Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Бабкина А.С.

Кафедра судебной медицины Медицинского института Российского университета дружбы народов, Москва, Россия, 117198;
Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии, Москва, Россия, 107031

Сундуков Д.В.

Голубев А.М.

Кафедра судебной медицины Медицинского института Российского университета дружбы народов, Москва, Россия, 117198;
Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии, Москва, Россия, 107031

Рыжков И.А.

ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии», 107031, Москва, Россия

Цоколаева З.И.

Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии, Москва, Россия, 107031

Заржецкий Ю.В.

ФГБНУ «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии», 107031, Москва, Россия

Определение интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце крысы в зависимости от давности наступления смерти

Авторы:

Бабкина А.С., Сундуков Д.В., Голубев А.М., Рыжков И.А., Цоколаева З.И., Заржецкий Ю.В.

Подробнее об авторах

Просмотров: 2302

Загрузок: 76


Как цитировать:

Бабкина А.С., Сундуков Д.В., Голубев А.М., Рыжков И.А., Цоколаева З.И., Заржецкий Ю.В. Определение интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце крысы в зависимости от давности наступления смерти. Судебно-медицинская экспертиза. 2020;63(1):31‑35.
Babkina AS, Sundukov DV, Golubev AM, Ryzhkov IA, Tsokolaeva ZI, Zarzhetsky YuV. Determination of the fluorescence intensity of coenzymes NADH and FAD in the skeletal muscle of the rat depending on the post-mortem interval. Forensic Medical Expertise. 2020;63(1):31‑35. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/sudmed20206301131

Рекомендуем статьи по данной теме:
К воп­ро­су изу­че­ния ди­на­ми­ки пос­тмор­таль­ных из­ме­не­ний тка­ней по дан­ным им­пе­дан­со­мет­рии. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2023;(6):24-27
Ран­няя не­ин­ва­зив­ная экспресс-ди­аг­нос­ти­ка ба­заль­но-кле­точ­ной кар­ци­но­мы ко­жи го­ло­вы и шеи для по­вы­ше­ния ка­чес­тва ор­га­ни­за­ции он­ко­ло­ги­чес­кой по­мо­щи. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2023;(11):29-33

Проблема определения давности наступления смерти, возникшая на первых этапах становления судебно-медицинской танатологии, не потеряла своей актуальности и в настоящее время. Многочисленные исследования, проводимые с целью усовершенствования диагностики давности наступления смерти, не внесли значимых изменений в экспертную практику. Уже более 150 лет для решения вопроса давности наступления смерти используется термометрический метод в сочетании с исследованием трупных изменений [1]. Следственные органы заинтересованы в максимальной объективности и точности экспертных выводов по вопросу о давности наступления смерти, а также в правовой, медицинской, биологической значимости данного вопроса. В связи с этим необходимо тщательное изучение механизмов и закономерностей процессов посмертного периода с применением современных методов, используемых в медицине и смежных с ней науках. Г.В. Шор в монографии «О смерти человека (введение в танатологию)» высказал «пожелание, чтобы к разработке танатологической проблемы приступили представители различных научных дисциплин, т.к. только полигранная разработка этих вопросов сможет внести ясность в учение о смерти» [2]. Написанное Г.В. Шором в 1925 г. как нельзя лучше обозначает направление развития современной судебно-медицинской танатологии.

Одним из примеров «полигранной» разработки критериев для более точного определения давности наступления смерти является применение биофизических методов, широко используемых в исследовательских работах с конца 60-х годов. Электронный парамагнитный резонанс, хемилюминесценция, спектрофотометрия, электропровод-ность, комплексная относительная диэлектрическая проницаемость позволили исследователям выявить зависимые от давности наступления смерти изменения окислительно-восстановительных процессов в тканях и показать возможность применения данных методов для определения сроков посмертного периода [3—5]. Биофизические методы в судебной медицине также применяются для определения давности и прижизненности травмы, диагностики причин скоропостижной смерти [3, 6, 7].

Одно из перспективных направлений, на наш взгляд, — изучение окислительно-восстановительных процессов в различные сроки посмертного периода на основании исследования коферментов НАДН и ФАД методом лазерно-индуцированной флуоресцентной спектроскопии. Коферменты НАДН и ФАД участвуют в широком спектре внутриклеточных окислительно-восстановительных реакций. Они выполняют ключевую роль в реакциях образования АТФ, являясь донорами и акцепторами электронов [8]. НАДН локализован в митохондриях и участвует пре-имущественно в энергетическом обмене клетки. ФАД, находясь в митохондриях и цитозоле клеток, задействован не только в процессе окислительного фосфорилирования, но и принимает участие в аскорбатглутатионовом и пентозофосфатном циклах, антиоксидантных реакциях, синтезе ацетилкоэнзима А, липогенезе, утилизации глутатиона, перекисном окислении липидов [9, 10]. Способность данных коферментов к аутофлуоресценции в ультрафиолетовом и синем спектрах обусловливает их диагностическую значимость, заключающуюся в возможности анализа тканевого метаболизма на основании изменений интенсивности флуоресценции, что нашло применение в клинических исследованиях [11, 12].

Явление флуоресценции молекул НАДН и ФАД основано на испускании возбужденными молекулами нетепловых квантов света под воздействием излучения ультрафиолетового и синего спектров соответственно. Регистрация длин волн испускаемых квантов света при зондировании ткани лазерным излучением является основой флуоресцентной спектроскопии [13, 14].

Цель исследования — выявить закономерности изменения интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце крысы в первые сутки после наступления смерти.

Материал и методы

Эксперимент проводили на крысах самках и самцах (n=20) линии Sprague Dawley массой тела 250—300 г в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Протокол эксперимента одобрен локальным биоэтическим комитетом ФНКЦ Р.Р. Эвтаназию животных осуществляли цервикальной дислокацией под общей анестезией хлоралгидратом. Перед экспериментом животных содержали в одинаковых условиях. Выделили 4 группы по 5 животных в каждой. Интенсивность флуоресценции коферментов НАДН и ФАД и редокс-отношение (НАДН/ФАД) — РО регистрировали при жизни под общей анестезией, через 5 мин после смерти и каждые 1,5 ч в течение первых суток посмертного периода.

В 1-й группе измерения проводили при жизни под общей анестезией, через 5 мин после смерти, каждые 1,5 ч в течение 6 ч посмертного периода; во 2-й группе — каждые 1,5 ч с 7,5 до 12 ч; в 3-й группе — каждые 1,5 ч с 13,5 до 18 ч; в 4-й группе — каждые 1,5 ч с 19,5 до 24 ч.

Трупы животных в период проведения эксперимента находились при комнатной температуре. Для оценки интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД использовали лазерный диагностический аппарат Лазма МЦ-3 (№ РЗН 2015/3142 от 29.10.2015; ООО НПП «Лазма», Россия) с зондирующем излучением и длиной волны 365 нм (UV) и 450 нм (B).

Доступ к мышце бедра крысы — через разрез кожи длиной 1 см, волоконно-оптический зонд анализатора коферментов устанавливали на участок поверхности скелетной мышцы. Измерение показателей проводили в течение 4 мин у каждого животного.

Показатели фиксировали и сохраняли в ПК с программным обеспечением к аппарату Лазма МЦ-3. Статистический анализ осуществляли непараметрическим методом (U-test Mann—Whitney) с помощью пакета статистических программ Statistica 6. Различия принимали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

С 5-й минуты посмертного периода до 3 ч наблюдали постепенное возрастание интенсивности флуоресценции НАДН. Максимальные значения интенсивности флуоресценции НАДН зафиксировали через 3 ч после наступления смерти. Постепенное снижение интенсивности флуоресценции НАДН зарегистрировали с 4,5 до 24 ч посмертного периода (рис. 1).

Рис. 1. Изменение интенсивности флуоресценции НАДН в различные сроки посмертного периода.
При сравнении показателей в группах статистически достоверными оказались различия между прижизненными значениями и на 5-й минуте после смерти; величиной показателя в 3 и 4,5 ч; 4,5 и 6 ч посмертного периода.

Полученные результаты можно объяснить механизмами окислительного метаболизма при дефиците кислорода. В условиях аноксии в клетке запускаются реакции анаэробного гликолиза, в результате которого НАД+ восстанавливается до НАДН с образованием пирувата и АТФ [10, 15]. Увеличение интенсивности его флуоресценции происходит вследствие накопления НАДН, окисление которого становится невозможным из-за отсутствия кислорода. Основной вклад в флуоресценцию вносит связанная с белками форма НАДН, локализованная в митохондриях [16]. В связи с этим уровень интенсивности флуоресценции снижается после 3 ч, согласно нашим предположениям, за счет раз-общения связи кофермента с белками в результате активизации протеолитических ферментов.

Значения коэффициентов интенсивности флуоресценции ФАД в первые 4,5 ч менялись незначительно. Через 5 ч после смерти зарегистрировали их снижение. Возрастание величины коэффициентов флуоресценции ФАД отметили с 9 ч посмертного периода (рис. 2),

Рис. 2. Изменение интенсивности флуоресценции ФАД в различные сроки посмертного периода.
а максимальные значения — через 24 ч после наступления смерти. Статистически достоверные различия при сравнении показателей в группах были между значениями показателя в 4,5 и 6 ч, 22,5 и 24 ч посмертного периода.

Известно, что ФАД находится внутри электрон-транспортного флавопротеина, а при высвобождении из него флуоресцирует в разы интенсивнее [16, 17]. В данном случае можно предположить, что зафиксированное увеличение интенсивности флуоресценции ФАД через 24 ч после смерти связано с распадом флавопротеина под действием протеолитических ферментов в процессе аутолиза.

Возрастание отношения коэффициентов флуоресценции НАДН к ФАД — редокс-отношение (РО) регистрировали с 5-й минуты до 3 ч посмертного периода включительно. С 4,5 и до 24 ч наблюдали постепенное снижение РО (рис. 3).

Рис. 3. Изменение редокс-отношения в различные сроки посмертного периода.
Статистически достоверные различия при сравнении показателей в группах выявили между прижизненными значениями показателей и на 5-й минуте после смерти; на 5-й минуте и через 1,5 ч; через 3 и 4,5 ч после смерти.

Отметили также, что РО>1 в первые 9 ч после смерти, а в интервале 9—24 ч РО<1.

Заключение

В представленном исследовании наиболее показательными результатами являются резкое возрастание флуоресценции НАДН к 3 ч посмертного периода и постепенное ее снижение к концу первых суток; преобладание флуоресценции НАДН над ФАД до 9 ч посмертного периода, а также значимое возрастание флуоресценции ФАД к концу первых суток. Выявленная тенденция изменения интенсивности флуоресценции коферментов НАДН и ФАД в скелетной мышце экспериментальных животных в течение первых суток посмертного периода позволяет рассматривать этот показатель в качестве потенциального критерия определения давности наступления смерти. Очевидна необходимость проведения данного исследования на трупах людей.

На флуоресцентную активность коферментов в тканях трупа, возможно, влияют условия окружающей среды и вид смерти. Следовательно, необходимы последующие исследования для оценки влияния данных факторов на этот показатель.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail



Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.