В XXI веке на смену традиционным методам обследования и диагностики приходят современные технологии, способные обрабатывать информацию на микроструктурном уровне. Примером такого метода является рамановская спектроскопия, которая успешно используется во многих областях медицины.
Цель обзора — ознакомиться с методом рамановской спектроскопии, изучить области ее применения в медицине и, в частности, стоматологии.
Рамановская спектроскопия представляет собой метод, основанный на изучении рассеянного света и применяемый для ускоренной идентификации объектов исследования в биологии, медицине, фармации, криминалистике и других областях [1].
Первые наблюдения новых линий в спектре рассеянного света на кристаллах минерального кварца сделали в 1928 году отечественные ученые Г.С. Ландсберг и Л.И. Мандельштам, которые назвали такой эффект комбинационным рассеянием света. Он подразумевает под собой спектр рассеяния, который является комбинацией частот возбуждающего света и собственных колебаний молекулы. Чуть позже отечественных физиков это явление наблюдали индийские ученые Ч.В. Раман и К.С. Кришнан на жидкостях, используя солнечные лучи в качестве источника света. Механизм действия спектроскопа основан на феномене резонансного рамановского неупругого монохроматического света. Применяя определенные комбинации абсорбционных светофильтров, авторы исследования пришли к выводу, что в жидкостях происходит рассеяние света, сопровождаемое сдвигом частоты.
Результаты своих экспериментов они интерпретировали как проявление оптического аналога эффекта Комптона [2].
Принцип рамановской спектроскопии основан на взаимодействии лазерного луча с молекулами вещества [3]. Благодаря светофильтру из полученного пучка выделяются рассеянные лучи, которые усиливаются и регистрируются в виде индивидуального набора спектральных линий, имеющих другую частоту по сравнению с падающим потоком света. Спектры рассеяния имеют чувствительность к природе химических связей как в органических молекулах, так и в неорганических кристаллических решетках [4]. Для сбора спектральной информации об исследуемом образце рамановские лучи, полученные после контакта с веществом, отделяют от рэлеевских, которые являются упругим рассеиванием световых спектров частицами, уступающими по размеру длинам волн [1].
Механизм рассеяния света на молекуле состоит из нескольких этапов. Первый представлен поглощением инфракрасного кванта, что приводит к переходу молекулы на новый колебательный подуровень.
После этого наблюдается стоксово комбинационное рассеяние, молекула которого находится в невозбужденном состоянии и при взаимодействии со светом переходит выше по колебательному подуровню. Энергия рассеянного света в данном случае меньше, чем у возбуждающего (зеленый → оранжевый).
Антистоксово комбинационное рассеяние определяется в том случае, когда возбужденная молекула взаимодействует со светом и переходит на нижний колебательный подуровень. В этом случае энергия рассеянного света будет больше, чем у возбуждающего (зеленый → синий).
В результате поэтапного рассеяния света становится возможным полноценный многоуровневый спектральный анализ информации об объекте изучения.
Главными достоинствами рамановской спектроскопии являются отсутствие пробоподготовки и малые количества объекта исследования. Метод позволяет бесконтактно получать уникальную информацию о конформации и микроокружении молекул живых клеток. К недостаткам метода можно отнести высокую стоимость оборудования, которая компенсируется при длительном постоянном применении за счет отсутствия расхода на дополнительные реактивы (например, органические растворители), а также проблему низкой интенсивности сигнала, который можно усилить различными усовершенствованными моделями.
Первым способом для усиления сигнала является резонансная частота возбуждения RR, интенсивность которой на несколько порядков превышает обычное комбинационное рассеяние.
Второй способ представляет собой комбинационное рассеяние с оптическим пинцетом (RSOT — Raman Spectroscopy Optical Tweezers), которое способствует повышению интенсивности рамановской спектроскопии за счет увеличения времени накопления сигнала от мономолекул или клеток в растворе, при этом не осаждая и не фиксируя их.
Третьим способом является когерентное антистоксовое рассеяние света (Coherent anti-stokes Raman scattering, CARS). На спектрах КАРС намного удобнее различать расположенные вблизи пики, что особенно важно при изучении структурно схожих биомолекул.
Самым актуальным способом для получения усиленного сигнала является гигантская рамановская спектроскопия или SERS (surface enhanced Raman spectroscopy), которая подразумевает помещение молекулы на поверхность наночастиц благородных металлов и регистрацию комбинационного рассеяния обычным способом [5, 6].
Рамановские спектрометры способны получать спектры двумя технологиями: рамановская спектроскопия с дисперсионной системой и с преобразованием Фурье. Каждая из методик имеет индивидуальные преимущества и подходит для выполнения особых задач. Но наиболее часто для исследования объектов, обладающих способностью к флуоресценции, используется спектроскопия Фурье—Рамана [7]. При флуоресценции происходит сильное излучение образца, которое в несколько раз превосходит рамановский сигнал, при этом даже малое ее проявление может перекрывать исследуемый комбинационный импульс. С большим успехом рамановская спектроскопия с преобразованием Фурье применяется в фармацевтических целях для идентификации неизвестных веществ, анализа сырья, качественного и количественного контроля готовой продукции, а также для исследования полиморфизма, изучения образцов в массе или на поверхности в комбинаторной химии и имеет ряд преимуществ по сравнению с дисперсионной версией, так как эти продукты часто проявляют флуоресценцию при возбуждении лазером 785 нм.
Одним из первых применений спектроскопии комбинационного рассеяния было изучение белков. Целью большинства исследований является изучение структуры молекул и установление функциональных групп, определяющих их биохимическую активность [8]. Из обычного комбинационного спектра белка можно получить информацию о его структурных характеристиках. Одновременно с исследованием белков проводилось изучение нуклеиновых кислот. Первый такой спектр ДНК был получен в 1968 г. Метод активно используется в сфере офтальмологии, а именно в изучении хрусталиков глаза животных и человека. Благодаря этому появляется возможность ранней диагностики серьезных и массовых заболеваний, таких как катаракта.
Использование комбинационного рассеяния в биомедицинских целях позволяет определить структуру биологических молекул, что способствует получению информации о метаболизме возбудителей инфекций [9]. В ходе исследований было выявлено, что основные частотные характеристики являются специфичными для различных микроорганизмов и функциональных групп внутриклеточных молекул, создавая таким образом точный «отпечаток пальцев», который способен выявлять внутренний «фенотипический профиль» одиночных клеток, экспрессию генов, характерные субклеточные структуры и включения, физиологические состояния или изменения метаболизма [10, 11].
Комбинационное рассеяние нашло свое применение в дерматологии, так как является высокоточным автоматизированным методом визуализации и диагностики как доброкачественных (пигментный невус, себорейный кератоз), так и злокачественных новообразований (меланома и базальноклеточный рак) [12].
Методика рамановской спектроскопии получила свое обширное применение и в стоматологии, а именно в исследованиях, посвященных изменениям структуры твердых тканей зубов при кариозных и некариозных поражениях, а также при заболеваниях пародонта и слизистой оболочки полости рта под влиянием различных факторов [13—16].
На рамановских спектрах твердых тканей зубов и структуры костей [17, 18] фиксируются молекулярные и ионные колебания минеральных соединений, таких как фосфат, карбонат и гидрофосфат ионы, а также многочисленные волны от коллагеновой матрицы [19—22].
Линия симметричного валентного колебания РО43– (ν1) (фосфаты) является самой интенсивной в спектре минерализованной ткани. Ее особенность заключается в высокой чувствительности к минеральному окружению: частота и форма зависят от локального пространства и могут деформироваться вследствие ионных замещений и изменения степени кристалличности. Так, в измененном карбонатапатите B-типа фосфатная линия ν1 проявляется в диапазоне 955—959 см–1, в кристаллическом незамещенном гидроксиапатите линия ν1 сдвигается в область 962—964 см–1. Линия с частотой 945—950 см–1 позволяет определить наличие разупорядоченной фосфатной решетки апатита, причем происходит ли это вследствие замещений A-типа или из-за присутствия аморфного фосфата кальция до конца не выяснен. Согласно исследованиям, в интактной эмали человека в области колебания (ν1) PO4 была обнаружена линия с частотой 972 см–1, обусловленная присутствием β-трикальцийфосфата (β-Ca3(PO4)2). В норме в тканях зубов полоса фосфата ν1 является наложением всех составляющих, обычно она имеет несимметричную форму из-за вклада колебаний разупорядоченного фосфата, карбонат-замещенного, высококристаллического незамещенного гидроксиапатита, β-трикальцийфосфата [19].
Спектральные изменения при разных стоматологических заболеваниях имеют свои особенности, что позволяет дифференцировать их с помощью рамановской спектроскопии. Так, при кариесе рамновская спектроскопия выявила снижение концентрация фосфат-ионов вследствие их замещения карбонат-ионами [23].
D. Goloshchapov и соавт. провели микроспектроскопические исследования развития кариеса и фазового образования в тканях дентина [24], выявив, что высокоинтенсивные моды колебаний, возникающие при использовании рамановской спектроскопии, относятся к аминокислотам ДНК/РНК микроорганизмов. Этот факт подтверждается наличием полос порфиринов в спектре лазерно-индуцированной люминесценции, которые представляют собой продукты их биологической активности. Данные исследования могут быть использованы для разработки методов раннего скрининга в диагностике кариеса дентина.
Этот же авторский коллектив исследовал в биомиметических материалах взаимодействие нестехиометрического нанокристаллического карбонатзамещенного гидроксиапатита с полярными аминокислотами с целью восполнения данным материалом удаленных тканей зубов в процессе лечения [25]. В ходе работы авторы выявили, что образование связи между полярными аминокислотами и нанокристаллическим гидроксиапатитом зависит от типа дефекта в кристаллической решетке и наличия посторонних ионов в биокомпозите.
Комбинационное рассеяние также используют при изучении состояния твердых тканей зубов на фоне заболеваний пародонта.
При пародонтите, помимо изменения амплитуды интенсивности линии минеральной составляющей зуба 956 см–1 (PO43– (ν1) (фосфаты)), также происходит ее преобразование и в органической составляющей 1664 см–1 (Amide I), 1242 (Amide III) и 1446 см–1 (Lipids and proteins) [26]. Диагностирование спектральных изменений в эмали зубов, а также разработанный авторами алгоритм ее верифицирования с изменениями при пародонтите позволяет идентифицировать пациентов с группой риска и проводить коррекцию их лечения.
Рамановская спектроскопия используется для раннего обнаружения и отслеживания изменений структуры дентина [27—30]. При разработке модели кариеса дентина выяснилось, что схожие с кариесом изменения достигаются при воздействии на дентин кислых растворов дольше 6 ч, при этом последовательная обработка искусственной слюной не способствует восстановлению его структурной организации. Однако при краткосрочном воздействии кислой среды возможно частичное или полное восстановление структуры дентина в течение одной недели.
Благодаря особенностям технологии рамановская спектроскопия позволяет изучать орган на микроуровне. Так, метод используют для лучшей дифференцировки различных популяций стволовых клеток зуба [31]. Целью работы была сравнительная характеристика стволовых клеток, происходящих из различных тканей зубов (апикальный сосочек, зубной фолликул и пульпа). В результате работы авторы пришли к выводу, что дифференцировка трех типов клеток возможна по соотношению между белками и нуклеиновыми кислотами.
Сравнительный анализ уровня сиаловой кислоты в слюне среди пациентов с пародонтитом, гингивитом и не имеющих этих заболеваний, проведенный с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света с усилением поверхности SERS, способной обнаруживать чрезвычайно низкие концентрации молекул, выявил, что у пациентов с пародонтитом содержание сиаловой кислоты выше, чем у пациентов с гингивитом и лиц без заболеваний пародонта [32].
Рамановская спектроскопия используется в качестве неинвазивного метода при диагностическом скрининге рака полости рта [33—36]. Исследования показали, что вариации белков, аминокислот и бета-каротина являются основными маркерами онкологического процесса в полости рта.
Использовали рамановскую спектроскопию и с целью оценки in vivo влияния лучевой терапии на изменение структуры дентина зубов [37—39]. После облучения прослеживался обмен фосфат-карбонат-ионами в гидроксиапатите дентина зубов и была обнаружена более высокая концентрация органических компонентов. Зубы у пациентов, проходивших химиотерапию, имеют нарушения минерализации, деминерализацию эмали, снижение степени кристалличности апатитов и структурные отличия разных зон на поверхности шлифов. Таким методом было выявлено, что пациенты, проходящие лучевую терапию головы и шеи, подвержены повышенному риску возникновения кариеса не только из-за изменения слюны, диеты и микробиологии, но и в результате изменения структуры дентина зуба.
С помощью рамановской спектроскопии были изучены особенности минерализации гидроксиапатита эмали на начальных стадиях развития флюороза [40]. В ходе работы авторы установили особенности минерализации апатита эмали на начальных этапах развития патологии.
В последние годы стало актуальным использование офисных и домашних систем отбеливания зубов, результат которых соответствует эстетическим требованиям пациента и способствует получению белоснежной улыбки. Однако в отбеливающих системах используется перекись водорода, которая в высоких концентрациях может оказывать неблагоприятное воздействие на состав и структуру зубов.
Рамановская спектроскопия способна оценить динамику изменений содержания фторидов и кальция в эмали зубов, подвергшейся воздействию высоких концентраций перекиси водорода. [41]. Кальций или фторид, добавленные к высококонцентрированным отбеливающим агентам, способствуют увеличению содержания фосфатов и карбонатов в эмали зубов. Тем не менее действие агентов не смогли полностью устранить потерю микроэлементов, вызванную отбеливанием зубов [42].
Перекись карбамида широко используется в качестве отбеливающего агента в средствах для домашнего отбеливания зубов. O. Redha и соавт. [43] оценивали влияние 5 и 10% перекиси карбамида на структурную организацию коллагена, находящегося в дентине, и его химические свойства. В результате исследования было выявлено, что даже при воздействии низких концентраций перекиси карбамида происходит нарушение четвертичной структуры молекул коллагена [44].
Таким образом, рамановская спектроскопия в последние 5—10 лет получила большое распространение в медицине, привлекая внимание специалистов различного профиля. Данный метод является аналитическим инструментом при диагностике различных заболеваний, облегчая процесс непосредственного измерения в твердых и жидких средах, не требует специальной подготовки образцов и не обладает чувствительностью к полосам поглощения. Использование спектроскопии комбинационного рассеяния в стоматологии позволяет проводить диагностику и сравнительный анализ изменений твердых тканей зубов, а также слизистой оболочки полости рта, что способствует повышению безопасности и рационализации лечения с последующей профилактикой нежелательных осложнений до и после проведения различных манипуляций.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interests.