Термические ожоги — один из наиболее частых видов травмы. По данным ВОЗ, в технически развитых странах ожоговый шок составляет от 5 до 10% всех видов насильственной смерти [1]. Смертность от ожоговой травмы (ОТ) за последние годы имеет тенденцию к увеличению. Во всем мире от воздействия высокой температуры ежегодно погибают от 60 000 до 80 000 человек, причем 90% — это случаи гибели лиц пожилого и преклонного возраста [2]. Согласно отчетным данным сводных территориальных бюро судебно-медицинской экспертизы, в Российской Федерации на данный вид смерти приходится около 1% всех судебно-медицинских вскрытий. Если О.Т. не привела к смерти на месте происшествия, то в организме пострадавшего морфологические изменения развиваются в определенной патогенетической последовательности. Совокупность этих признаков называется патоморфологией ожоговой болезни. Состояние центральной нервной системы (ЦНС) играет ключевую роль в реализации всех процессов жизнедеятельности. Следовательно, попытка установления критериев прижизненности и давности ОТ на основе изучения морфологических изменений ЦНС при данном патологическом состоянии является актуальной [3—10]. Это обусловливает важность разработки новых методик, расширяющих возможность экспертной оценки ОТ.

Цель исследования — разработка дополнительных судебно-медицинских критериев диагностики прижизненности и давности ОТ по морфологическим изменениям коры мозжечка.

Исследовали состояние коры мозжечка в период от 0 до 72 ч с момента возникновения О.Т. Использовали рутинное гистологическое окрашивание гематоксилином и эозином и по Нисслю вместе с иммуногистохимической реакцией (ИГХ-реакция) с антителами к глиальному фибриллярному кислому протеину (GFAP — glial fibrillar acid protein).

Основную группу наблюдений с ОТ составили 82 случая гибели 63 мужчин и 19 женщин 20—65 лет (средний возраст 35,1 года) от ожогов пламенем II—III а, б степени. В 54 случаях смерть наступила на месте происшествия (у 14 мужчин и одной женщины установлена острая алкогольная интоксикация, соответствующая легкой и средней степени алкогольного опьянения). Группа сравнения включала 74 случая отравления монооксидом углерода со смертельным исходом: 60 мужчин и 14 женщин в возрасте 18—62 лет (средний возраст 34,7 года). Контрольная группа — трупы 38 погибших от колото-резаной травмы груди с повреждением сердца или крупных артерий (смерть на месте происшествия). Вскрытие провели через 5—48 ч после наступления смерти.

Во всех случаях провели гистологическое исследование тканей внутренних органов: исследовали головной мозг, сердце, слизистую оболочку надгортанника и трахеи, легкие, печень, почки, селезенку, поджелудочную железу, матку, надпочечники, кожу из области ожогов. Непосредственно перед фиксацией ткани вырезали в виде кусочков размером 0,5×1,0×1,5 см, помещали в 10% раствор формалина на 1 сут. Гистологические препараты готовили путем заливки кусочков внутренних органов в парафин с последующим изготовлением срезов толщиной в 5—7 мкм, и окраской гематоксилином и эозином и по Нисслю (головной мозг, в том числе мозжечок). Для ИГХ-исследования на наличие anti-GFAP антител из парафиновых блоков с фрагментами мозжечка изготовили стандартизованные срезы толщиной 5±1 мкм. Депарафинизированные и регидратированные срезы отмывали в солевом фосфатном буфере в течение 5 мин, помещали в TWEEN-20 на 20 мин и инкубировали в 3% козьей плазме 30 мин. Затем проводили реакцию с первичным антителом анти-GFAP («SIGMA Chemical», Япония) в разведении 1:200 в течение 12 ч. После инкубации производили тройную отмывку в солевом фосфатном буфере по 5 мин. Инкубацию с вторичными антителами (авидинбиотин-конъюгированный козий анти-кроличий IgG) в разведении 1:200 в растворе для разведения антител выполняли в течение 45 мин. Визуализацию антител — в течение 2—5 мин с хромогенным 3,3-диаминобензидином. При дополнительном окрашивании применяли крезиловый фиолетовый. Далее препараты обезвоживали в батарее спиртов, просветляли в ксилоле, заключали в бальзам под покровные стекла. Морфологическую визуализацию изменений осуществляли на оптическом микроскопе, адаптированном с компьютерной системой анализа изображений (cellSens, «Олимп», Япония). Статистический анализ проводили с использованием методов Фридмана, Вилкоксона и Манна—Уитни. Для вычисления использовали программу Statistica, версия 10 («StatSoft Inc», 2011, www.statsoft.com). Значимым уровнем достоверности считалось p<0,05.

Микроскопическая картина коры мозжечка: просвет мелких артерий незначительно расширен с очагами спазма. Мелкие артериолы в большинстве полей зрения со спавшимися стенками. Периваскулярные пространства этих сосудов не расширены. В капиллярах — неравномерное кровенаполнение с преобладанием малокровия, участки стаза и сладжирования эритроцитов. Зафиксировали зоны со щелевидным увеличением перикапиллярных пространств на незначительных промежутках. В венах на протяжении определяются участки расширения просвета, в ряде полей зрения — сладжирование эритроцитов в просветах сосудов. Неравномерное набухание стенок и периваскулярное расширение пространств в одиночных полях зрения.

В белом веществе наблюдали незначительное набухание проводящих волокон. В молекулярном слое едва различимо набухание корзинчатых нейронов и протоплазматических астроцитов, в ганглионарном слое — слабо выраженное набухание одиночных астроцитов, клеток Пуркинье без потери отростков и клеточных выпадений, в зернистом слое – сохранность гистоархитектоники. Глиальные клетки однородно расположены по срезу. В единичных клетках мелкой глии — незначительное расширение перицеллюлярных пространств.

При гибели от ОТ на месте происшествия отмечали пигментацию и липоидоз нервных клеток. Определяли единичные клетки в состоянии сморщивания, тигролиза и «клетки-тени», мелкие клеточные выпадения.

При сочетании ОТ и отравления монооксидом углерода, если в крови содержалось от 20% и более карбоксигемоглобина, при гистологическом исследовании в просвете расширенных капилляров выявляли сладж эритроцитов, неравномерно выраженное расширение периваскулярных и перицеллюлярных пространств. В белом веществе мозга определяли расширенные венулы, содержащие эритроциты, которые были видны в единичных полях зрения в периваскулярных пространствах.

Морфологическая картина при обнаружении в крови трупов этилового спирта в концентрации, соответствующей алкогольному опьянению средней степени (относительно живых лиц), имела несколько иной вид. В белом веществе мозжечка наблюдали мелкие участки с периваскулярным расположением эритроцитов. Нарастание числа эритроцитов вокруг сосудов сочеталось с резким полнокровием артериол. Отличительная особенность сосудистого русла – полнокровие капилляров в большинстве полей зрения. В расширенных венулах эритроциты выглядели компактно.

Иммуногистохимическая реакция с антителами к GFAP: положительно окрашенные клетки расположены в зернистом слое и между корзинчатыми нейронами, отростки астроцитов имели значительное ветвление и хорошо прокрашивались во всех слоях коры мозжечка, незначительно отличались от таковых в контрольной группе (рис. 1).

Светооптическая микроскопия погибших от ожогового шока через 2—3 ч после ОТ: неравномерно выраженное расслоение соединительнотканных элементов мягкой мозговой оболочки; распространенное расширение периваскулярных пространств, преимущественно в белом веществе и II слое коры. Отмешивание плазмы в просветах венул, одиночные эритроциты за пределами стенок сосудов в белом веществе и среди элементов мягкой мозговой оболочки. В коре мозжечка — клетки с незначительно сниженным содержанием вещества Ниссля.

Через 4—6 ч после причинения ОТ определялись изменения грушевидных нейронов по типу острого набухания. В веществе мозга отсутствовали расширения периваскулярных пространств, артериолы приобретали волнообразный вид. В просветах артериол — малочисленные эритроциты. Капилляры на всем протяжении сужены, венулы очагово расширены и переполнены форменными элементами крови с мелкоочаговым отмешиванием фибриновых нитей, вокруг не было оптически пустых пространств. Наблюдали уплощение эндотелиальных клеток в стенках сосудов, набухание одиночных периадвентициальных клеток. В периваскулярной глии — расширение перицеллюлярных пространств.

Иммуногистохимическая реакция с антителами к GFAP: положительно окрашенные клетки имели фрагментированные отростки с потерей ветвления уже через 4 ч с момента возникновения ОТ (рис. 2).

К концу 1-х суток в цитоплазме одиночных нейронов обнаруживали крупные и мелкие вакуоли, что является признаком тяжелой дистрофии; одиночные нейроны с признаками гиперхроматоза и кариопикноза, отражающие всю глубину и тяжесть деструктивного процесса с нарастанием периваскулярных геморрагий в белом веществе.

Микроскопическая картина: белое вещество набухшее. В глиальных клетках молекулярного слоя наблюдали некробиотический процесс и спонгиоз белого вещества, вакуолизацию. Расширение перицеллюлярных пространств у клеток мелкой глии, корзинчатых нейронов и протоплазматических астроцитов. Через 12 ч отмечали вакуолизацию с гиперхроматозом клеток молекулярного слоя.

В ганглионарном слое — умеренное набухание клеток Пуркинье без потери отростков и клеточных выпадений, набухание единичных астроцитов. Заметны зоны с резко набухшими отростками, чередующимися с участками без набухших отростков. Через 12 ч после ОТ отметили резкое набухание клеток Пуркинье с кариолизисом одиночных нейронов. Уменьшилось число ядрышковых организаторов в цитоплазме астроцитов II слоя. В единичных астроцитах этого слоя — признаки фрагментации. В данном временнóм интервале ОТ установили статистически достоверное (p<0,05) снижение выражености ИГХ-реакции с GFAP по сравнению с контрольной группой наблюдений. Дополнительно зафиксировали начальную пролиферацию астроцитов во II слое коры, сочетающуюся с очаговой положительной ИГХ-реакцией с GFAP (рис. 3).

К началу 2-х суток при окраске по Нисслю нейроны коры мозжечка имели различную степень базофилии: среди них постоянно определялись светлые и темные клетки. В поле зрения светового микроскопа сравнительно крупные светлые клетки имели большое, круглое, набухшее светлое ядро; цитоплазма их слабобазофильная. Вещество Ниссля по своей структуре мелкодисперсное, состоящее из небольшого количества глыбок.

Нейроны имели округлое или неправильной формы ядро с расположенным в центре ядрышком. В цитоплазме — диффузная базофилия. В зернистом слое при иммуногистохимическом исследовании определили нарастание фрагментации отростков глиальных клеток и клеточными выпадениями.

Через 3 сут в головном мозге наблюдали более выраженные изменения. Нарастал периваскулярный и перицеллюлярный отек, прогрессировали изменения нейронов в коре мозжечка. Основным признаком тяжелого изменения нервных клеток в этот период явилось грубое нарушение структуры всех основных элементов клетки: цитоплазмы, ядра и ядрышка. В эти сроки чаще встречались клетки, которые приобретали неправильную форму и нечеткие контуры, их отростки истончались, вокруг клеток образовывался светлый поясок. Ядра и ядрышки ряда клеток нельзя было различить. В клетках мелкой глии, корзинчатых нейронах и протоплазматических астроцитах — значительное расширение перицеллюлярных пространств.

В коре мозжечка отмечали резкое полнокровие венозного русла без выхода эритроцитов в периваскулярные пространства. В артериях — парез стенок с незначительным слабовыраженным набуханием эндотелиальных клеток. Наблюдали очаги с незначительным волнообразным ходом стенок сосудов; периваскулярное расширение пространств. В ряде полей зрения выявили отмешивание плазмы в просветах сосудов. Имелись очаги малокровия капилляров. В белом веществе на фоне выраженного набухания с участками фрагментации нейропиля обнаружили лейкостазы без лейкодиапедеза.

В ганглионарном слое — выраженное набухание клеток Пуркинье с распространенной потерей отростков астроцитов. Наблюдали клеточные выпадения, зоны с резко набухшими отростками. В зернистом слое выявили вакуолизацию цитоплазмы отдельных клеток в ряде полей зрения. Отметили фокальные некрозы отдельных нейронов. Через 25—72 ч с момента ОТ общая ИГХ-реакция с GFAP в коре мозжечка по сравнению с контрольной группой наблюдений характеризовалась как отрицательная (рис. 4).

При смерти в острый период ОТ в коре мозжечка гистологически может быть определен характерный комплекс признаков: острое набухание нейронов, нарастание периваскулярного расширения пространств, перицеллюлярное расширение пространств и гипероксифилия микроглии. Указанные морфологические признаки могут обусловить «ишемические» изменения нейронов: сокращение просвета капилляров приводит к расширению периваскулярных пространств с наличием в них оксифильной жидкости, что в дальнейшем способствует развитию так называемого периваскулярного отека головного мозга, вызванного тканевой гипоксией. Астроциты II—III слоев коры не устойчивы к тканевой гипоксии, что может быть отражено в ИГХ-реакции с антителами к GFAP. Результаты оценки кровоснабжения коры полушарий большого мозга с использованием иммуногистохимического изучения позитивно окрашенных с антителами к GFAP астроцитами могут быть использованы в качестве дополнительных критериев для установления прижизненности и давности причинения О.Т. Полученные данные могут быть применены в практической судебно-медицинской деятельности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2e-mail:mrzv66@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0594-257X