно часто наблюдалась остановка дробления эмбрионов на стадии 4—8 клеток, а бластоцисты получались крайне редко. Таким образом, началась активная разработка новых сред и способов культивирования.

Следуя принципу «back to nature», стали активно изучать составы жидкостей маточных труб животных и человека. Таким образом были открыты среда B2 («Synthetic oviduct fluid medium»), которая использовалась в основном во Франции и также получила название «Французская среда», и среда HTF — human tubal fluid medium. Последняя была наиболее проста в приготовлении и получила широкое распространение в программах ВРТ. После нескольких лет использования среды HTF было сделано предположение, что глюкоза и фосфаты, входящие в состав среды, оказывают токсическое действие и влияют на «блок дробления» эмбрионов на ранних стадиях развития. Так, появилась сначала среда Basal XI HTF, в которой глюкозу заменили глютамином, убрали фосфаты и добавили ЭДТА, затем среда Preimplantation stage-1 (P1), в которой заменены ЭДТА и глутамин уже на цитрат и таурин соответственно [24]. В конце 80-х годов было окончательно доказано негативное влияние глюкозы и фосфатов на развитие эмбрионов. Эти исследования дали начало развитию этапа двухступенчатых сред.

В начале 90-х годов в США в результате масштабной программы, которая была неофициально известна как «Культурный клуб» (официально — «Национальная совместная программа по экстракорпоральному оплодотворению и преимплантационному развитию»), создаются две среды для культивирования эмбрионов мышей. Первой из них была двухступенчатая среда Chatot—Ziomek—Bavister (CZB), в которой глюкоза добавлялась только с 4-клеточной стадии, что предотвращало «блок развития» на 2-клеточной стадии. Второй средой для мышей, возникшей в данном клубе, была KSOM — симплекс-оптимизированная среда (SOM) с пониженной по сравнению с CZB концентрацией NaCl, KP₂PO₄, пирувата, глюкозы и добавлением калия в повышенной концентрации [25].

Группа B. Bavister [26] в 90-х годах прошлого века также начала изучать аминокислотный состав сред и установила, что определенный набор аминокислот полезен для развития эмбриона хомяка in vitro, в то время как некоторые другие аминокислоты вредны [26]. Примерно в то же время ученые D. Gardner и M. Lane [27] показали, что добавление раствора аминокислот Eagle’s minimum essential medium (MEM) в среду для культивирования эмбрионов оказывает положительное влияние на их развитие.

На протяжении долгих лет неоднократные исследования по сравнительному изучению одно- и двухфазных сред не давали достоверных различий в эффективности какой-либо из двух сред. Преимущества однофазных сред заключаются в отсутствии необходимости смены среды во время культивирования эмбрионов в отличие от двухфазных. Кроме того, одношаговая среда позволяет избежать изменений pH, температуры, состава газового окружения и воздействия света, которые происходят во время замены сред, при этом эмбрион не теряет аутокринных факторов, которые производит [28].

Первоначально стандартная морфологическая оценка была единственной доступной стратегией [29]. В 1999 г. D. Gardner [цит. по 30] представил классификацию бластоцист со следующими обозначениями: цифра (от 1 до 6) обозначает степень развития эмбриона; первая буква (A, B, C) — качество зародышевого узла (эмбриобласт-ICM), вторая буква (A, B, C) — качество трофобласта (TE).

Ее используют для оценки качества эмбрионов на 3-и и 5-е сутки развития, однако в данном случае необходимо извлекать чаши с эмбрионами из инкубатора для исследования. По данным Венского консенсуса 2017 г., определены наиболее эффективные параметры оценки качества эмбриона. В первую очередь подсчет доли оплодотворенных яйцеклеток с одним пронуклеусом на 1-й день (17±1 ч после оплодотворения). Затем на 1-е и 2-е сутки проводится контроль скорости расщепления оплодотворенных яйцеклеток, в том числе раннее расщепление, которое происходит через 26±1 ч после оплодотворения методом ИКСИ или через 28±1 ч после ЭКО. Скорость развития эмбрионов определяется как доля расщепленных эмбрионов до 4-клеточной стадии на 2-й день (44±1 ч после оплодотворения) или до 8-клеточной стадии на 3-й день (68±1 ч после оплодотворения) при нормально оплодотворенных яйцеклетках. Однако данный показатель обладает наибольшей эффективностью только в случае переноса эмбриона на 2-е или 3-е сутки. При переносе эмбрионов на 5-е сутки рекомендовано оценивать скорость развития бластоцисты — количество качественных бластоцист в зависимости от количества нормально оплодотворенных яйцеклеток [30].

Во время процедуры ЭКО гаметы и эмбрионы проводят большую часть своего времени в пределах лабораторного инкубатора. Инкубаторы в лаборатории ЭКО играют ключевую роль в обеспечении стабильной и соответствующей культурной среды, необходимой для оптимизации развития эмбрионов и клинических результатов. Поэтому поддержание экологической стабильности внутри камеры инкубатора имеет решающее значение для снижения стрессовых факторов окружающей среды и поддержания соответствующих условий роста [31].

Изначально использовались однодверные инкубаторы для культивирования эмбрионов. Их недостаток заключался, главным образом, в неблагоприятном воздействии факторов окружающей среды при открывании дверцы инкубатора на все культивируемые эмбрионы, находящиеся в данном резервуаре. С развитием технологий появились планшетные инкубаторы, в которых система подачи газа в камеры обеспечивает индивидуальное инкубирование, при котором открывание одной камеры не оказывает прямого воздействия на газовый состав в других закрытых камерах и предотвращает частые колебания уровня температуры и газа, которые могут оказать неблагоприятное воздействие на культивируемые эмбрионы. Однако даже при использовании планшетных инкубаторов невозможно полностью исключить влияние окружающих факторов на культивируемые эмбрионы в связи с необходимостью их извлечения из аппарата на 3-и сутки культивирования для оценки качества.

Альтернативный подход к этой проблеме привел к разработке инкубатора нового типа со встроенной системой time-lapse — системой покадровой съемки развития эмбриона — мониторинга, который стал коммерчески доступным в 2009 г. и позволил эмбриологам анализировать динамику развития эмбрионов от оплодотворения до образования бластоцисты [32]. Эта новая практика быстро растет и используется во многих центрах ЭКО по всему миру [33].

Time-lapse-микроскопия, или TLM (микроскопия с временны́м интервалом), является современным методом выбора эмбриона с максимальным потенциалом имплантации. Технология позволяет проводить неинвазивное наблюдение за эмбрионами без необходимости изменять оптимальные условия их культивирования [34, 35]. Это важно, поскольку документально подтверждено, что колебания влажности, температуры, света и pH негативно влияют на развитие и качество эмбриона [36]. Благодаря этой методике возможна оценка морфологии эмбрионов в динамике, с интервалом в 5—10 мин [34, 35].

Многие морфокинетические параметры, полученные для эмбрионов, культивируемых в системе time-lapse, оцениваются как биомаркеры для оптимального отбора эмбрионов с высоким потенциалом имплантации [37]. В настоящее время существует более 23 параметров time-lapse по морфокинетической оценке эмбрионов [38].

Получены противоречивые данные о результатах использования time-lapse system. Неясно также, отличается ли вариабельность параметров системы time-lapse среди эмбрионов одного и того же цикла в разных случаях успешной и неудачной имплантации [37].

Один из важнейших показателей результативности вспомогательных репродуктивных технологий — ЧНБ. Несмотря на многолетние исследования системы time-lapse, остается спорным вопрос об успешности влияния данного метода культивирования на ЧНБ.

В 2017 г. испанские ученые провели исследование и выяснили, что нет существенных различий между частотой наступления клинической беременности у пациентов в зависимости от метода культивирования эмбрионов. Так, ЧНБ составила 49,3% при использовании TLM по сравнению с 40,0% при использовании стандартного способа культивирования [39]. Схожие данные мы можем наблюдать в результатах индийского исследования 2018 г., которое также не выявило значимых различий по ЧНБ. Уровень имплантации (53,1% против 51,5%) и клиническая беременность (47,8% против 44,6%) были признаны одинаковыми в обеих группах: культивирование с помощью TLM и стандартный метод культивирования [40].

РКИ, проведенное в двух частных центрах ЭКО в Венгрии в 2018 г., показывает незначительные различия между группами культивирования в TLM по сравнению со стандартными методами культивирования, хотя и отмечается тенденция, благоприятствующая отбору, — 46,3% против 34,6% [41]. При этом в одном из последних французских исследований 2021 г. показано, что уровень биохимической беременности и клинические показатели беременности выше в группе культивирования эмбрионов в системе time-lapse — 34,3% против 24,0% и 32,3% против 21,9% соответственно [42].

В статье индийских ученых также указывается, что вероятность имплантации значительно выше в группе эмбрионов, культивируемых с использованием системы time-lapse (68,4% против 48,6%), по сравнению с таковой в контрольной группе. Существует значительная разница в вероятности имплантации двух групп из-за различных критериев отбора, так как TLM благодаря более точному определению морфокинетики является лучшим вариантом для получения более высокой скорости имплантации [43].

Несмотря на противоречивые данные по ЧНБ, методика time-lapse позволяет не только оценить клинические исходы, но и улучшить отбор морфологически лучших эмбрионов, а также описать каждое динамическое событие во время его развития.

Поэтому главная задача заключается в том, чтобы идентифицировать в когорте эмбрионов экземпляр с самым высоким потенциалом имплантации.

Кроме того, визуальная оценка дает только изображение эмбриона в конкретное время, игнорируя то, что происходит в промежутках между двумя наблюдениями, и возможные аномальные события остаются неопознанными [44].

В одном из последних исследований индийские ученые показали, что частота образования бластоцисты в группе культивирования эмбрионов с использованием методики time-lapse составляет 42,6% против 39,9% в группе с использованием стандартных инкубаторов [43].

В 2021 г. бразильские исследователи опубликовали данные, которые отражают статистически значимые различия по частоте образования бластоцисты (57,1% по сравнению с 50,0%; p=0,007), однако ЧНБ была практически одинаковой в обеих группах (38,3% против 33,9%; p=0,532) [45].

Заключение

Несмотря на растущее количество циклов ЭКО, включающих замедленную визуализацию для оценки и отбора эмбрионов, в настоящее время не существует доказанных показателей эффективности, связанных с использованием системы time-lapse, для лаборатории ЭКО из-за ограниченных, разнообразных и противоречивых данных. Поэтому перспективой развития обсуждаемой проблемы являются изучение и внедрение показателей эффективности, связанных с применением time-lapse system, для отбора эмбриона наивысшего качества и повышения частоты наступления беременности в циклах ЭКО.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.А. Самойлова, К.В. Краснопольская

Сбор и обработка материала — А.А. Самойлова, И.Ю. Ершова

Статистическая обработка — А.А. Самойлова

Написание текста — А.А. Самойлова, И.Ю. Ершова

Редактирование — К.В. Краснопольская, А.П. Куллыев

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — A.A. Samoilova, K.V. Krasnopol’skaya

Data collection and processing — A.A. Samoilova, I.Yu. Ershova

Statistical processing of the data — A.A. Samoilova

Text writing — A.A. Samoilova, I.Yu. Ershova

Editing — K.V. Krasnopol’skaya, A.P. Kullyev

Authors declare lack of the conflicts of interests.