Большинство исследователей в мире рассматривает микробный фактор как основной в развитии воспалительных заболеваний пародонта [12].

Патология пародонта редко бывает не связанной с другими заболеваниями. Имеются работы, в которых методами медицинской статистики показана взаимосвязь между повышенным риском развития пародонтита и болезнями гастродуоденальной зоны, возбудителями которых является Helicobacter pylori. Однако доминирующими остаются фекально-оральный и орально-оральный механизмы передачи H. pylori [1, 13]. Около 10% лиц, инфицированных H. pylori, страдают язвенными болезнями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), от 1 до 3% — аденокарциномой желудка и около 0,1% — лимфомой, ассоциированной со слизистой оболочкой ЖКТ [14].

В работах других авторов показано, что накопление в кишечнике облигатного внутриклеточного эндосимбионта Akkermansia muciniphila положительно влияет на риск возникновения у таких пациентов диабета, ожирения, атопического дерматита и постантибиотической диареи, ассоциированных с Clostridium dificile [3—7].

Важность изучения факторов риска возникновения пародонтита определяется еще и тем, что в России распространенность этого заболевания у пациентов в возрасте до 25 лет за последние десятилетия существенно выросла. Состав микробиома пародонта у пациентов с агрессивным пародонтитом рассмотрен в нескольких работах, выполненных современными высокоточными методами: с помощью NGS-секвенирования [9—11] и гибридизации на микрочипах (HOMIM) [2]. Однако авторы этих работ акцентировали внимание преимущественно на пародонтопатогенах, не придавая достаточного значения потенциальной пародонтопротекторной микрофлоре.

Выявленные в перечисленных работах пародонтопатогены в основном представлены Aggregatibacter actinomycetemcomitans и компонентами так называемого красного комплекса по Сокранскому, которые давно известны и могут быть выявлены и без использования NGS-технологий с помощью общедоступных наборов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. I. Adler, S. Huse и соавт. [2, 8] подчеркивают важную роль в развитии агрессивного пародонтита Parvimonas micra и Filifactor alocis.

С учетом изложенного, целью настоящей работы явилось изучение методом глубокого секвенирования взаимосвязи состава микробиома пародонта и кишечника у пациентов с пародонтитом разной степени тяжести и у лиц со здоровым пародонтом.

В исследование включили пациентов, наблюдавшихся в ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава Р.Ф..

Были сформированы 2 выборки: здоровые лица (15 человек) и пациенты с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) разной степени тяжести (15 человек). Все пациенты, включенные в исследование, не имели системных заболеваний и подписали информированное согласие, в котором были подробно описаны условия участия в исследовании. Степень тяжести пародонтита устанавливали по данным клинического обследования, глубине пародонтальных карманов (ПК) и степени деструкции костной ткани.

Для максимальной объективизации результатов и цифрового выражения уровня гигиены полости рта, степени воспаления тканей пародонта применяли стандартные методики определения индексов Silness—Loe и Muhlemann—Cowell, а степень подвижности зубов устанавливали по Miller в модификации Flezar. В качестве дополнительного метода обследования для уточнения состояния костного субстрата использовали цифровую ортопантомографию.

Образцы материала из ПК отбирали с помощью стерильного бумажного эндодонтического штифта по 4 пробы от каждого пациента: 2 пробы «А» из ПК в области первых моляров (при их отсутствии — в области премоляров) и 2 пробы «Б» из ПК резцов. Материал для исследования брали дважды от каждого пациента.

Для выделения ДНК штифты помещали в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл, содержащие по 0,5 мл раствора для гомогенизации образцов из набора Проба-Рапид («ДНК-Технология», Москва). Суммарную ДНК материала из ПК пациентов выделяли с помощью набора реагентов Проба-ГС (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Препарат ДНК, соответствующий 1/10 объема 1 смыва (50 мкл), растворяли в 50 мкл элюирующего раствора (комплектация Проба-ГС).

С применением метода NGS-секвенирования банков суммарной ДНК отделяемого ПК с праймерами на область V6 16S рДНК анализировали представленность видов и родов бактерий в микрофлоре пародонта пациентов с пародонтитом и лиц со здоровым пародонтом.

Обработку данных глубокого секвенирования проводили согласно следующему протоколу:

— распределение и изучение данных по библиотекам на основании последовательностей баркодов проводилось с помощью программы Sabre (https://github.com/najoshi/sabre); предъявлялось требование точного совпадения последовательности баркодов с ожидаемой; в результате удалось идентифицировать 72,3% индивидуальных последовательностей;

— проводился тримминг с использованием программы Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/?page= trimmomatic); набор параметров:

LEADING:25 (триммирование с левого конца по Q25);

TRAILING:25 (триммирование с правого конца по Q25);

SLIDINGWINDOW:4:15 (триммирование с помощью плавающего окна, длина окна — 4, минимальное среднее значение качества в окне — 15);

MINLEN:36 (минимальная длина тримминга);

— с помощью команды ILLUMINACLIP из последовательности удаляли последовательности баркодов и другие технические последовательности;

— анализ метагеномных образцов по 16SРНК проводился с помощью программы Mothur (http://www.mothur.org/); использовался протокол http://www.mothur.org/wiki/ MiSeq_SOP в варианте OTU-based analysis; для статистической обработки результатов использовали пакет программ Statistica 8.0;

— для проверки гипотезы о существовании достоверных статистических различий в представленности OTU в микробных консорциумах пародонта и кишечника после анализа выборок на нормальность распределения (по Колмогорову—Смирнову) был использован параметрический критерий Стьюдента.

NGS-секвенирование образцов суммарной ДНК материала из ПК и кишечного содержимого обеспечило разрешение от 91 234 до 213 786 индивидуальных последовательностей нуклеотидов на образец. Анализ этих последовательностей позволил идентифицировать в образцах обоих типов по 260—268 родов и 497—500 видов бактерий.

Сопоставление списков нуклеотидов дало возможность установить совпадение 242 (93%) родов из 260, т. е. микробиом пародонта и кишечника во многом сходен. Более того, среди несовпадающих родов преобладают микроорганизмы, заведомо не способные выживать во внутренней среде организма человека. По-видимому, они занесены туда с водой или пищей: например, водоросли Leuconostoc и Spirulina, симбионты растений (фитопатогены) Rhizobium, Bradirhizobium, Agrobacterium, представители аэробной микрофлоры Pseudomonas, Burkholderia, Sphingomonas, Pseudoxanthomonas, а также митохондрии животных.

Сопоставление встречаемости в микробиоценозах кишечника и пародонта OTU ранга вида выявляет существенно большие различия, чем в случае OTU ранга рода: из 500 видов совпадают только 272. Сходство между анаэробными консорциумами пародонта и прямой кишки проявляется и в том, что доминирующим видом в обоих случаях является Fusobacterium nucleatum.

Анализ выборок по Колмогорову—Смирнову показал распределение признаков, близкое к нормальному. Поэтому дальнейшее сравнение родов бактерий в микробиоценозе кишечника у групп пациентов с наличием и отсутствием ХГП было проведено с применением критерия Стьюдента и подтвердило наличие существенных различий между группами (табл. 1).

Достоверность полученных данных была проверена путем сопоставления состава родов в микробиоценозе пародонта у групп пациентов с наличием и отсутствием диагноза ХГП по той же методологической схеме; наличие существенных различий подтвердилось между группами (табл. 2).

Аналогичным способом было проведено сопоставление состава родов бактерий в микробиоценозе пародонта у групп пациентов с наличием и отсутствием диагноза ХГП, что также подтвердило наличие существенных различий между группами (см. табл. 2).

Анализируя данные табл. 1 и 2, необходимо отметить, что на уровне родов бактерий наблюдаются только три группы, повышение концентрации которых связано c патологическим состоянием пародонта: Brachymonas, Longilinea и Streptococcus. Причем для последнего рода различия между контрольной и основной группами статистически недостоверны, хотя средние величины различаются почти в 4 раза. Все 3 рода относятся к микрофлоре кишечника, а не пародонта, что подтверждает тезис о системном характере взаимосвязи между составом микробиоценозов кишечника и пародонта. Существенно большее количество групп: 20 родов микрофлоры кишечника и 6 родов микрофлоры пародонта ассоциированы со здоровым пародонтом. Роды Akkermansia, Thalassospira, Oxalobacter, Gracilibacter, Fibrobacter и Howardella представлены в фекалиях лиц со здоровым пародонтом в 200, 105, 88, 51, 27 и 25 раз в большей концентрации, чем в фекалиях пациентов с воспалительными поражениями пародонта. Они могут рассматриваться как потенциальные энтеропротекторы системного действия. Обращает на себя внимание присутствие среди протекторной микрофлоры пародонта рода Aggregatibacter, в который входит опасный пародонтопатоген Aggregatibacter actinomycetemcomitans. По-видимому, этот факт объясняется тем, что наиболее опасными конкурентами пародонтопатогенов могут являться их ближайшие таксономические родственники, обладающие сходным типом метаболизма, но не имеющие факторов патогенности.

Наиболее интересен факт обнаружения в кишечнике лиц со здоровым пародонтом повышенной доли бактерий рода Akkermansia (содержит единственный вид Akkermansia muciniphila). С 2013 г. опубликовано более 20 работ, в которых повышенный уровень A. muciniphila в микробиоценозе кишечника ассоциируется с индивидуальной устойчивостью человека к ожирению, диабету 2-го типа и развитию метаболического синдрома при любом типе питания [4]. В экспериментах на мышах и в ходе клинических исследований авторы установили, что повышение доли этой бактерии эффективно предотвращает развитие ожирения и диабета 2-го типа, в том числе при наличии генетической предрасположенности к диабету (на трансгенных мышах). Повышение содержания этой бактерии увеличивает продукцию эндогенных каннабиноидов, что способствует снижению склонности пациентов к локальным воспалительным реакциям. При этом авторы этой и других публикаций констатируют невозможность культивирования A. muciniphila на искусственных средах. Поэтому единственным методом влияния на ее численность остается использование пребиотиков.

Следующей задачей работы было сравнение количества бактерий различных видов в микробиоценозе кишечника у пациентов с наличием и отсутствием ХГП; сравнение также выполнялось с применением критерия Стьюдента (табл. 3).

Аналогичным способом было выполнено сравнение количественного состава бактерий различных видов в микробиоценозе пародонта у групп пациентов с наличием и отсутствием ХГП (табл. 4).

Анализ выявил следующие закономерности:

— у пациентов с диагнозом ХГП наблюдается повышенное содержание в составе поддесневой микрофлоры 3 пародонтопатогенов «красного комплекса» по Сокранскому: P. gingivalis (p=0,0001), T. forsythensis (p=0,0002) и T. denticola (p=0,0012). В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных ХГП составляют: для P. gingivalis — 6,7 цикла (104 раза), для T. forsythensis — 4,3 цикла (17 раз), для T. denticola — 2,3 цикла (4,9 раза). Обсемененность A. аctinomycetemcomitans и P. intermedia не является существенным фактором патогенеза, они в равной мере встречаются в контроле и у пациентов с ХГП соответственно (p=0,56 и 0,09);

— у пациентов с диагнозом ХГП наблюдается повышенное содержание в микробиоме кишечника представителей семейств Enterobacteriaceae (p=0,01) и Eubacteriaceae (p=0,003). В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных пародонтитом составляют: для Enterobacteriaceae — 2,6 цикла (6 раз), для Eubacteriaceae — 3,9 цикла (15 раз).

Анализируя перечень видов из состава микробиоценозов кишечника и пародонта, ассоциированных с тем или иным состоянием пародонта, необходимо отметить, что, как и при анализе родов, в нем резко преобладают виды-протекторы, тогда как видов-патогенов насчитывается только два: Leptotrichia spp. и Brachymonas spp. Оба они идентифицированы в качестве фактора риска развития пародонтита в микробиоме кишечника, однако степень ассоциации этого признака с повышенным риском развития пародонтита невысока (соответственно t=4,0 и 3,3). Напротив, число видов-протекторов, повышение доли которых в консорциуме снижает риск развития пародонтита, достаточно велико: 39 видов в микробиоме кишечника и 19 — в микробиоме пародонта.

Наиболее значим из обнаруженных маркеров отсутствия предрасположенности к ХГП оказалось повышение доли в консорциуме A. muciniphila (t=133,7 при р=10^–6). Этот результат полностью совпадает с наблюдениями, сделанными при анализе ассоциации по родам, что ожидаемо: в роде Akkermansia в настоящее время присутствует только 1 вид. Опубликованные данные о биологии A. muciniphila не позволяют судить о механизме ее воздействия на состояние здоровья человека [7], но имеется несколько статистически подтвержденных сообщений о положительном влиянии этой бактерии на риск развития диабета, ожирения, атопического дерматита и постантибиотической диареи, ассоциированной с C. dificile [3]. Имеются данные лабораторных исследований, показывающие способность A. muciniphila непосредственно влиять на снижение уровня холестерина в крови, провоспалительных цитокинов в крови, метаболизм антиоксидантов, поступающих с пищей. В совокупности эти наблюдения скорее позволяют предполагать наличие системных эффектов A. muciniphila на организм в целом, которые обусловливают лучшую или худшую степень защиты пародонта от воспалительных поражений. Опираясь на данные публикаций, аналогичный эффект, хотя и менее выраженный, может быть приписан и виду Ruminococcus bromii [7], повышение доли которого в консорциуме кишечника, по нашим данным, тесно связано с развитием пародонтита.

Описывая состав прочих видов, повышение доли которых в консорциуме влияет на риск развития пародонтита, необходимо отметить большое число видов, родственных известным пародонтопатогенам.

Системный характер взаимосвязи между составом микробиоценозов кишечника и пародонта подтверждается сходством между анаэробными консорциумами пародонта и ЖКТ.

Нами выявлено, что у пациентов со здоровым пародонтом процентное содержание P. gingivalis в консорциуме кишечника среднем в 2 раза выше, чем у пациентов с ХГП. Доля другого пародонтопатогена — T. denticola — в консорциуме кишечника контрольной группы в 6 раз выше, чем у пациентов с ХГП. При этом качественно оба вида пародонтопатогенов присутствуют в микробиоме кишечника всех пациентов как со здоровым, так и с пораженным пародонтом. Можно предположить, что защитный эффект гиперколонизации кишечника P. gingivalis и T. denticola опосредован на уровне индукции специфического иммунитета против пародонтопатогенов в форме выработки протективных антител. Не исключено также, что различия в содержании P. gingivalis и T. denticola в кишечнике двух сравниваемых групп обусловлены неодинаковым поведением других механизмов иммунитета на системном или местном уровне. Факт повсеместной встречаемости P. gingivalis и T. denticola в кишечнике всех пациентов вне зависимости от пародонтологического диагноза позволяет предполагать, что прямой обмен микрофлорой между слизистыми различных участков желудочно-кишечного тракта хотя и существует, но не являeтся единственным или даже центральным механизмом стабилизации состава микробиоценозов. По-видимому, эту функцию в первую очередь выполняют трофические цепи, симбиотические и антагонистические взаимодействия между анаэробными консорциумами в составе микробиоценоза, которые принципиально сходны в обоих случаях. Сходство между анаэробными консорциумами пародонта и прямой кишки проявляется и в том, что доминирующим видом в обоих случаях является Fusobacterium nucleatum.

При анализе пародонтопатогенных микроорганизмов, выявленных методом NGS-секвенирования, установлены наиболее близкие таксономические родственники большинства патогенов: A. segnis и A. aphrophilus (родственники A. actinomycetemcomitans), T. vencentii (родственник T. denticola), P. baroniae, Prevotella salivae и P. spp. (родственники P. intermedia), а также C. concisus (родственник C. jejuni — возбудителя энтероколитов).

Таким образом, наблюдаемая тенденция к острой конкуренции между близкими видами, включающими патогенные и протекторые варианты, позволяет предполагать аналогичное явление и внутри видов. Системный характер взаимосвязи между составом микробиоценозов кишечника и пародонта подтверждается сходством между анаэробными консорциумами пародонта и ЖКТ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственное задание № 19.1724.2014/К в сфере научной деятельности).