Эффективное лечение пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями пародонта, как правило, предполагает в комплексе целого ряда вмешательств использовать медикаментозное воздействие на пародонтопатогенные бактерии как основной этиологический фактор пародонтита [1-8].

Несмотря на доказанную клиническую эффективность антисептиков и антибиотиков, они имеют ряд недостатков, которые могут состоять как в недостаточно эффективном их действии вследствие как исходной, так и возникающей в процессе лечения резистентности микрофлоры, так и в выраженных побочных эффектах, характерных для антибиотикотерапии [2, 4, 11]. Поэтому представляется целесообразным изучить наиболее перспективные методы микробиологического исследования, в частности, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и масс-спектрометрию, для получения наиболее объективной информации о видовом составе микрофлоры с последующим выбором адекватных антимикробных средств местного воздействия.

Для проведения микробиологической диагностики современные лаборатории предлагают использовать ПЦР с применением стандартных маркеров известных патогенов. При этом масс-спектрометрия, позволяющая путем высокоточного «взвешивания» молекул определить видовую принадлежность микроорганизма и безусловно являющаяся очень перспективным методом, применяется чрезвычайно редко [2, 9, 10].

Каждая из предложенных методик имеет как недостатки, так и преимущества. Так, при проведении ПЦР-диагностики удается обнаружить ДНК микроорганизмов, которые не всегда удается культивировать по многим причинам (недостаточная анаэробизация, пропитывание штифта, попадание кислорода, взбалтывание при транспортировке). Но при всей ценности данная методика дает лишь ответ на вопрос о присутствии конкретного вида патогена с учетом заложенных в диагностический набор праймеров, поскольку преимущественно применяется метод качественной оценки. И в таком случае микроорганизмы необязательно должны присутствовать в живом виде.

Высокоточная методика масс-спектрометрии позволяет установить видовую принадлежность всех жизнеспособных и культивируемых бактериальных форм [2, 9, 10, 12]. Именно сохранение жизнеспособности и свойств культивирования остается наиболее сложной проблемой при заборе и транспортировке образцов бактериальных культур, и в этом на сегодня - основная сложность методики. Но с ее помощью можно определить наличие патогенов, на которые не закладываются праймеры в ПЦР.

Вследствие сказанного понятна необходимость сравнительной оценки степени информативности каждого из указанных методов, чтобы объективно определить либо наиболее показательный из них, либо их сочетание в целях получения максимальной информации, важной для клинициста.

Обследованы 14 пациентов в возрасте от 25 до 70 лет с воспалительными поражениями пародонта разных степеней тяжести. Забор материала был проведен в области 18 зубов: 6 фронтальных и 12 жевательных. Обследование предполагало сбор анамнеза и осмотр пациентов. Дополнительные методы включали в себя ортопантомографию и микробиологическое исследование.

Жалобы пациентов были типичными для пародонтита разных степеней. При осмотре фиксировали кровоточивость и отечность десны, подвижность зубов I-III степени, глубину пародонтальных карманов (ПК) от 3 до 7 мм, наличие гноетечения в области отдельных ПК.

Рентгенологически определялись в основном смешанный (неравномерный) тип деструкции костной ткани, нарушение целостности или отсутствие кортикальной пластинки разной степени, очаги остеопороза.

Забор материала. Для изучения микробного содержимого ПК стерильный бумажный штифт стерильным пинцетом помещали в ПК, где он в течение 7-10 с пропитывается его содержимым (рис. 1, см. на цв. вклейке)

Пробирку плотно закрывали, проводили маркировку образца и не более чем в течение 2 мин помещали в анаэростат с предварительно увлажненным газ-пакетом. Анаэростат перевозили в лабораторию научно-производственного центра «МикроМир» (рис. 3, см. на цв. вклейке).

В лаборатории проводили параллельный рассев образцов на питательную среду Brain Heart Infusion с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови с последующей идентификацией микроорганизмов (рис. 4, см. на цв. вклейке).

ПЦР - это получение множества копий специфического фрагмента ДНК в пробирке (in vitro). Она основана на трехэтапном циклическом процессе, в результате которого многократно увеличивается количество специфического фрагмента ДНК: денатурация, гибридизация праймеров, полимеризация, или элонгация, цепи ДНК.

ПЦР-тестирование клинического материала проводили в реальном времени с использованием набора праймеров фирмы «Литех» к 6 пародонтопатогенам: Prevotella intermedia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Actinobacillus actinomycetemcomitans), Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Fusobacterium nucleatum^[1].

Масс-спектрометрия - высокоточная методика, позволяющая установить видовую принадлежность всех жизнеспособных и культивируемых бактериальных форм. Это - физический метод измерения отношения массы заряженных частиц вещества к их заряду. Масс-спектрометр представляет собой прибор, способный в условиях вакуума разделять находящиеся в газовой фазе заряженные частицы вещества согласно отношению их массы к заряду (m/z ratio).

Метод масс-спектрометрии применяли, чтобы получить более широкое представление о характере микробного содержимого ПК после получения клонированных колоний бактериальных культур в соответствии со сроками и условиями культивирования.

Пилотное исследование выявило высокую распространенность облигатных пародонтопатогенов в ПК при агрессивном и хроническом течении пародонтита всех степеней тяжести.

Анализ результатов ПЦР-диагностики показал наличие A.a. у 64% обследованных пациентов с пародонтитом. Важно отметить, что во всех случаях агрессивного пародонтита было зафиксировано присутствие данного микроорганизма.

P.g. обнаружены у 50% пациентов с пародонтитом, P.i. - у 36%, P.e. - у 14%, F.n. - у 7%. Следует отметить, что пародонтопатоген T. denticola не выявлен ни в одном из образцов при ПЦР-тестировании.

При сравнении данных установлено, что A.a. чаще всего встречается при хроническом генерализованном пародонтите (ХГП) легкой и средней степени тяжести и при быстропрогрессирующем пародонтите. При тяжелой степени ХГП в образцах чаще всего встречаются P.g. и F.n.

Анализ результатов масс-спектрометрии показал, что только ее использование не всегда позволяет выявить облигатные пародонтопатогены, поскольку данная методика учитывает наличие только жизнеспособных и культивируемых бактериальных форм, получение которых не всегда возможно по ряду причин: недостаточная анаэробизация, недостаточное пропитывание штифта, попадание кислорода, взбалтывание при транспортировке и др.

В то же время удалось получить сведения о наличии нехарактерных для полости рта патогенов как с аэробным, так и с анаэробным типом дыхания, присутствие которых обычно выявляется при воспалительных заболеваниях кожи (Staph. aureus spp., Strept. pyogenes spp., St. epidermidis), желудочно-кишечного тракта (Wolinella recta, Staph. aureus, Esherichia coli, Enter. faecalis), мочеполовой системы (Enter. faecium, Staph. epidermidis), ЛОР-органов (Staph. aureus spp., Strept. pyogenes spp., Strept. pyogenes spp., Staph. aureus spp., Staph. epidermidis spp., Klebsiella spp.) в соответствующем материале (экссудате, слизи, кале, моче и т.д.).

Результаты исследования приведены в таблице.

Метод ПЦР, безусловно, очень значим для стоматологов, и на сегодняшний день он общепризнан в мире в качестве основного диагностического метода в пародонтологии. Тем не менее и он не лишен целого ряда недостатков. Так, ориентироваться на 4-8 видов микроорганизмов в целях оценки тяжести процесса, его формы, а также лечебного эффекта представляется не вполне резонным. Трудно представить себе, что эти (пусть и безусловно весьма важные) патогены «работают» сами по себе - без симбиоза с остальными 400-700 видами бактерий. Поэтому констатация тяжести процесса и оценка эффекта лечения представляются весьма условными.

Особенности микрофлоры при разных патологических процессах в тканях пародонта были выявлены параллельным проведением ПЦР-диагностики и масс-спектрометрии.

Сочетание 2 методов идентификации позволило провести углубленный анализ микробного пейзажа ПК, в частности, установить патогены, не рассматриваемые ранее в качестве специфичных для пародонтита и участвующие в воспалительных процессах других органов и систем: Staph. epidermidis, Micrococcus luteus, Esherichia coli, Klebsiella pneumoniae и др. Это расширяет наши представления о микробной этиологии воспалительных заболеваний пародонта и может послужить целям совершенствования лечебной антимикробной тактики.